Açıq Hv1 proton kanalının bölmələrarası interfeysinin allosterik birləşmiş zond ilə sorğulanması

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS üçün məhdud dəstək var. Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyi) tövsiyə edirik. Bu arada əmin olmaq üçün davamlı dəstək, biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstərəcəyik. Hv1 gərginlikli proton kanalı iki gərginlik algılayıcı domendən (VSD) ibarət dimerik kompleksdir və onların hər birində qapalı proton keçirmə yolu var. hər iki VSD-də açıq vəziyyətin birgə baş verdiyi məlumdur; lakin əsas mexanizmlər haqqında çox az şey məlumdur. Birliklərarası interfeyslər allosterik proseslərdə əsas rol oynayır; lakin, belə interfeyslər açıq Hv1 kanallarında müəyyən edilməmişdir. Burada biz nümayiş etdiririk ki, 2-guanidinotiyazol törəmələri iki Hv1 VSD-ni kooperativ şəkildə bloklayır və bu birləşmələrdən birini açıq subunitlər arasında allosterik birləşmə üçün zond kimi istifadə edirlər. Biz aşkar edirik ki, hüceyrədənkənar VSD-nin birinci transmembran fraqmentinin ucu bağlama yerləri arasında birləşməyə vasitəçilik edən alt bölmələr arası interfeys təşkil edir, halbuki qıvrılmış rulon domeni bu prosesdə birbaşa iştirak etmir. Biz həmçinin kanalın proton-selektiv filtrinin bloker-bağlayıcı kooperativliyi idarə etdiyinə dair güclü sübutlar tapdıq. . Gərginlik qapalı proton kanalları fitoplanktondan insanlara qədər müxtəlif orqanizmlərdə mühüm rol oynayır1. Əksər hüceyrələrdə bu kanallar proton membranından proton axınına vasitəçilik edir və NADPH oksidazın fəaliyyətini tənzimləyir. İnsanlarda yeganə məlum olan gərginliyə bağlı proton kanalı HVCN1 geninin2,3 məhsulu olan Hv1-dir. Hv1 (aka VSOP) B hüceyrələrinin çoxalmasında4, fitri immun sistemi tərəfindən reaktiv oksigen növlərinin istehsalında5,6,7,8, sperma hüceyrəsində rol oynadığı göstərilmişdir. hərəkətliliyi9 və hava yolu səthi mayesinin pH tənzimlənməsi10. Bu kanal, B-hüceyrəli bədxassəli şişlər4,11 və döş və kolorektal xərçənglər12,13 kimi bir neçə Overexpressed xərçəng növlərində iştirak edir. Həddindən artıq Hv1 fəaliyyətinin xərçəng hüceyrələrinin metastatik potensialını artırdığı aşkar edildi 11, 12 .Beyində Hv1 ifadə edilir. mikroglia tərəfindən və onun fəaliyyətinin işemik insult modellərində beyin zədələnməsini gücləndirdiyi göstərilmişdir. Hv1 zülalında S1-S414 adlanan dörd transmembran seqmentindən ibarət gərginlik hiss edən domen (VSD) var. VSD gərginliyə bağlı Na+, K+ və Ca2+ kanallarının və gərginliyə həssas fosfatazların, məsələn CiVSP-dən olan müvafiq domenlərə bənzəyir. Ciona gutis15. Bu digər zülallarda S4-ün C-terminusu effektor moduluna, məsamə sahəsinə və ya fermentə bağlanır. Hv1-də S4 membranın sitoplazmik tərəfində yerləşən qıvrılmış qıvrım domeninə (CCD) bağlıdır. .Kanal iki VSD-dən ibarət dimerik kompleksdir, hər birində qapalı proton keçirmə yolu var16,17,18. Bu iki Hv1 alt bölməsinin kooperativ şəkildə açıldığı aşkar edilmişdir19,20,21,22, bu, allosterik birləşmənin və alt bölmələr arası qarşılıqlı təsirlərin oynadığını göstərir. qıvrılma prosesində mühüm rol oynayır. Qıvrılmış rulon domenindəki alt bölmələr arasındakı interfeys yaxşı müəyyən edilmişdir, çünki iki təcrid olunmuş domenin kristal strukturları mövcuddur22,23. Digər tərəfdən, membran daxilində VSD-lər arasında interfeys deyil. yaxşı başa düşülür. Hv1-CiVSP kimerik zülalının kristal quruluşu bu interfeys haqqında məlumat vermir, çünki kristallaşmış kanal kompleksinin trimerik təşkili yerli Hv1 CCD-nin maya leysin fermuarı GCN424 ilə əvəz edilməsi nəticəsində yarana bilər. Hv1 kanalının alt bölməsinin təşkili ilə bağlı son araşdırma, iki S4 spiralının ikincil quruluşun ciddi şəkildə pozulması olmadan CCD-yə keçdiyi və nəticədə membrandan başlayan və sitoplazmaya çıxan uzun spiralların meydana gəldiyi qənaətinə gəldi. bu tədqiqat Hv1 VSD-lərinin S4 seqmenti boyunca bir-biri ilə əlaqə saxlamasını təklif edir. Bununla belə, digər tədqiqatlar VSD-lər arasında alternativ interfeyslər təklif etmişdir. Bu interfeyslərə S1 seqmentləri 17, 21, 26 və S2 seqmentinin xarici ucları 21. Münaqişənin mümkün səbəbi bu tədqiqatların nəticələri ondan ibarətdir ki, VSD-lər arasında allosterik birləşmə qapalı və açıq vəziyyətdən asılı olan qapaq prosesi ilə bağlı araşdırılıb və VSD-lər arasındakı interfeys uyğunlaşmada müxtəlif vəziyyət dəyişikliklərində dəyişə bilər. Burada biz tapdıq ki, 2-guanidinotiyazol iki açıq VSD-yə sinergik şəkildə bağlanaraq Hv1 kanallarını inhibə edir və açıq vəziyyətdə subunitlər arasında qarşılıqlı əlaqəni araşdırmaq üçün birləşmələrdən biri, 2-guanidinobenzotiazol (GBTA) istifadə olunur. İnterfeys.Biz aşkar etdik ki, GBTA bağlama əyrisi bir inhibitorun bir alt bölməyə bağlanması bitişik alt bölmənin bağlanma yaxınlığının artması ilə nəticələnən kəmiyyət modeli ilə yaxşı təsvir edilə bilər. Biz həmçinin D112 qalıqlarının, seçicilik filtrlərini aşkar etdik. kanal 27, 28 və bir hissəsi guanidin törəməsi məcburi site 29 nəzarət GBTA məcburi kooperativlik. Biz kooperativ məcburi CCD S4 seqmentindən ayıran Hv1 dimer saxlanılır ki, göstərir ki, CCD ildə intersubunit interfeys birbaşa deyil ki, təklif. GBTA bağlayan yerlər arasında allosterik birləşməyə vasitəçilik edir. Bunun əksinə olaraq, biz S1 fraqmentinin subunitlər arasındakı interfeysin bir hissəsi olduğunu tapırıq və S4 spiralının hüceyrədənkənar ucu ilə dimerin mərkəzindən uzaqda olan bitişik VSD-lərin təşkilini təklif edirik. S1 fraqmentinin açıq vəziyyətdə olması. Hv1-in kiçik molekullu inhibitorları xərçəng əleyhinə dərmanlar və neyroprotektiv agentlər kimi faydalıdır. Bununla belə, bu günə qədər bir neçə birləşmə kanalı inhibə edə bilmişdir30,31,32,33. Onların arasında 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, Şəkil 1-də birləşmə [1]) 1a) və onun törəmələrinin kanal vasitəsilə protonların VSD29,32 keçirməsini maneə törətdiyi aşkar edilmişdir. Belə birləşmələrin bağlanmasının iki açıq subunitdə müstəqil şəkildə baş verdiyi düşünülür. əvvəllər 200 μM konsentrasiyada sınaqdan keçirildikdə Hv1-i demək olar ki, 2GBI kimi effektiv şəkildə inhibə etdiyi göstərilmişdir (Şəkil 1b). Biz digər tiazol törəmələrini araşdırdıq və onlardan bəzilərinin GBTA ilə müqayisədə oxşar və ya daha böyük potensiala malik kanalı inhibə etdiyini aşkar etdik (Şəkil 1 və Əlavələr). mətn).Biz dörd tiazol törəməsinin (GBTA və birləşmələr [3], [6] və [11], Şəkil 1c) konsentrasiyaya cavab əyrilərini təyin etdik və onların 2GBI-dan daha dik olduğunu aşkar etdik. The Hill əmsalları (h) tiazol törəmələrinin sayı 1,109 ± 0,040 ilə 1,306 ± 0,033 arasında dəyişdi (Şəkil 2). 1c və Əlavə Şəkil 1). Əksinə, 2GBI üçün Hill əmsalı 0,975 ± 0,024 29, Şəkil 2a və Əlavə Şəkil 1 idi. 1-dən yuxarı təpə əmsalı bağlayıcı kooperativliyi göstərir. Çünki hər Hv1 alt bölməsinin öz inhibitoru var- bağlanma yeri,29,32 biz əsaslandırdıq ki, tiazol törəməsinin bir alt bölməyə bağlanması ikinci inhibitor molekulunun bitişik alt bölməyə bağlanmasını gücləndirə bilər. GBTA ən yüksək Hill əmsalı olan sınaq birləşməsi idi. Buna görə də biz bu birləşməni seçdik. bağlayıcı sinerji mexanizmini daha da öyrənin və 2GBI-ni istinad mənfi nəzarət kimi istifadə edin. (a) Test birləşmələri: [1] İstinad Hv1 inhibitoru 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-triflorometil-1,3-benzotiazol-2-il) guanidin, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -quanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidin, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol- 2-il)quanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilik turşu etil efiri, [9] 2-guanidino-4-metil Etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10] ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil asetat, [11]1-[4-(4-Xlorofenil)-1,3-tiazol-2-il]quanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]quanidin .(b) Göstərilən guanidinotiyazollar və istinad birləşmə 2GBI (mavi-yaşıl çubuqlar) ilə insan Hv1 aktivliyinin inhibəsi .Hv1 proton cərəyanları -80 mV-dən +120 mV-ə qədər saxlama potensialından depolarizasiyaya cavab olaraq Xenopus oositlərinin içəridən kənar lövhələrində ölçüldü. Hər bir inhibitor vannaya 200 μM.pHi = pHo = 6.0 konsentrasiyada əlavə edildi. .Məlumatlar orta±SEM-dir (n≥4).(c) [2], [3], [6] və [11] birləşmələri ilə insan Hv1-nin konsentrasiyadan asılı inhibisyonu. 15 ölçmə. Xətt, Əlavə Cədvəl 1-də bildirilmiş açıq Kd dəyərlərini əldə etmək üçün istifadə edilən Təpə uyğunluğudur. Təpə əmsalları Əlavə Şəkil 1-də bildirilmiş uyğunluqlardan müəyyən edilmişdir: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h (3) = 1,25 ± 0,07, h (6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (Usullara baxın). (a,b) 2GBI və GBTA birləşmələri konsentrasiyadan asılı olaraq dimerik və monomerik Hv1-i inhibə etdi. Hər bir nöqtə 3-8 ölçmənin orta inhibisyonu ± SD-ni təmsil edir və əyri Hill uyğundur. Hill əmsalları (h) aşağıda göstərilmişdir. daxil edilmiş histoqramlar Əlavə Şəkil 3 və 4-də bildirilmiş uyğunluqlardan müəyyən edilmişdir. (a)-da göstərilən GBTA-nın konsentrasiya reaksiyası Şəkil 1c-dəki ilə eynidir. Görünən Kd dəyərləri üçün Əlavə Cədvəl 1-ə baxın.(c) Modelləşdirmə GBTA-nın dimerik Hv1-ə kooperativ bağlanması. Bərk qara xətt (d)-də göstərilən bağlama modelini təsvir edən tənlik (6) ilə eksperimental məlumatlara uyğunluğu təmsil edir. Sub 1 və Sub 2 etiketli kəsikli xətlər bimolekulyar assosiasiyanı təmsil edir. -müvafiq olaraq birinci və ikinci bağlanma hadisələrinin dissosiasiya tarazlıq əyriləri (Alt 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Hv1 blokunun təklif olunan mexanizminin sxematik diaqramı. GBTA vəziyyətində bir açıq alt bölməyə bağlanma qonşu açıq alt bölmənin yaxınlığını artırır (Kd2 0.05) azalma aşkar etdik ki, bu da onun roluna baxmayaraq iki subunit birlikdə vacibdir, lakin CCD GBTA bağlama yerləri arasında subunitlərarası allosterik birləşməyə birbaşa vasitəçilik etmir. (a) S4-ün daxili ucunda triglisin mutasiyası olan Hv1 dimerinin sxematik diaqramı, sitoplazmik qıvrımlı qıvrım domeninin vasitəçiliyi ilə subunitlərarası birləşməni pozmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur (mavi oxlar). (b) Hv1 dimerlərinin və bağlama dimerlərinin sxematik təsviri alt bölmələr arasında birləşmədə iştirak edən S1 fraqmentlərini sınamaq üçün nəzərdə tutulmuş göstərilən mutasiyalar (mavi oxlar).(c–h) 2GBI (göy) və GBTA (tünd qırmızı) konsentrasiyadan asılı olaraq göstərilən konstruksiyaları inhibə edir. Hər nöqtə orta inhibəni təmsil edir. ± SD 3 ilə 10 ölçmə. Əyri, görünən Kd dəyərlərini əldə etmək üçün istifadə edilən Hill uyğunluğu idi (Əlavə Cədvəl 1-ə baxın). İnterpolyasiya edilmiş histoqramlarda təpə əmsalları Metodlar bölməsində təsvir olunduğu kimi müəyyən edilmişdir (Əlavə Şəkil 3 və 4-ə baxın). İstinad h dəyərləri üçün Hv1 WT kəsikli xətlər kimi göstərilir. Ulduzlar mutant və WT keçidləri arasında statistik əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p 0.05, Şəkil 5d, i ) ). Digər tərəfdən, D123A mutasiyası GBTA-nın Hill əmsalını əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb (p 0.05/14). Hər iki alt bölmədə 123-cü mövqedə yükün neytrallaşdırılması GBTA-nın əlaqələndirici kooperativliyində güclü dəyişikliklə nəticələndiyindən, hər iki alt bölmədə yükün geri qaytarılması yalnız kiçik bir təsirə malik olduğundan, biz təhlili yükün inversiya kanalı ilə yalnız bir alt vahidi daxil etmək üçün genişləndirdik. C-terminal alt bölməsində D123R əvəzedicisi ilə Hv1 ilə əlaqəli dimerlər yaratdı (Şəkil 5b) və GBTA və 2GBI ilə konsentrasiyaya cavab inhibəsini ölçdü. Biz GBTA-nın WT-D123R kanallarına bağlanmasının Hill əmsalı bundan əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olduğunu gördük. vəhşi tipli Hv1 (p 0.05). βME olmadıqda, GBTA-nın D112E I127C Hv1 dimerinə bağlanmasının Hill əmsalı azaldıcı maddələrin iştirakı ilə ölçüləndən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olduğunu aşkar etdik (Şəkil 6e və Əlavə Şəkil 4), bu da D112E mutasiyasının olduğunu göstərir. sistein 127-nin çarpaz bağlanması nəticəsində GBTA bağlayan kooperativlik artımını ləğv etmədi. D112E, I127C Hv1 dimerlərinə bağlanan 2GBI-nin Hill əmsalı da D112E mutasiyasından əhəmiyyətli dərəcədə təsirlənmədi (Şəkil 1).6d və Əlavə şək. 3). Birlikdə götürdükdə, bu tapıntılar GBTA bağlanmasının cəlbedici elektrostatik qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə və ya əvəz edilmiş sisteinlər arasında kovalent bağların meydana gəlməsi ilə bitişik Hv1 alt bölmələrindəki S1 fraqmentlərinin xarici ucları arasında qarşılıqlı əlaqə ilə gücləndirildiyini göstərir. Cazibədar elektrostatik qarşılıqlı təsirlərin kooperativliyə təsiri D112E mutasiyası ilə ləğv edilə bilsə də, kovalent bağların təsiri mümkün deyil. Quanidin törəmələrini Hv1 kanallarına bağlamaq üçün mövcud olan kimyəvi məkanı tədqiq edərkən, GBTA kimi 2-guanidinotiyazolların 2-guanidinobenzimidazollardan daha dik konsentrasiyadan asılı olduğunu aşkar etdik (Şəkil 1c). və monomerik kanallar (Şəkil. 2a, b) və bir alt bölmənin inhibitora əvvəlcədən bağlandığı dimerik kanala (Şəkil 4) Hv1-in GBTA tərəfindən inhibə edilməsinin Hv1-in hərəkətinin sinerjistik bir proses olduğu qənaətinə gəldik və iki alt bölmədəki birləşmələrin bağlanma yerləri allosterik olaraq bağlıdır. GBTA-nın açıq kanala bağlanması kəşfi, əvvəllər müvafiq birləşmə 2GBI32 üçün göstərildiyi kimi, allosterik birləşmənin açıq vəziyyətdə xüsusi olaraq qiymətləndirilə biləcəyini göstərir. Bizim kooperativ bağlama modelimiz GBTA (Şəkil 2C) tərəfindən HV1-nin inhibe-ni kəmiyyətcə təsvir edə bildi və 2GBI və GBTA-nın təfsirimizi dəstəkləyən membran rekolizasiyasından sonra kanal quyruq cərəyanlarının çürüməsi ilə əlaqədar müxtəlif təsirlərini izah edin. İki məcburi sayt (məsələn, HV1 kimi) bir allosterik bir proteində əldə edilə bilən maksimum təpə əmsalı 2. Hv1 I127C-də 1.88-ə qədər olan HV1 vəhşi tipi bağlamaq üçün GBTA-nı ölçdü Synergistic Pulsuz Enerji, ən aşağı və ən yüksək yaxınlıq saytlarının (metodlara bax), HV1 I127C və 2.7 KCAL / Mole halında 1,3 kkal / mol olan 1,3 kkal / mol olan fərqi Hemoglobinə oksigenin oksigeni, əməkdaşlıq prosesinin ən məşhur və yaxşı öyrənilmiş nümunəsidir38. KCAL / MOL, Təcrübəli şəraitdən asılı olaraq Synergy modelimizdə, GBTA molekullarının bir subunitə bağlanması, bitişik subunitin məcburi yaxınlığında artımla nəticələnir. Subunits.in arasındakı qarşılıqlı təsirlər əvvəllər HV1 Proton Permeation yolunun bir hissəsi və seçmə selter27,28 kimi hərəkət etmək üçün göstərilmişdir. Nəticələrimiz göstərir ki, iki HV1 subunitsində seçmə filtrləri Açıq Dövlətdə Allşərliklə birləşdirilir. HV1-CIVSP-nin Kristal Strukturu haqqında Chimera. (a) HV1 VSD.Based HV1-Civsp şkafının kristal quruluşunda sxematik, hakerik seqmentlərin silindrik olduğu göstərilir. Bu konfiqurasiya, S4 seqmentinin daxili ucu CCD ilə birləşir (göstərilmir). GBTA-nın proqnozlaşdırılan yerləri boz yumurtalar kimi göstərilmişdir. İki fərqli dimer konfiqurasiyasında, membran təyyarəsinin ekstraceluar tərəfindən göründüyü kimi, S4 Helix tərəfindən S4 Helix tərəfindən yaradılır. İki S4 Helisinin (Daşlı Okların) xarici uclarının ayrılması, sağ tərəfində göstərilən tənzimləmə istehsal edir. 4G80 kristal strukturunda tapılan Dimer konfiqurasiyasında, Civsp-də P140 HV1-də D123 mövqeyinə uyğundur. Nəticələrimiz göstərir ki, Qalıq 123 (123D / 123D / 123R / 123R) arasındakı əxlaqsız elektrostatik qarşılıqlı əlaqə, açıq vəziyyətdə GBTA-bağlayıcı bir kooperativliyin "normal" səviyyəsi ilə əlaqələndirilir və cəlbedicidən cəlbedicidir (123d / 123R) , əməkdaşlığın artması (Şəkil 5g) .Bu, Alanin əvəzediarı ilə itələyici qarşılıqlı əlaqənin də artan əməkdaşlığın artmasına səbəb olacağı gözlənilir. İzahatdır ki, hidrofobik qalıqların hidrofilik mühitində yerləşdirilməsinin sabitləşməsi, D123 qalıqları arasında iyrənc qarşılıqlı əlaqələrin aradan qaldırılması səbəbindən sabitləşdirici effektdən üstündür, nəticədə bağlayıcı kooperativliyin ümumi azalması ilə nəticələnir.Mony et al.39 Ciona Gutis Ci-HV1-in D171 mövqeyi (insan HV1-də D123-ə uyğun olaraq) aktivləşdirildikdən sonra, D123-nin açıq vəziyyətdə hidrofilik mühitində yerləşdiyi anlayışını dəstəklədikdə artırılır. HV1 kanallarının qapılarının bir çox keçid yolu ilə baş verəcəyi bilinir19,26,39,40,41.Qiu və AL26 membran depolarizasiyasına görə, CI-HV1-in gərgin sensoru, kanalın aktivləşdirilmiş, lakin hələ də bağlandığı bir dəyişikliyə məruz qaldığını gördü Protonların hər iki submits yolunda keçirilməsinə səbəb olan fərqli bir keçid izlədi. Gərginlik sensorunun uyğunlaşma dəyişməsi gərgin-yıxılma flüoresanlıqla izlənildi və ikinci keçidin D171 mövqeyində mutasiya ilə seçildiyi aşkar edildi. Floresan siqnalının pozulması, uyğunlaşma dəyişikliyinin reaksiya koordinatları boyunca bitişik subunitlərin D171 qalıqları arasındakı elektrostatik qarşılıqlı əlaqələrin olmasına uyğundur. və GBTA məcburi saytlar arasında allosterik birləşmə vasitəçiliyi. Fujiwara et al25, sitoplazmik coiled-roil domeninin dimer interfeysinin iki s4 helisi (şəkil 7b, sol panel) olan membrana uzandığını təklif etdi. Bu mənzillərin qarşılıqlı əlaqəsinin modeli Cysteine ​​çarpaz birləşdirən analizi əhatə edir S4 Helixi və CCD-ni birləşdirən bölgənin bütün VSD və funksional təhlili. Buna görə də aşkar edilmiş S4-S4 interfeysi, off-dövlət subunit konfiqurasiyasını əks etdirir Bağlı dövlətlər, Mony et al-nin tapıntılarına uyğun bir fikir. S1, qapılar zamanı 39 hərəkət edir. Burada, açıq vəziyyətdə, S1 Helix'in ekstakoluar ucları, subunits arasındakı allosterik birləşmələri olan birbaşa elektrostatik qarşılıqlı əlaqələri dəstəkləmək üçün kifayət qədər yaxındır. Bir-birindən birbaşa əlaqə qurmaq üçün başqa bir-birindən başqa, iki S4 helisinin xarici uclarının ayrılması ilə birləşərək bir oxun ətrafındakı iki VSD-nin subunitsinin 20 ° saat yönünderi, S1-S1 konfiqurasiyasına uyğun olaraq Tapıntılarımızla (Şəkil 7B, sağ panel) .Bizi açıq vəziyyətdə kanal üçün bu konfiqurasiyanı tövsiyə edirik. Civsp fermentinin monomer kimi işləməsi düşünülsə də, təcrid olunmuş VSD-nin kristal quruluşu bir dimer dövlətində tutulur. HV1 (Şəkil 7c). və Civsp dimersləri təklif edir ki, bu zülalların VSDS-in S1-nin qarşılıqlı əlaqəsi olan bir interfeys yaratmaq üçün daxili bir meyl var. Sperma hüceyrəsi aktivləşdirilməsində HV1-nin vacib rolu, bu kanalın kişi məhsuldarlığına nəzarət etmək üçün cəlbedici bir dərman hədəfini verir. Döş 12 və ya colorektal xərçəngi olan xəstələrdə yaşaması və B-hüceyrə malignistallarına töhfə verməsi düşünülür. Açıq HV1 Subunit, artan yaxınlığın artmasına səbəb olan, HV1 kanallarını hədəf alan daha güclü dərmanların inkişafına səbəb ola bilər. Saytın yönəldilmiş Mutagenesis, HV1NCCIVSP-nin HV16 və 228-273-cü illəri HV183 və 220-576, HV18.in, HV1-lə əlaqəli Dimerin 80 və 220-576 qalıqları ilə əvəz edilmişdir. Bir subunitin C-terminusu, GGSGGSGGSGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGE plazmidləri ilə əlaqəli olan PGEMHE plazmidləri NHE1 və ya SPH1 məhdudiyyət fermentləri (Yeni İngiltərə Biolabs) və RNT sintezi ilə xətti çəkildi T7 MMessage Mmessange Macchine Transkripsiyası (Ambion) .1-3 gün əvvəl elektrofizioloji ölçmələrdən əvvəl, CrNa KrN-ə vuruldu (Hüceyrəyə 50 NL, 0.3-1.5 mkq / mkl). Ecosyte Bioscence.Folling-dən RNA enjeksiyonundan, 96 mm-lik, 2 mm kl, 1 mm kac, 1 mm kac, 10 mm hep, 100 mm piramis, pH 7.2 18 ° C . 2-Guanidino-Benzimidazole [1], 2-guanidino-benzotiozole [2], (4 metil-1,3-thiazol-2-yl) guanidin [5], (5-bromo-4 -methil-1,3) -thiazol-2-yl) guanidine) [6], etil 2-guanidino-5 metil-1,3 thiazole-4 karboksilat [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-thiazole- 5-karboksilat [9] və (2-nin (2-guanidino-4 metil-1,3-thiazol-5-yl) etil asetat [10] Sigma-Aldrich.famotidindən [7] deputat biyomeditorlarından idi.1- [4 - (4-Chlorophenil) -1,3-Thiazol-2-YL] Guanidine [11] və 1- [4- (3,4-Dimethoxyphenil) -1,3- Thiazol-2-Yl] Guanidin [12] Matrix Elmi.Bu birləşmələrdən ticari olaraq ən yüksək saflıqdan ibarətdir. ən azı 99% təmizlik. 25 ml sulu hidroklor turşusu (2,5 N) -də benzenetiol hidroklorid (1.02 qr, 4.5 mmol) benzenetiol hidroklori (1.02 qr, 4.5 mmol) bağlandı (2.5 N) 4 saat ərzində güclü qarışdırma ilə reflü idi. 65 ° C) bir neçə saat ərzində ağ bərk (500 mq, 48%) vermək üçün etil asetat / neft efirindən yenidən başladın; MP 221-222 ° C (yüngül 225-226 ° C) 45; 1h NMR (500 mhz, dmo-d6): δ [ppm] = 7.25 (çox geniş s, 4 h), 7.40 (d, 1 h, j = 8,1 hz), 7.73 (s, 1 h), 7.92 (D , 1 H, J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-DMR): δ = 114.2 (D, J = 3.5 Hz), 117.5 (D, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (Q, J) = 272 hz), 126.1 (q, j = 272 hz) = 31.6 hz), 134,8 hz), 134,8, 152.1, 152.1, 152.1, 175.5.Hrms (eSi): m / z hesablanmış dəyər. : 261.0419. Nafto [1,2-d] Thiazol-2-Amine (300 mq, 1,5 mmol), əvvəllər təsvir edildiyi kimi sintez, kiçik bir test borusundakı neft hamamında 200 ° C-ə qədər qızdırıldı (böyük artıq) siyanamid və 1.0 ml conc.te isti birləşməsi hidroklor turşusu sürətlə əlavə edildi və qarışığı təxminən 2 dəqiqə ərzində yağ hamamında saxlanıldı, bu müddət ərzində suyun çox hissəsi buxarlandı. Kiçik parçalara bölündü və solğun bir sarı amorf bərk təmin etmək üçün su ilə yuyuldu. (38 mq, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (T, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (D, 1 H) , J = 8.6 hz), 7.89 (D, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (D, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (D, 1 H, J = 8.3 Hz) .13C NMR (150) MHZ, DMSO-DM6): δ = 119.9, 127.9, 123.6, 126,6, 126,6, 126,6, 126.6, 127.1, 127.1, 128.7, 128.7, 128.7, 132.1, 140.7, 140.1, 140.7, 169.1.HRMS (ƏSI): M / Z) , tapıldı: 243.0704. Proton cərəyanları, pclamp10 software ilə 1440A (molekulyar cihazların) ilə əlaqəli bir AxoPatch 200B 200B gücləndiricisindən istifadə edərək fərqli konstruksiyalarını ifadə edən OOSitlərin daxili və xarici yamalarında ölçüldü. ) Etanesulfon turşusu Tea Hydrokside ilə PH 6.0.Bütün ölçmələr 22 ± ° C-də edildi ) və mənşəli8.1 (mənbəyi). HV1 ingibitorunun müxtəlif konsentrasiyasından ibarət olan həllər və bəzi hallarda 10 mm βme, PCLAMP proqramı TTLAMP proqramı TTL-dən (TTL-ə) keçən bir VC-6 Perfuziya Vana Sisteminə (Warner Instr.) İlə birlikdə cazibə qüvvəsi ilə hamamda təqdim edildi (TTL Tranzistor məntiqi) siqnalları.Rapid perfuziya təcrübələri bir çox tipli perfuziya qələmindən istifadə edərək (sci. +120 mv depolarizizasiya edən pulse.gv ölçmələri əvvəllər təsvir edildiyi kimi edildiyi kimi edildiyi kimi edildi18,20. Cari çürümə üçün 18. GV qrafikinə uyğundur. Boltzmann tənliyinə uyğundur Hill tənliyi ilə: İnhibitorun konsentrasiyası olduğu və H və H təpə əmsalının konsentrasiyasıdır. Təpə əmsalı hesablamaq üçün (2) (2) tənliyini yenidən dəyişdirin: