Апытанне межсубъединичного інтэрфейсу адкрытага пратоннага канала Hv1 з аластэрычна звязаным зондам

Дзякуй за наведванне Nature.com. Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб гарантаваць працяг падтрымкі, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript. Напругазалежны пратонны канал Hv1 - гэта дымерны комплекс, які складаецца з двух даменаў, якія адчуваюць напружанне (VSD), кожны з якіх змяшчае закрыты шлях пранікнення пратонаў. Дымерызацыя кантралюецца цытаплазматычным даменам спіралі. Пераход ад закрытага стану да адкрытае стан у абодвух ВСД, як вядома, адбываецца сумесна; аднак пра механізмы, якія ляжаць у аснове, мала што вядома. Інтэрфейсы паміж суб'едыніцамі гуляюць ключавую ролю ў аластэрычных працэсах; аднак такія інтэрфейсы не былі ідэнтыфікаваныя ў адкрытых каналах Hv1. Тут мы дэманструем, што вытворныя 2-гуанідынатыазолу сумесна блакуюць два VSD Hv1 і выкарыстоўваюць адно з гэтых злучэнняў у якасці зонда для аластэрычнага злучэння паміж адкрытымі субадзінак. Мы выявілі, што пазаклеткавы канец першага трансмембраннага фрагмента VSD утварае межсубъединичный інтэрфейс, які забяспечвае сувязь паміж сайтамі звязвання, у той час як дамен спіралі не ўдзельнічае непасрэдна ў гэтым працэсе. Мы таксама знайшлі важкія доказы таго, што пратон-селектыўны фільтр канала кантралюе кааператыўнасць звязвання блокаторов . Напругазалежныя пратонныя каналы гуляюць важную ролю ў розных арганізмах, ад фітапланктону да чалавека1. У большасці клетак гэтыя каналы апасродкуюць адток пратонаў з пратоннай мембраны і рэгулююць актыўнасць НАДФН-аксідазы. Адзіны вядомы напругазалежны пратонны канал у чалавека Hv1, які з'яўляецца прадуктам гена HVCN12,3. Hv1 (ён жа VSOP), як было паказана, гуляе ролю ў праліферацыі B-клетак4, выпрацоўцы актыўных формаў кіслароду прыроджанай імуннай сістэмай5,6,7,8, клеткай спермы рухомасць9 і рэгуляцыя рН вадкасці на паверхні дыхальных шляхоў10. Гэты канал удзельнічае ў некалькіх тыпах раку з падвышанай экспрэсіяй, такіх як злаякасныя пухліны В-клетак 4,11 і рак малочнай залозы і колоректальный рак 12,13. Выяўлена, што празмерная актыўнасць Hv1 павялічвае метастатический патэнцыял ракавых клетак 11, 12. У галаўным мозгу Hv1 экспрессируется мікрагліяй, і было паказана, што яго актыўнасць узмацняе пашкоджанне мозгу на мадэлях ішэмічнага інсульту. Бялок Hv1 змяшчае напружанне-адчувальны дамен (VSD), які складаецца з чатырох трансмембранных сегментаў, званых S1 да S414. VSD нагадвае адпаведныя дамены напружаных каналаў Na+, K+ і Ca2+ і адчувальных да напружання фасфатаз, такіх як CiVSP з Ciona gutis15. У гэтых іншых вавёрках С-канец S4 далучаны да эфектарнага модуля, дамена пары або фермента. У Hv1 S4 звязаны з даменам спіралі (CCD), размешчаным на цытаплазматычнай баку мембраны Канал уяўляе сабой дымерны комплекс, які складаецца з двух VSD, кожны з якіх змяшчае закрыты шлях пранікнення пратонаў 16, 17, 18. Было выяўлена, што гэтыя дзве субадзінкі Hv1 адкрываюцца сумесна 19, 20, 21, 22, што сведчыць аб аластэрычным сувязі і ўзаемадзеянні паміж субадзінак важная роля ў працэсе стробавання. Інтэрфейс паміж субадзінак у спіральным дамене добра вызначаны, таму што крышталічныя структуры двух ізаляваных даменаў даступныя 22, 23. З іншага боку, інтэрфейс паміж VSD ўнутры мембраны не з'яўляецца добра зразумела. Крышталічная структура хімернага бялку Hv1-CiVSP не дае інфармацыі аб гэтым інтэрфейсе, паколькі трымерная арганізацыя комплексу крышталізаваных каналаў можа быць вынікам замены натыўнага Hv1 CCD дражджавым лейцынавым замкам GCN424. Нядаўняе даследаванне арганізацыі субадзінак канала Hv1 прыйшло да высновы, што дзве спіралі S4 пераходзяць у CCD без сур'ёзнага разбурэння другаснай структуры, у выніку чаго ўтвараюцца доўгія спіралі, якія пачынаюцца ад мембраны і выступаюць у цытаплазму. На аснове аналізу сшывання цыстэіну, гэта даследаванне мяркуе, што VSD Hv1 кантактуюць адзін з адным уздоўж сегмента S4. Аднак іншыя даследаванні прапанавалі альтэрнатыўныя інтэрфейсы паміж VSD. Гэтыя інтэрфейсы ўключаюць сегменты S1 17, 21, 26 і вонкавыя канцы сегмента 21 S2. Магчымая прычына канфлікту Вынікі гэтых даследаванняў заключаюцца ў тым, што алластэрычнае ўзаемадзеянне паміж VSD разглядалася ў сувязі з працэсам стробавання, які залежыць ад закрытага і адкрытага станаў, і інтэрфейс паміж VSD можа вар'іравацца ў розных станах і зменах канфармацыі. Тут мы выявілі, што 2-гуанідзінатыазол інгібіруе каналы Hv1 шляхам сінэргічнага звязвання з двума адкрытымі VSD, і выкарысталі адно са злучэнняў, 2-гуанідынабензатыазол (GBTA), каб даследаваць узаемадзеянне паміж субадзінак у адкрытым стане. інтэрфейс. Мы выявілі, што крывая звязвання GBTA можа быць добра апісана колькаснай мадэллю, у якой звязванне інгібітару з адной субадзінкай прыводзіць да павелічэння сродства звязвання суседняй субадзінкі. Мы таксама выявілі, што рэшткі D112 фільтруюць селектыўнасць для канал 27, 28 і частка сайта звязвання вытворнага гуанідзіну 29 кантралююць кааператыўнасць звязвання GBTA. Мы паказваем, што кааператыўнае звязванне падтрымліваецца ў дымеры Hv1, дзе CCD аддзяляецца ад сегмента S4, што сведчыць аб тым, што межсубъединичный інтэрфейс у CCD не непасрэдна апасродкуе аластэрычнае злучэнне паміж GBTA-звязваючымі сайтамі. Наадварот, мы знаходзім, што фрагмент S1 з'яўляецца часткай інтэрфейсу паміж субадзінак і прапануем размяшчэнне суседніх VSD з пазаклеткавым канцом спіралі S4 ад цэнтра дымера, каб дазволіць фрагмент S1 знаходзіцца ў адкрытым стане. Маленькія малекулы інгібітараў Hv1 карысныя ў якасці супрацьпухлінных лекаў і нейропротекторов. Аднак на сённяшні дзень некалькі злучэнняў здольныя інгібіраваць канал30,31,32,33. Сярод іх 2-гуанідзінабензімідазол (2GBI, злучэнне [1] на мал. 1a) і яго вытворныя блакуюць пранікненне VSD29,32 пратонаў праз канал. Лічыцца, што звязванне такіх злучэнняў адбываецца незалежна ў дзвюх адкрытых субадзінках. раней было паказана, што ён інгібіруе Hv1 амаль гэтак жа эфектыўна, як 2GBI, пры тэставанні ў канцэнтрацыі 200 мкМ (малюнак 1b). Мы даследавалі іншыя вытворныя тыязолу і выявілі, што некаторыя з іх інгібіруюць канал з такой жа або большай магутнасцю, чым GBTA (мал. 1 і дадатковыя дадаткі). тэкст). Мы вызначылі крывыя канцэнтрацыйнай рэакцыі чатырох вытворных тыязолу (GBTA і злучэнняў [3], [6] і [11], мал. 1c) і выявілі, што яны больш крутыя, чым у 2GBI. Каэфіцыенты Хіла (h) вытворных тиазола вагалася ад 1,109 ± 0,040 да 1,306 ± 0,033 (мал. 1c і Дадатковы малюнак 1). У адрозненне ад гэтага, каэфіцыент Хіла для 2GBI быў 0,975 ± 0,024 29, Мал. 2a і Дадатковы малюнак 1). Каэфіцыент Хіла вышэй за 1 паказвае на кааператыўнасць звязвання. Паколькі кожная субадзінак Hv1 мае свой уласны інгібітар- сайт звязвання,29,32 мы разважалі, што звязванне вытворнага тыязолу з адной субадзінкай можа ўзмацніць звязванне другой малекулы інгібітару з суседняй субадзініцай. GBTA быў тэставым злучэннем з самым высокім каэфіцыентам Хіла. Таму мы абралі гэта злучэнне для далей вывучалі механізм сінэргіі звязвання і выкарыстоўвалі 2GBI ў якасці эталоннага адмоўнага кантролю. (a) Тэставыя злучэнні: [1] Эталонны інгібітар Hv1 2-гуанідзіна-бензімідазол (2GBI).[2] 2-гуанідзіна-бензатыазол (GBTA), [3] (5-трыфторметыл-1,3-бензатыазол-2-іл)гуанідзін, [4] нафта[1,2-d][1, 3] тыазол-2-іл -гуанідзін, [5](4-пазначаў-1,3-тыазол-2-іл)гуанідзін, [6](5-бром-4-пазначаў-1,3-тыазол-2-іл)гуанідзін, [7] фаматыдын, [8] этылавы эфір 2-гуанідзіна-5-пазначаў-1,3-тыазол-4-карбонавай кіслаты, [9] 2-гуанідзіна-4-пазначаў этыл-1,3-тыазол-5-карбаксілат, [10] ](2-гуанідзіна-4-пазначаў-1,3-тыазол-5-іл)этылацэтат, [11]1-[4-(4-хлорфеніл)-1,3-тыазол-2-іл]гуанідзін, [ 12]1-[4-(3,4-дыметаксіфеніл)-1,3-тыазол-2-іл]гуанідын. (b) Інгібіраванне актыўнасці Hv1 чалавека пазначанымі гуанідынотыязоламі і эталонным злучэннем 2GBI (сіне-зялёныя палоскі) Пратонныя токі .Hv1 вымяраліся ў бляшках яйкаклетак Xenopus навыварат у адказ на дэпалярызацыю ад -80 мВ да +120 мВ. Кожны інгібітар дадаваўся ў ванну ў канцэнтрацыі 200 мкМ. pHi = pHo = 6,0 . Дадзеныя ўяўляюць сабой сярэдняе ± SEM (n≥4). (c) Залежнае ад канцэнтрацыі інгібіраванне Hv1 чалавека злучэннямі [2], [3], [6] і [11]. Кожная кропка ўяўляе сярэдняе інгібіраванне ± SD 3 да 15 вымярэнняў. Лінія ўяўляе сабой падганянне Хіла, якое выкарыстоўваецца для атрымання відавочных значэнняў Kd, прыведзеных у Дадатковай табліцы 1. Каэфіцыенты Хіла былі вызначаны з падганянняў, прыведзеных у Дадатковым малюнку 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (гл. Метады). (a,b) Злучэнні 2GBI і GBTA інгібіруюць дымерны і манамерны Hv1 у залежнасці ад канцэнтрацыі. Кожная кропка ўяўляе сабой сярэдняе інгібіраванне ± стандартнае адхіленне ад 3 да 8 вымярэнняў, а крывая ўяўляе сабой падгонку Хіла. Каэфіцыенты Хіла (h), паказаныя ў устаўленыя гістаграмы былі вызначаны з падганянняў, прадстаўленых на дадатковых малюнках 3 і 4. Рэакцыя на канцэнтрацыю GBTA, паказаная на (a), такая ж, як і на мал. 1c. Глядзіце Дадатковую табліцу 1 для бачных значэнняў Kd. (c) Мадэляванне кааператыўнае звязванне GBTA з дымерным Hv1. Суцэльная чорная лінія паказвае адпаведнасць эксперыментальным дадзеным ураўненнем (6), якое апісвае мадэль звязвання, паказаную ў (d). Пункцірныя лініі, пазначаныя Sub 1 і Sub 2, уяўляюць бімалекулярную асацыяцыю -крывыя раўнавагі дысацыяцыі для першай і другой падзеі звязвання адпаведна (падпункт 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 мкМ; падпункт 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 мкМ ).(d) Схематычная дыяграма прапанаванага механізму блока Hv1. У выпадку GBTA звязванне з адной адкрытай субадзінкай павялічвае сродство суседняй адкрытай субадзінкі (Kd2 0,05) зніжэнне каэфіцыента Хіла звязвання GBTA з GGG-каналамі ў параўнанні з дзікім тыпам (мал. 5c), што сведчыць аб тым, што, нягледзячы на ​​яго ролю ў захаванні дзве субадзінак разам важныя, але CCD непасрэдна не з'яўляецца апасродкаваным межсубъединичным аллостерическим злучэннем паміж сайтамі звязвання GBTA. (a) Схематычная дыяграма дымера Hv1 з мутацыяй трыгліцыну на ўнутраным канцы S4, прызначанай для разрыву міжсубъединичной сувязі, апасродкаванай цытаплазматычным даменам спіралі (сінія стрэлкі). (b) Схематычнае адлюстраванне дымераў Hv1 і дымераў перавязкі з паказаныя мутацыі, прызначаныя для праверкі фрагментаў S1, якія ўдзельнічаюць у спалучэнні субадзінак (сінія стрэлкі). (c–h) 2GBI (блакітны) і GBTA (цёмна-чырвоны) інгібіруюць пазначаныя канструкцыі ў залежнасці ад канцэнтрацыі. Кожная кропка ўяўляе сярэдняе інгібіраванне ± SD ад 3 да 10 вымярэнняў. Крывая ўяўляла сабой падгонку Хіла, якая выкарыстоўвалася для атрымання ўяўных значэнняў Kd (гл. Дадатковую табліцу 1). Каэфіцыенты Хіла ў інтэрпаляваных гістаграмах вызначаліся, як апісана ў раздзеле "Метады" (гл. Дадатковыя малюнкі 3 і 4). Даведачныя значэнні h для Hv1 WT паказаны пункцірнымі лініямі. Зорачкі паказваюць статыстычна значныя адрозненні паміж пасажамі мутанта і WT (р 0,05, мал. 5d,i). ). З іншага боку, мутацыя D123A значна знізіла каэфіцыент Хіла GBTA (p 0,05/14). Паколькі нейтралізацыя зарада ў пазіцыі 123 на абедзвюх субадзінках прывяла да моцнай змены ў кааператыўнасці звязвання GBTA, у той час як змяненне зарада на абедзвюх субадзінках мела толькі невялікі эфект, мы пашырылі аналіз, каб уключыць толькі адну субадзінку з каналам інверсіі зарада. Мы стварылі дымеры, звязаныя з Hv1, з заменай D123R у C-канцавой субадзінак (мал. 5b) і вымералі інгібіраванне рэакцыі канцэнтрацыі GBTA і 2GBI. Мы выявілі, што каэфіцыент Хіла звязвання GBTA з каналамі WT-D123R быў значна вышэй, чым гэты Hv1 дзікага тыпу (p 0,05). Мы таксама выявілі, што пры адсутнасці βME каэфіцыент Хіла звязвання GBTA з дымерам D112E I127C Hv1 быў значна вышэй, чым вымераны ў прысутнасці аднаўляльнікаў (мал. 6e і дадатковы малюнак 4), што азначае, што мутацыя D112E каэфіцыент Хіла звязвання 2GBI з дымерамі D112E, I127C Hv1 таксама істотна не паўплываў на мутацыю D112E (малюнак 1).6d і дадатковы Мал. 3). У сукупнасці гэтыя высновы сведчаць аб тым, што звязванне GBTA узмацняецца ўзаемадзеяннем паміж вонкавымі канцамі фрагментаў S1 у суседніх субадзінак Hv1 праз прывабныя электрастатычныя ўзаемадзеянні або праз утварэнне кавалентных сувязей паміж замешчанымі цыстэінамі. У той час як эфект прывабных электрастатычных узаемадзеянняў на кааператыўнасць можа быць адменены мутацыяй D112E, эфект кавалентных сувязяў не можа. У нашым даследаванні хімічнай прасторы, даступнай для звязвання вытворных гуанідзіну з каналамі Hv1, мы выявілі, што 2-гуанідынатыязолы, такія як GBTA, маюць больш крутую залежнасць ад канцэнтрацыі, чым 2-гуанідзінабензімідазолы (мал. 1c). Аналіз каэфіцыента Хіла звязвання GBTA з абодвума дымерамі і мономерных каналаў (мал. 2a, b) і дымернага канала, у якім адна субадзінак была папярэдне звязана з інгібітарам (мал. 4), прывялі нас да высновы, што інгібіраванне Hv1 з дапамогай GBTA Дзеянне з'яўляецца сінэргічны працэсам, і сайты звязвання злучэнняў у дзвюх субадзінках аластэрычна звязаны. Адкрыццё таго, што GBTA звязваецца з адкрытым каналам, як было паказана раней для роднаснага злучэння 2GBI32, дазваляе выказаць здагадку, што аластэрычнае злучэнне можа быць канкрэтна ацэнена ў адкрытым стане. Наша кааператыўная мадэль звязвання змог колькасна апісаць інгібіраванне HV1 GBTA (мал. 2С) і растлумачыць розныя эфекты 2GBI і GBTA на распад каналавых хваставых патокаў пасля рэпалярызацыі мембраны, што падтрымлівае нашу інтэрпрэтацыю працэсу звязвання. Максімальны каэфіцыент узгорка, які можна дасягнуць у аластэрычным бялку з двума месцамі звязвання (напрыклад, HV1), складае 2. Мы вымяралі GBTA для звязвання дзікага тыпу HV1 з каэфіцыентам 1,31, які павялічыўся да 1,88 у HV1 I127C.We Сінэргічная вольная энергія, розніца паміж свабоднымі энергіямі з найменшымі і самымі высокімі сродствамі (гл. Метады), склала 1,3 ккал/моль у выпадку дзікага тыпу HV1 і 2,7 ккал/моль у выпадку HV1 I127C.The прывязкі кіслароду да гемаглабіну-самы вядомы і добра вывучаны прыклад сумеснага працэсу38. Для чалавечага гемаглабіну (тэтрамер з чатырма аластэрычна звязанымі сайтамі), каэфіцыент пагорка складае ад 2,5-3,0, пры значэнні ад 1,26 да 3,644 KCAL/MOL, у залежнасці ад эксперыментальных умоў38.Та, з пункту гледжання глабальнай энергетыкі, кааператыўнасць звязвання GBTA з HV1 істотна не адрозніваецца ад тых, што ўлічваецца O2 з гемаглабінам, калі разглядаецца розная колькасць бялковых субадзінак у дзвюх сістэмах. У нашай мадэлі сінэргіі, звязванне малекул GBTA з адной субадзінкай прыводзіць да павелічэння прывязкі да сумежнай субадзінкі. Мы прадугледжваем працэс, у якім перастаноўка асяроддзя звязвання, якая ўзнікае ў выніку першай прывязкі (індукаванай формы), вядзе да Змены ў ўзаемадзеянні паміж субадзінкамі. У адказ на гэтыя змены суседнія субадзінкі мяняюць свае сайты звязвання, што прыводзіць да больш жорсткага звязвання GBTA. Пры гэтым працэс S1 ASPARTATE D112 нясе адказнасць за перабудова сайта прывязкі, звязанае з павелічэннем прывязкі .D112 Раней было паказана, што ўваходзіць у шлях пранікання HV1 і дзейнічае як фільтр селектыўнасці27,28. Нашы вынікі паказваюць, што селектыўнасць фільтраў у дзвюх субадзінак HV1 аластэрычна звязаны ў адкрытым стане. Фігура 7А паказвае прыблізнае месцазнаходжанне сайта звязвання GBTA і размяшчэнне рэшткаў D112, D123, K125 і I127 на схеме HV1 VSD, заснаванага На крышталічнай структуры хімера HV1-CIVSP. (A) Схематычная для HV1 VSD. на крышталічнай структуры хімера HV1-CIVSP, як паказана, спіральныя сегменты з'яўляюцца цыліндрычнымі. У гэтай канфігурацыі ўнутраны канец сегмента S4 зліваецца з CCD (не паказана). Прагназаваныя месцы звязанага GBTA паказаны ў выглядзе шэрых авалаў. Блакавыя стрэлкі паказваюць на шляхі, якія ўдзельнічаюць у аллостерической злучэнні паміж сайтамі звязвання ў дзвюх суседніх субадзінак. Пазіцыі даследаваных рэшткаў S1 адзначаны каляровымі сферамі. У дзвюх розных канфігурацыях дымера, як гэта відаць з пазаклеткавай бакі мембраннай плоскасці. На левай панэлі інтэрфейс дымера ўтвараецца з дапамогай спіралі S4. Праграма двух VSD 20 градусаў па гадзіннікавай стрэлцы вакол восі, перпендыкулярнай мембраннай плоскасці, якая суправаджаецца, якая суправаджаецца Падзел знешніх канцоў двух спіраляў S4 (пункцірныя стрэлкі), вырабляе размяшчэнне, паказанае справа. У гэтай канфігурацыі рэшткі D123 і I127 ад сумежных субадзінак дазваляюць збліжацца. (C) Схематычнае прадстаўленне CIVSP VSD У канфігурацыі дымера, знойдзенай у крыштальнай структуры 4G80.position p140 у CIVSP, адпавядае становішча D123 у HV1. Нашы вынікі паказваюць, што адштурхвае электрастатычнае ўзаемадзеянне паміж рэшткамі 123 (123D/123D або 123R/123R) звязана з "нармальным" узроўнем кааператыўнасці, якая звязвае GBTA, у адкрытым стане і перамяшчае ўзаемадзеянне ад адштурхвання да прыцягнутага (123D/123R) , павелічэнне супрацоўніцтва (мал. 5 г). Чакаецца, што выдаленне адштурхвальнага ўзаемадзеяння з заменай аланіну таксама прывядзе да павышэння кааператыўнасці. Аднак назіраецца зніжэнне кааператыўнасці дымера 123A/123A (мал. 5Е). Тлумачэнне заключаецца ў тым, што дэстабілізацыйны эфект размяшчэння гідрафобных рэшткаў у гідрафільнай асяроддзі можа перавесці стабілізацыйны эфект з -за ліквідацыі адштурхвальнай узаемадзеяння паміж рэшткамі D123, што прывядзе да агульнага зніжэння звязвання кааператыўнасці.mony і інш. Палажэнне D171 Coiona Gutis CI-HV1 (адпавядае D123 у HV1 чалавека) павялічваецца пры актывацыі, падтрымліваючы меркаванне, што D123 знаходзіцца ў гідрафільнай асяроддзі ў адкрытым стане. Вядома, што рашотка каналаў HV1 адбываецца праз некалькі пераходаў19,20,26,39,40,41.QIU і інш. , з наступным выразнае пераход, які прымушае пратонаў адкрыць праводнасць у абедзвюх субадзінках. Абурэнне флуарэсцэнтнага сігналу адпавядае наяўнасці электрастатычных узаемадзеянняў паміж рэшткамі D171 сумежных субадзінак у нейкі момант уздоўж каардынатаў рэакцыі канформацыйных зменаў. Гэта інтэрпрэтацыя адпавядае нашаму высвятленню, што рэшткі D123 узаемадзейнічае ў адкрытым дзяржаўным дзяржаўным стане ў адкрытым дзяржаўным дзяржаўным дзяржаўным стане. і апасродкуе аллостерическую сувязь паміж сайтамі звязвання GBTA. Fujiwara et al25 выказаў здагадку, што інтэрфейс дымера цытаплазматычнага дамена з шпулькай распаўсюджваецца на мембрану, каб утрымліваць дзве спіралі S4 (мал. 7, б, левая панэль). Мадэль гэтага міжсубунітавага ўзаемадзеяння заснавана на аналізе цыстэіну, які ахоплівае аналіз, які ахоплівае аналіз, які ахоплівае цыстэін Увесь VSD і функцыянальны аналіз вобласці, якая злучае спіраль S4 і CCD. У адсутнасці трансмембраннага градыенту рН, каналы HV1 патрабуюць значнай дэпалярызацыі мембраны, а для адкрыцця цыстэіна адбываецца пры ўмовах, калі канал пераважна закрыты. Такім чынам, выяўлены інтэрфейс S4-S4, верагодна, адлюстроўвае канфігурацыю субадзінкі. Закрытыя дзяржавы, ідэя, якая адпавядае высновам Mony et al. S1 перамяшчаецца 39 падчас рады. Тут мы паказваем, што ў адкрытым стане пазаклеткавыя канцы спіралі S1 досыць блізкія, каб падтрымаць прамыя электрастатычны Акрамя адзін аднаго, каб непасрэдна ўзаемадзейнічаць. Аднак 20 ° кручэнне па гадзіннікавай стрэлцы дзвюх субадзінак VSD вакол восі перпендыкулярна да мембраннай плоскасці ў спалучэнні з аддзяленнем знешніх канцоў двух спіраляў S4, давалі канфігурацыю S1-S1, паслядоўная паслядоўна з нашымі высновамі (мал. 7, правая панэль). Мы рэкамендуем гэтую канфігурацыю для канала ў адкрытым стане. Хоць, як лічыцца, фермент CIVSP функцыянуе як манамер, крыштальная структура яго ізаляванага vsd захоплена ў стане дымера. Знешнія канцы спіраляў S1 у гэтым дымеры прасторава блізка да аднаго, а агульная канфігурацыя падобная на прапанаваную прапанаваную прапанаваную Для HV1 (мал. 7С). і дымеры CIVSP дазваляюць выказаць здагадку, што ВСД гэтых бялкоў маюць унутраную тэндэнцыю ўтвараць інтэрфейс, дзе ўзаемадзейнічаюць пазаклеткавыя канцы S1. Было паказана, што істотная роля HV1 у актывацыі спермы робіць гэты канал прывабнай мэтай для кантролю ўрадлівасці мужчын. Было паказана Выжывальнасць у пацыентаў з малочнай залозай 12 або рака прамой кішкі 13 і, як мяркуецца, спрыяе злаякасным участкам В-клетак 11. Такім чынам, дробныя малекулы прэпараты, накіраваныя на HV1 Адкрытая субадзінка HV1, што прывядзе да павышэння сродства звязвання, можа прывесці да развіцця больш магутных лекаў, накіраваных на каналы HV1. Мутагенез HV1, накіраваны на сайт, праводзіўся з выкарыстаннем стандартных метадаў ПЦР. У канструкцыі HV1NCCIVSP рэшткі 1-96 і 228-273 HV1 былі заменены рэшткамі 1-113 і 240-576 з CIVSP18.IN. the C-terminus of one subunit is linked to the N-terminus of the second subunit through the GGSGGSGGSGSGGSGG linker.The pGEMHE plasmids containing the various constructs were linearized with Nhe1 or Sph1 restriction enzymes (New England Biolabs) and RNA synthesis was performed with the T7 MMESSAGE MMACHINE Transprise Kit (Ambion) .1-3 дні да электрафізіялагічных вымярэнняў, CRNA ўводзілася ў яйкаклеткі ксенопуса (50 нл на клетку, 0,3-1,5 мкг/мкл). Стап-V і VI Oocytes з ксенопуса (NASCO) атрыманы (NASCO) З Ecocyte Bioscience.Shollowing РНК -ін'екцыі клеткі падтрымлівалі ў асяроддзі ND96, якая змяшчае 96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1,8 мМ CACL, 1 мМ MGCL, 10 мМ HEPES, 5 мМ пірувату, 100 мкг/мл гентаміцыну, рн 7,2 18 ° C. . 2-гуанідына-бензімідазол [1], 2-гуанідына-бензотиазол [2], (4-метил-1,3-тиазол-2-іл) гуанідын [5], (5-бром-4-метил-1,3 -THIAZOL-2-іл) гуанідын) [6], этыл 2-гуанідына-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксілат [8], этыл 2-гуанідына-4-метил-1,3-тиазол-- 5-карбоксілат [9] і (2-гуанідына-4-метил-1,3-тиазол-5-іл) этылацэтат [10] былі з Sigma-Aldrich.Famotidine [7], былі з MP Biomedicals.1- [4 4 -(4-хлорфеніл) -1,3-тиазол-2-іл] гуанідын [11] і 1- [4- (3,4-диметоксифенил) -1,3- тиазол-2-іл] гуанідын [12] быў з матрыцы Scientific. Гэтыя злучэнні маюць найвышэйшую чысціню ў продажы. Яны былі распушчаны ў сухім DMSO, каб стварыць 100 -мм акцыянерны раствор, які быў разведзены ў растворы для запісу ў патрэбнай канчатковай канцэнтрацыі. Па меншай меры 99% чысціні. Да завісі 2-аміна-4- (трыфторметил) бензонетиол гідрахларыд (1,02 г, 4,5 ммоль) у 25 мл воднай салянай кіслаты (2,5 Н) дадаюць цвёрды дициандиамид (380 мг, 4,5 ммоль) і атрыманая гетэрагенізаваная сумесь, якая атрымала гетэрагенію быў рэфлюкс з энергічным памешваннем на працягу 4 гадзін. Рэакцыйную сумесь астуджаюць да пакаёвай тэмпературы і нейтралізавалі паступовым даданнем 10N гідраксіду калія. Утвараюць белы асадак, фільтруюць, прамываюць халоднай вадой (3 × 50 мл), высушаны ў духоўцы ( 65 ° С) на працягу некалькіх гадзін, а затым перакрышталізаваны з этылацэтата/нафтавага эфіру, каб даць белае цвёрдае рэчыва (500 мг, 48 %); MP 221–222 ° C (святло 225–226 ° С) 45; 1Н ЯМР (500 МГц, DMSO-D6): δ [праміле] = 7,25 (вельмі шырокі S, 4 H), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Гц), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d , = 272 Гц), 126,1 (q, j = 272 Гц) = 31,6 Гц), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.hrms (ESI): M/Z разлічанае значэнне. Для C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, зыходзячы : 261.0419. Нафто [1,2-D] тиазол-2-амін (300 мг, 1,5 ммоль), сінтэзаваны, як было апісана раней, награваюць да 200 ° С у алейнай лазні ў невялікай выпрабавальнай трубцы.300 мг (вялікае лішак) цианаміду і цианаміду і 1,0 мл cont.to гарачае злучэнне хутка дадаюць саляную кіслату, а сумесь захоўваюць у алейнай лазні каля 2 хвілін, за гэты час большая частка вады выпараецца. Рэакцыйную сумесь астуджаюць да пакаёвай тэмпературы, а ў выніку зацвярдзелы матэрыял умацаваны матэрыял, а ў выніку зацвярдзелы матэрыял, які застыў, і атрыманы зацвярдзелы матэрыял. разбіты на невялікія кавалачкі і прамываюць вадой, каб забяспечыць бледна-жоўтае аморфнае цвёрдае рэчыва (38 мг, 10%) MP 246-250 ° C; 1Н ЯМР (500 МГц, DMSO-D6, D2O): δ [праміле] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Гц), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Гц), 7,77 (d, 1 h, 1 h , MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169.1.hrms (ESI): M/Z разлічваецца. , знойдзена: 243.0704. Пратонныя токі вымяраліся ва ўнутраных і знешніх плямах яйкаклетак, якія экспрэсуюць розныя канструкцыі з выкарыстаннем Axopatch 200B ўзмацняльніка, які кантралюецца Axon Digidata 1440A (малекулярныя прылады) з праграмным забеспячэннем PCLAMP10.INTRACELLULAL і пазаклеткавых раствораў, якія маюць аднолькавую кампазіцыю: 100 мм 2- (N-MORPHOLINO )ethanesulfonic acid (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM TEA chloride, 5 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), adjusted to PH 6,0 з гідраксідам чайнага. Усе вымярэнні праводзіліся пры 22 ± 2 ° С. Піпетка мае ўстойлівасць да доступу 1,5–4 МОм. ) і Origin8.1 (OriginLab). Рашэнні, якія змяшчаюць розныя канцэнтрацыі інгібітараў HV1, а ў некаторых выпадках 10 мМ βME былі ўведзены ў ванну шляхам цяжару праз калектар, падлучаны да сістэмы перфузіі VC-6 (Warner Instr.), якая была перададзена праз праграмнае забеспячэнне PCLAMP TTL (Transistor- Транзістарныя логікі) Сігналы. Раскапідныя перфузійныя эксперыменты праводзіліся з выкарыстаннем мульты-трубнага перфузійнага алоўка (аўтаматызаванае навук) з наканечнікам дастаўкі дыяметрам 360 мкм, усталяваным перад патчам піпеткі. +120 мВ -дэпалярызацыі вымярэнняў pulse.gv праводзіліся, як было апісана раней18,20. Старысты былі зафіксаваны пры -40 мВ пасля этапаў дэпалярызацыі пры розных напружаннях ад -20 мВ да +120 мВ, калі не пазначана іншае. Эталоннае імпульс, які папярэднічае выпрабавальнаму імпульсу Выкарыстоўваецца для выпраўлення для распаду току 18. Графік GV падыходзіць да раўнання Больцмана: відавочныя канстанты дысацыяцыі (KD) для розных камбінацый каналаў і інгібітараў (дадатковая табліца 1) вызначаліся шляхам усталявання канцэнтрацыйнай залежнасці ад тармажэння (сярэдняе значэнне З раўнаннем пагорка: дзе [i] з'яўляецца канцэнтрацыя інгібітараў I і H - гэта каэфіцыент пагорка. Для вылічэння каэфіцыента ўзгорка ўраўненне (2) перастаўляецца як: