Ispitivanje interpodjediničnog interfejsa otvorenog Hv1 protonskog kanala sa alosterično spregnutom sondom

Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako biste osigurali nastavak podrške, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta. Hv1 voltazijski protonski kanal je dimerni kompleks koji se sastoji od dvije domene osjetljive na napon (VSD), od kojih svaka sadrži put protonske permeacije zatvorenog tipa. Dimerizaciju kontrolira citoplazmatski coiled-coil domen. Prijelaz iz zatvorenog stanja u poznato je da se otvoreno stanje u oba VSD-a javlja kooperativno; međutim, malo se zna o osnovnim mehanizmima. Interfejsi međujedinica igraju ključnu ulogu u alosterijskim procesima; međutim, takvi interfejsi nisu identifikovani u otvorenim Hv1 kanalima. Ovde pokazujemo da derivati ​​2-gvanidinotiazola blokiraju dva Hv1 VSD na kooperativan način i koriste jedno od ovih jedinjenja kao sondu za alosterično spajanje između otvorenih podjedinica. Otkrili smo da je ekstracelularno kraj prvog transmembranskog fragmenta VSD formira međupodjedinični interfejs koji posreduje u vezivanju između mesta vezivanja, dok domen namotane zavojnice nije direktno uključen u ovaj proces. Takođe smo pronašli jake dokaze da protonski selektivni filter kanala kontroliše kooperativnost vezanja blokatora . Naponski protonski kanali igraju važnu ulogu u različitim organizmima, od fitoplanktona do ljudi1. U većini ćelija, ovi kanali posreduju efluks protona iz protonske membrane i regulišu aktivnost NADPH oksidaze. Jedini poznati protonski kanal zavisan od napona kod ljudi je Hv1, koji je proizvod HVCN1 gena2,3. Pokazalo se da Hv1 (aka VSOP) igra ulogu u proliferaciji B ćelija4, proizvodnji reaktivnih vrsta kiseonika od strane urođenog imunološkog sistema5,6,7,8, spermatozoida pokretljivost9 i regulacija pH površinske tečnosti disajnih puteva10. Ovaj kanal je uključen u nekoliko prekomjerno izraženih tipova karcinoma kao što su maligni tumori B-ćelija4,11 i karcinom dojke i kolorektalnog karcinoma12,13. Utvrđeno je da prekomjerna aktivnost Hv1 povećava metastatski potencijal ćelija raka 11, 12. U mozgu je izražen Hv1 mikrogijom, a pokazalo se da njegova aktivnost pogoršava oštećenje mozga na modelima ishemijskog moždanog udara. Hv1 protein sadrži domen osjetljiv na napon (VSD), koji se sastoji od četiri transmembranska segmenta nazvana S1 do S414. VSD podsjeća na odgovarajuće domene naponski reguliranih Na+, K+ i Ca2+ kanala i fosfataza osjetljivih na napon, kao što je CiVSP iz Ciona gutis15. U ovim drugim proteinima, C-terminus S4 je vezan za efektorski modul, domen pora ili enzim. U Hv1, S4 je vezan za coiled-coil domen (CCD) koji se nalazi na citoplazmatskoj strani membrane Kanal je dimerni kompleks koji se sastoji od dva VSD-a, od kojih svaki sadrži put protonske permeacije zatvorenog tipa16,17,18. Utvrđeno je da se ove dvije Hv1 podjedinice otvaraju kooperativno19,20,21,22, što sugerira da alosterično spajanje i interakcije među podjedinicama igraju važnu ulogu u procesu gajtinga. Interfejs između podjedinica unutar domene namotane zavojnice je dobro definiran jer su kristalne strukture dvije izolirane domene dostupne22,23. S druge strane, interfejs između VSD unutar membrane nije dobro shvaćena. Kristalna struktura himernog proteina Hv1-CiVSP ne pruža informacije o ovom interfejsu, jer trimerna organizacija kompleksa kristalizovanih kanala može biti rezultat zamene prirodnog Hv1 CCD kvasca leucinskim patent zatvaračem GCN424. Nedavna studija organizacije podjedinica kanala Hv1 zaključila je da dvije spirale S4 prelaze u CCD bez ozbiljnog poremećaja sekundarne strukture, što rezultira dugim spiralama koje počinju od membrane i projektuju se u citoplazmu. Na osnovu analize umrežavanja cisteina, ova studija predlaže da Hv1 VSD-ovi međusobno kontaktiraju duž segmenta S4. Međutim, druge studije su predložile alternativna sučelja između VSD-ova. Ova sučelja uključuju S1 segmente 17, 21, 26 i vanjske krajeve S2 segmenta 21. Mogući razlog za sukob rezultati ovih studija su da je alosterična sprega između VSD-a ispitivana u odnosu na proces gajtinga, koji zavisi od zatvorenog i otvorenog stanja, a interfejs između VSD-a može varirati u različitim promenama stanja u konformaciji. Ovdje smo otkrili da 2-gvanidinotiazol inhibira Hv1 kanale sinergističkim vezanjem za dva otvorena VSD-a i koristili smo jedno od jedinjenja, 2-gvanidinobenzotiazol (GBTA), da ispitamo interakciju između podjedinica u otvorenom stanju. Otkrili smo da se kriva GBTA vezivanja može dobro opisati kvantitativnim modelom u kojem vezivanje inhibitora za jednu podjedinicu rezultira povećanjem afiniteta vezivanja susjedne podjedinice. Također smo otkrili da ostaci D112, filteri selektivnosti za kanali 27, 28 i dio vezivnog mjesta 29 derivata gvanidina kontroliraju kooperativnost vezivanja GBTA. Pokazali smo da se kooperativno vezivanje održava u Hv1 dimeru, gdje se CCD odvaja od segmenta S4, što sugerira da međupodjedinični interfejs u CCD-u nije direktno posreduju alosterično spajanje između GBTA-vezujućih mjesta. Nasuprot tome, nalazimo da je S1 fragment dio interfejsa između podjedinica i predlažemo raspored susjednih VSD-ova s ​​ekstracelularnim krajem S4 heliksa udaljenim od centra dimera kako bi se omogućilo da fragment S1 bude u otvorenom stanju. Inhibitori malih molekula Hv1 korisni su kao lijekovi protiv raka i neuroprotektivni agensi. Međutim, do danas je nekoliko spojeva bilo u stanju da inhibiraju kanal 30,31,32,33. Među njima, 2-gvanidinobenzimidazol (2GBI, spoj [1] na sl. 1a) i njegovih derivata je utvrđeno da blokiraju VSD29,32 prodiranje protona kroz kanal. Smatra se da se vezivanje takvih jedinjenja odvija nezavisno u dvije otvorene podjedinice. 2-gvanidinobenzotiazol (GBTA, spoj [2] na slici 1a). prethodno je pokazano da inhibira Hv1 gotovo jednako efikasno kao 2GBI kada je testiran pri koncentraciji od 200 μM (slika 1b). Ispitivali smo druge derivate tiazola i otkrili da neki od njih inhibiraju kanal sa sličnom ili većom potencijom od GBTA (slika 1 i dopuna). tekst). Odredili smo krivulje koncentracijskog odgovora četiri derivata tiazola (GBTA i spojeva [3], [6] i [11], slika 1c) i utvrdili da su strmije od onih kod 2GBI. Hill koeficijenti (h) derivata tiazola kretao se od 1,109 ± 0,040 do 1,306 ± 0,033 (Sl. 1c i dopunska slika 1). Nasuprot tome, Hill koeficijent za 2GBI bio je 0,975 ± 0,024 29, slika 2a i dopunska slika 1). Hill koeficijent iznad 1 ukazuje na kooperativnost vezivanja. Zato što svaka Hv1 podjedinica ima svoj inhibitor- vezno mjesto,29,32 zaključili smo da bi vezivanje derivata tiazola za jednu podjedinicu moglo poboljšati vezivanje drugog inhibitornog molekula za susjednu podjedinicu. GBTA je bio test jedinjenje s najvišim Hillovim koeficijentom. Stoga smo odabrali ovo jedinjenje za dalje proučavati mehanizam sinergije vezivanja i koristio 2GBI kao referentnu negativnu kontrolu. (a) Test jedinjenja: [1] Referentni inhibitor Hv1 2-gvanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-gvanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)gvanidin, [4] nafto[1,2-d][1, 3] tiazol-2-il -gvanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)gvanidin, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)gvanidin, [7] famotidin, [8] etil ester 2-gvanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilne kiseline, [9] 2-gvanidino-4-metil etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10 ](2-gvanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil acetat, [11]1-[4-(4-klorofenil)-1,3-tiazol-2-il]gvanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]gvanidin .(b) Inhibicija aktivnosti humanog Hv1 naznačenim gvanidinotiazolima i referentnim jedinjenjem 2GBI (plavo-zelene trake) .Hv1 protonske struje mjerene su u plakovima iznutra napolje Xenopusovih oocita kao odgovor na depolarizaciju sa potencijala zadržavanja od -80 mV do +120 mV. Svaki inhibitor je dodan u kadu u koncentraciji od 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Podaci su srednja vrijednost±SEM (n≥4).(c) Inhibicija humanog Hv1 zavisna od koncentracije jedinjenjima [2], [3], [6] i [11]. Svaka tačka predstavlja srednju inhibiciju ± SD od 3 do 15 merenja. Linija je uklapanje po brdu koja se koristi za dobijanje prividnih vrijednosti Kd prijavljene u dodatnoj tabeli 1. Hill koeficijenti su određeni iz uklapanja navedenih na dodatnoj slici 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (vidi Metode). (a,b) Jedinjenja 2GBI i GBTA inhibirala su dimerni i monomerni Hv1 na način ovisan o koncentraciji. Svaka tačka predstavlja srednju inhibiciju ± SD od 3 do 8 mjerenja, a kriva je uklapanje Hilla. Hill koeficijenti (h) prikazani u umetnuti histogrami su određeni iz uklapanja prijavljenih na dodatnim slikama 3 i 4. Odziv koncentracije GBTA prikazan na (a) je isti kao onaj na slici 1c. Vidi dodatnu tabelu 1 za prividne vrijednosti Kd. (c) Modeliranje kooperativno vezivanje GBTA za dimerni Hv1. Puna crna linija predstavlja uklapanje eksperimentalnih podataka po jednadžbi (6), koja opisuje model vezivanja prikazan u (d). Isprekidane linije označene Sub 1 i Sub 2 predstavljaju bimolekularnu asocijaciju -krive ravnoteže disocijacije prvog i drugog događaja vezivanja, respektivno (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Šematski dijagram predloženog mehanizma Hv1 bloka. U slučaju GBTA, vezivanje za jednu otvorenu podjedinicu povećava afinitet susjedne otvorene podjedinice (Kd2 0,05) smanjenje Hill koeficijenta vezivanja GBTA za GGG kanale u poređenju sa divljim tipom (slika 5c), što ukazuje na to da uprkos njegovoj ulozi u održavanju. dvije podjedinice zajedno važne, ali CCD ne posreduje direktno međupodjediničnom alosteričnom spajanju između GBTA veznih mjesta. (a) Šematski dijagram Hv1 dimera sa mutacijom triglicina na unutrašnjem kraju S4 dizajniranog da poremeti spajanje međupodjedinica posredovano domenom citoplazmatske spiralne spirale (plave strelice). (b) Šematski prikaz dimera Hv1 i dimera ligacije sa naznačene mutacije, dizajnirane da testiraju S1 fragmente uključene u spajanje između podjedinica (plave strelice). (c–h) 2GBI (cijan) i GBTA (tamno crvena) inhibiraju naznačene konstrukte na način ovisan o koncentraciji. Svaka tačka predstavlja srednju inhibiciju ± SD od 3 do 10 mjerenja. Kriva je bila uklapanje Hill-a koja se koristila za dobijanje očiglednih vrijednosti Kd (vidi dodatnu tabelu 1). Hill koeficijenti u interpoliranim histogramima određeni su kako je opisano u odjeljku Metode (vidi dodatne slike 3 i 4). Referentne vrijednosti h za Hv1 WT prikazani su kao isprekidane linije. Zvjezdica označava statistički značajne razlike između mutantnih i WT pasaža (p 0,05, slika 5d,i) ). S druge strane, mutacija D123A značajno je smanjila Hill koeficijent GBTA (p 0,05/14). Budući da je neutralizacija naboja na poziciji 123 na obje podjedinice rezultirala snažnom promjenom u kooperativnosti vezivanja GBTA, dok je obrnuti naboj na obje podjedinice imao samo mali učinak, proširili smo analizu tako da uključimo samo jednu podjedinicu sa inverzionim kanalom naelektrisanja. generirali su Hv1-povezane dimere sa supstitucijom D123R u C-terminalnoj podjedinici (slika 5b) i izmjerili inhibiciju koncentracijskog odgovora od strane GBTA i 2GBI. Otkrili smo da je Hill koeficijent GBTA vezivanja za WT-D123R kanale bio značajno veći od onog divljeg tipa Hv1 (p 0,05). Takođe smo otkrili da je u odsustvu βME Hill koeficijent GBTA vezivanja za D112E I127C Hv1 dimer bio značajno veći od onog izmerenog u prisustvu redukcionih agenasa (slika 6e i dodatna slika 4), što implicira da je mutacija D112E nije ukinuo povećanje kooperativnosti vezivanja GBTA koje je rezultat unakrsnog povezivanja cisteina 127. Hill koeficijent vezivanja 2GBI za D112E, I127C Hv1 dimere također nije značajno utjecao mutacijom D112E (slika 1).6d i dopunski. Slika 3). Uzeti zajedno, ovi nalazi sugeriraju da je GBTA vezivanje pojačano interakcijom između vanjskih krajeva S1 fragmenata u susjednim Hv1 podjedinicama kroz atraktivne elektrostatičke interakcije ili kroz formiranje kovalentnih veza između supstituiranih cisteina Alosterično spajanje između mjesta se povećava i rezultira kooperativnošću vezivanja. Dok se efekat privlačnih elektrostatičkih interakcija na kooperativnost može ukinuti mutacijom D112E, efekat kovalentnih veza ne može. U našem istraživanju hemijskog prostora dostupnog za vezivanje derivata gvanidina na kanale Hv1, otkrili smo da 2-gvanidinotiazoli poput GBTA imaju strmiju koncentracijsku zavisnost od 2-gvanidinobenzimidazola (slika 1c). Analiza Hill koeficijenta vezivanja GBTA za oba dimera i monomernih kanala (slika 2a,b) i dimernog kanala u kojem je jedna podjedinica bila prethodno vezana za inhibitor (slika 4) doveli su do zaključka da je inhibicija Hv1 od strane GBTA Djelovanje sinergistički proces, i Vezna mjesta jedinjenja u dvije podjedinice su alosterički povezana. Otkriće da se GBTA vezuje za otvoreni kanal, kao što je prethodno pokazano za srodno jedinjenje 2GBI32, sugerira da se alosterično spajanje može posebno procijeniti u otvorenom stanju. Naš kooperativni model vezivanja Mogao je kvantitativno opisati inhibiciju HV1 od strane GBTA-e (Sl. 2c) i objasniti različite efekte 2GBI i GBTA u propadanju repnih struja kanala nakon repolarizacije membrane, što podržava naše tumačenje procesa vezivanja. Maksimalni koeficijent brda koji se može postići u alosenskom proteinu sa dva vezna mjesta (kao što je HV1) je 2. Mi se izmjerila GBTA za vezanje HV1 divlje vrste s koeficijentom od 1,88 u HV1 I127C. Sinergistička besplatna energija, razlika između obvezujućih energija na najnižoj i najvišim afinitetima (vidi metode), iznosila je 1,3 kcal / kla u slučaju HV1 divljih vrsta i 2,7 kcal / kla u slučaju HV1 I127C. Kiseonik za hemoglobin najpoznatiji je i dobro proučeni primjer suradničkog procesa38.Za ljudski hemoglobin (tetramer sa četiri alozesterično povezane veznih mjesta), koeficijent brda se kreće od 2,26 do 3,64 Kcal / MOL, ovisno o eksperimentalnim uvjetima38. Thus, u pogledu globalne energetike, zadruga GBTA obvezujućeg na HV1 nije značajno različita od o2 obvezujuća za hemoglobin kada se razmatra različita broja suzbijanja proteina u dva sustava u dva sustava. U našem sinergijskom modelu, vezanje molekula GBTA na jednu podjedinicu rezultira povećanje obvezujućeg afiniteta susjedne podjedine. Zamišljamo proces u kojem dovodi do preugovaravanja obveznog okruženja koji proizlazi iz prvog obvezujućeg događaja (indukovanog fit) dovodi do Promjene u interakcijama između podujedinica. Odgovor na ove promjene, susjedne podjedinice mijenjaju svoje vežejuće stranice, što rezultira čvršćim veznicom za GBTA.Duriranje ovog procesa odgovoran je za preuređivanje veznog mjesta povezano sa povećanim vezama za vezanje.d112 Prethodno je pokazalo da je dio protona protona HV1 i da djeluje kao filter za selektivnost27,28. Naši rezultati pokazuju da se filteri selektivnosti u dvije sustave u HV1 u zatvorenom stanju. Otvori se prikazuje približnu lokaciju veznog mjesta za vezanje GBTA i lokacija ostataka D112, D123, K125 i I127 na shemu HV1 zasnovane na shemu HV1 VSD-a Na kristalnoj strukturi HV1-CIVSP Chimera.Sugged upute za alosterično spajanje koje uključuju vanćelijski kraj S1 prikazani su crnim strelicama. (a) Shematski HV1 VSD.Sased na kristalnoj strukturi HV1-CIVSP himere, pokazuju se da su spilični segmenti cilindrični.U ovoj konfiguraciji, unutrašnji kraj segmenta S4 spaja se sa CCD-om (nije prikazano). Predviđene lokacije vezane GBTA prikazuju se kao sivi olami. Strelice označavaju staze koje su uključene u alosterično spajanje između veznih mjesta u dva susjedna podjedinica. (B) shematskim shemenim shemima raspoređenim ugrađenim na ilustraciji HV1 U dvije različite dimerske konfiguracije koje se vide sa vanjčeline strane membranske ravni. Dimer ploče formira se dimer sučelje S4 Helix.Rotacija dva VSDS 20 stepeni oko osi oko dnu okomito u ravninu membrane, popraćena Razdvajanje vanjskih krajeva suklih s S4 (isprekidane strelice), proizvodi se aranžman prikazan na desnoj strani. U ovoj konfiguraciji, ostaci D123 i I127 iz susjednih podjedinica mogu se približiti zajedno. (c) Shematski prikaz CIVSSP VSD U dimerskoj konfiguraciji koja se nalazi u 4G80 kristalnoj strukturi. Postavljanje P140 u CIVSP-u odgovara poziciji D123 u HV1. Naši rezultati pokazuju da je odbojna elektrostatska interakcija između ostataka 123 (123d / 123R) povezana s "normalnim" razinama obvezujuće zadruge u otvorenom stanju i smjene interakciju od odbojnosti na privlačenje (123d / 123R) , Očekuje se da će povećana saradnja (Sl. 5g). Da bi se uklanjanje odbojne interakcije sa alaninskom supstitucijom takođe dovelo do povećane kooperativnosti.Kako je opaženo smanjenje kooperativnosti dimera 123a / 123a (Sl. 5E). Moguće je Objašnjenje je da destabiliziranje učinka stavljanja hidrofobnih ostataka u hidrofilnom okruženju može nadmašiti stabilizacijski učinak zbog eliminacije odbojnih interakcija između D123 ostataka, što rezultira ukupnim smanjenjem obvezujućeg suradnje. Nedavno je izvijestio da je nedavno izvijestila da pristupačnost otapala na Pozicija D171 Ciona GUTIS CI-HV1 (koja odgovara D123 u ljudskom HV1) povećava se nakon aktiviranja, podržavajući pojmu da se D123 nalazi u hidrofilnom okruženju u otvorenom stanju. Poznato je da se pojavljuje sa više tranzicija HV119.2019,26,39,40,41.QIU i AL26 utvrđeno da se na depolarizaciji membrana, senzor napona CI-HV1 podvrgava konformacijsku promjenu koja ostavlja aktiviran kanal, ali još uvijek je zatvoren , nakon čega slijedi izrazit tranzicija koji uzrokuje protoke u oba subunta puta. Konformativna promjena naponskog senzora nadgledana je fluorescencijom za stezanje napona, a otkrivena je da je druga tranzicija bile selektivno uznemireno u položaju D171. Pobritavanje fluorescentnog signala u skladu je s prisustvom elektrostatičkih interakcija između D171 ostataka susjednih podjedinica u nekom trenutku reakcijske koordinate koordinacije konformacijske promjene. Ova interpretacija je u skladu s našim nalazom da D123 ostaci elektrostatički u interakciji u otvorenom stanju i posreduje alosterično spajanje između veb lokacija za vezanje GBTA. Fujiwara i AL25 je predložio da se dimer interfejs citoplazmatskog namotanog zavojnice prostire u membranu da sadrži dva S4 helikopcija (Sl. 7b, lijeva ploča) .a model ove intersubunitske interakcije zasnovan je na prekrivanju cisteina Cijela VSD i funkcionalna analiza regije koja povezuje S4 Helix i CCD.Nas Nepostojanje transmembranskog pH gradijenta, HV1 kanali zahtijevaju značajnu depolarizaciju membrane za otvaranje, a cisteine ​​se pojavljuju pod uvjetima gdje se kanal pretežno zatvori. Stoga je otkrivena sučelja S4-S4-a koji će vjerovatno odražavati konfiguraciju podstanarnog subventa. Godine ispitivanja su pronašle dokaze za uključivanje S1 i S2 u inteRSUBUNIT interakcijama tokom Gating-a17,21,26 sugerirajući da kanali mogu usvojiti različite subvenciona konfiguracije na otvorenom i Zatvorene države, ideja u skladu sa nalazima Mony i sur. S1 se kreće 39 tokom kabine. Evo, u otvorenom stanju, vanćelijski krajevi S1 Helix-a su dovoljno blizu da podrže izravne elektrostatske interakcije koje posreduju alosterično spajanje između podjedinica.in-s4-s4 interakcije, suk Pored toga da se direktno komunicira. Koliko, rotacija dva VSD u smjeru kazaljke na satu oko osi oko osi, u kombinaciji s odvajanjem vanjskih krajeva helikojaca s dva S4, dala je konfiguraciju S1-S1 konfiguracije S našim nalazima (Sl. 7b, desna ploča). Preporučimo ovu konfiguraciju za kanal u otvorenom stanju. Iako se smatra da CIVSP enzim funkcionira kao monomer, kristalna struktura njegovog izoliranog VSD-a zarobljava se u dimernom stanju. Vanjski krajevi helikopcija S1 u ovom dimeru prostorno su bliski, a cjelokupna konfiguracija slična je toj predloženoj za HV1 (Sl. 7c). Civsp Dimer, najbliži ostaci sa susjedne podjedinice bio je prolin na položaju 140 (Sl. 7c). A CIVSP dimere sugeriraju da VSDS ovih proteina imaju unutarnju tendenciju da formiraju sučelje u kojem vanćelijski krajevi S1 interakcije. Suštinska uloga HV1 u spermij ćeliji čini ovaj kanal atraktivnom cilju droge za kontrolu muškog plodnosti. Pokazano je da se aktivira HV1 u Microglia-u iz mikroglika iz ishemijskog udara u okviru ishemijskog hoda. Preživljavanje kod pacijenata sa dojkama 12 ili kolorektalni karcinom 13 i smatra se da će doprinijeti malignitima B-ćelija 11.Po toga, mali molekulirni lijekovi koji ciljaju na HV1 ili antikancerontne terapeutike. Otkriće da ganidinothiazole derivati ​​mogu inducirati konformativne preuređenosti u Otvorite subunit za HV1, što dovodi do povećanog veznog afiniteta, može dovesti do izrade moćih lijekova koji ciljaju HV1 kanale. Mutageneza za ljudsku HV1 na mestom HV1 izvedena je koristeći standardne PCR tehnike. U CV1NCivSP Construct, ostaci 1-96 i 228-273 HV1 zamijenjeni su ostacima 1-113 i 240-576 CIVSP18.In, dimer povezanih HV1, C-Terminus jedne podjedinice povezan je sa N-Terminusom druge podjedinice kroz GGSGSGGSGSGGSGG Linker. Pgemhe plazmidi koji sadrže različite konstrukcije bili su linearizirani sa restrikcijskim enzimima od NHE1 ili SPH1 (Nova Engleska biolab) i RNA sinteza izvedena je s T7 MMessage Mmašinski komplet za transkripciju (ambiona) prije elektrofizioloških mjerenja, Crna je ubrizgavana u Xenopus Oocites (50 NL po ćeliji, 0,3-1,5 μg / μl). Dobiveni su i VI oociti iz Xenopusa Laevisa (NASCO) iz bioznanosti Ecocyte.Sleple RNA injekcije, stanice su održavane u ND96 Medijum sa 66 mm Nacl, 2 mm KCL, 1,8 mm CACL, 1 mm MGCL, 10 mm Pypes, 100 μg / ml Gentamicin, pH 7,2 18 ° C . 2-gunidino-benzimidazol [1], 2-gunidino-benzothiazole [2], (4-metil-1,3-Thiazol-2-Yl) Guanidin [5], (5-bromo-4 -Metil-1,3 -ToPol-2-yl) Guanidin) [6], Etil 2-Guanidino-5-metil-1,3-Thiazole-4-karboksilat [8], Etil 2-Guanidino-4- Metil-1,3-Thiazole- 5-karboksilat [9] i (2-gunidino-4-metil-1,3-tiazol-5-yl) etil acetat [10] bili su iz Sigma-Aldrich.famotidine [7] bio iz MP biomedicina.1- [4 - (4-klorofenil) -1,3-Thiazol-2-Yl] Guanidin [11] i 1- [4- (3,4-dimetikyphenil) -1,3- Thiazol-2-yl] Guanidin [12] iz matrične nauke.ta su jedinjenja najviši čistoć komercijalno dostupni. Oni su rastvoreni u suhom DMSO-u kako bi se stvorilo 100 mm zaliha, što je potom razblaženo u rješenju za snimanje na željenim završnim koncentracijama..Com-a u nastavku su sintetizirani u nastavku najmanje 99% čistoće. Do suspenzije 2-amino-4- (trifluorometil) benzenethiol hidroklorida (1,02 g, 4,5 mmol) u 25 ml vodene hlorovodorne kiseline (2,5 N) dodana je čvrsta disikandaiamide (380 mg, 4,5 mmol), te rezultirajuća heterogena smjesa bio je refluksiran s energičnim miješanjem 4 sata. Reakcijska smjesa hlađena je na sobnu temperaturu i neutralizirana postepenim dodavanjem 10n kalijskog hidroksida. Formiran bijeli talog (3 × 50 ml), sušenom u rernu ( 65 ° C) nekoliko sati, a zatim rekristalno iz etil acetata / nafte etera za bijelu solid (500 mg, 48%); MP 221-222 ° C (Svjetlo 225-226 ° C) 45; 1h NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7,25 (vrlo široko s, 4 h), 7,40 (D, 1 h, J = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,93 (D , 1 h, J = 8,1 Hz) .13c NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114.2 (D, J = 3,5 Hz), 117.5 (D, J = 3,5 Hz), 121.7, 124.6 (Q, J = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.hrms (ESI): M / Z izračunata vrijednost.Za (m + h) +: 261.0416, pronađena : 261.0419. Nafto [1,2-d] Thiazol-2-Amin (300 mg, 1,5 mmol), sintetizirano kao prethodno opisano, zagrijano je na 200 ° C u uljnoj kupki u malom testnom cijevi.300 mg (veliki višak) cijanamid i 1,0 ml sakrij je brzo je dodao hidrokloroničnu kiselinu, a smjesa je zadržana u uljnoj kupki oko 2 minute, tokom koje vrijeme većina vode isparila je i reakcijska smjesa zatim hlađena na sobnu temperaturu i rezultirajući učvršćenim materijalom razbijen je na male komade i opran vodom da bi pružio blijedo žutu amorfnu solidnu čvrstu čvrstu čvrstu čvrstu soliju. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1h NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7,59 (T, 1 h, J = 8,2 Hz), 7,66 (T, 1 h, J = 8,3 Hz), 7,77 (D, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 h, J = 8,6 Hz), 8.02 (D, 1 h, J = 8,2 Hz), 8.35 (D, 1 h, J = 8.3 Hz) .13c NMR (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119.4, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hms (ESI): M / Z izračunata vrijednost.Za C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , Pronađeno: 243.0704. Protone se mjere u unutrašnjim i vanjskim zakrpama oocita koji izražavaju različite konstrukcije pomoću Axopatch 200B pojačala koji kontrolira Axon Digidata 1440A (molekularni uređaji) sa PCLamp10 softverom. INTRACELLACELULARNA I EXTRACELLALULARNA REŠENJA imaju isti sastav: 100 mm 2- (n-morfolino) ) etanesulfonska kiselina (MES), 30 mm Tetraetilamonijum (čaj) Mesilat, 5 mm čajnik za čaj, 5 mm etilen glikol-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraočetske kiseline (EGTA), prilagođeno pH 6.0 sa čajnim hidroksidom. Slijede se mjere na 22 ± 2 ° C.Tepiranje za otpornost na pristup 1,5-4 mω.Trgovine tragove filtrirani su na 1 kHz, uzorkovanim na 5 kHz i analizirano sa Clampfit10.2 (molekularni uređaji ) i porijeklo8.1 (porijeklom). Rješenja koja sadrže različite koncentracije HV1 inhibitora i u nekim slučajevima, u kadu su u kadu uvedene u kadi gravitaciju kroz razvodnik spojen na sistem perfuzijske ventile VC-6 (Warner Instr.), Koji je proslijeđen putem PCLamp softvera TTL (tranzistor- Tranzistor Logic) Signali. Perfuzijski eksperimenti perfuzije izvedeni su pomoću perfuzijske olovke sa više cijevi (automatiziraju SCI.) Sa vrhom isporuke promjera 360 μm montiranog ispred inhibicije zakrva.Channel je određen izohronalnim amperometrijskim mjerenjima na kraju +120 MV Depolaring pulse.GV provedene su kao prethodno opisane iz18,20. reine su zabilježene na -40 mV nakon depolarizacijskih koraka na različitim naponima od -20 mV do +120 mV, osim ako nije drugačije navedeno. Referentni puls koji je prethodio ispitni puls Računat za trenutnu propadaju 18. GV graf odgovara Boltzmann jednadžbi: prividne konstante disocijacije (KD) za različite kombinacije kanala i inhibitora (dodatna tablica 1) utvrđena su ugradnja koncentracione ovisnosti o inhibiciji (srednja vrijednost) Sa brdom Jednadžba: Gdje je [i] koncentracija inhibitora I i H je koeficijent brda.to izračunavanje koeficijenta brda, jednadžba (2) se preuređuje kao: