Interrogazione di l'interfaccia intersubunità di u canale protonicu Hv1 apertu cù una sonda accoppiata allostericamente

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Quì avemu dimustratu chì i derivati ​​​​2-guanidinothiazole bluccanu dui VSD Hv1 in una manera cooperativa è utilizanu unu di sti cumposti cum'è sonda per l'accoppiamentu allostericu trà subunità aperti. A fine di u primu fragmentu transmembrana di VSD forma una interfaccia intersubunità chì mediate l'accoppiamentu trà i siti di ubligatoriu, mentre chì u duminiu di bobina in spirale ùn hè micca direttamente implicatu in stu prucessu. . I canali di protoni di voltage-gated ghjucanu un rolu impurtante in una varietà di urganismi, da u fitoplancton à l'omu. In a maiò parte di e cellule, questi canali mediate l'efflussu di protoni da a membrana protonica è regulanu l'attività di NADPH oxidase. hè Hv1, chì hè u pruduttu di u gene HVCN12,3.Hv1 (aka VSOP) hè statu dimustratu per ghjucà un rolu in a proliferazione di cellule B4, a produzzione di spezie di ossigenu reattivu da u sistema immune innate5,6,7,8, cellula sperma. a motilità9 è a regulazione di u pH di u fluidu di a superficia di a via aerea10. Stu canali hè implicatu in parechji Overexpressed in tipi di cancru cum'è B-cell malignities4,11 è pettu è culurite cancers12,13.Excessive Hv1 attività hè stata truvata per aumentà u putenziale metastatic di i celluli di cancru 11, 12 .In u cervellu, Hv1 hè spressu. da a microglia, è a so attività hè stata dimustrata per aggravà i danni cerebrali in mudelli di ictus ischemicu. A proteina Hv1 cuntene un duminiu di voltage-sensing (VSD), chì hè custituitu di quattru segmenti transmembrane chjamati S1 à S414. U VSD s'assumiglia à i domini currispundenti di i canali Na+, K+ è Ca2+ voltage-gated è fosfatasi sensibili à a tensione, cum'è CiVSP da Ciona gutis15.In questi altri proteini, u C-terminale di S4 hè attaccatu à un modulu effector, u duminiu di poru o enzima. .U canali hè un cumplessu dimericu custituitu di dui VSD, ognuna chì cuntene una strada di permeazione di protoni gated16,17,18.Questi dui subunità Hv1 sò stati truvati per apre in cooperativa19,20,21,22, chì suggerenu chì l'accoppiamentu allostericu è l'interazzione inter-subunità ghjucanu. un rolu impurtante in u prucessu di gating. L'interfaccia trà e subunità in u duminiu di bobina bobina hè ben definita perchè e strutture cristalline di i dui duminii isolati sò dispunibuli 22,23. Per d 'altra banda, l'interfaccia trà VSD in a membrana ùn hè micca. ben capitu.A struttura cristallina di a proteina chimerica Hv1-CiVSP ùn furnisce micca infurmazioni nantu à sta interfaccia, cum'è l'urganizazione trimerica di u cumplessu di u canali cristallizatu pò esse risultatu da a sustituzione di u CCD nativu Hv1 da u zipper leucine di levadura GCN424. Un studiu recente di l'urganizazione di subunità di u canali Hv1 hà cunclusu chì duie hélices S4 transizione in u CCD senza disrupzione severa di a struttura secundaria, risultatu in eliche longu chì partenu da a membrana è prughjettanu in u citoplasma. stu studiu prupone chì i VSD Hv1 cuntattate l'un l'altru longu u segmentu S4. Tuttavia, altri studii anu prupostu interfacce alternative trà i VSD. Queste interfacce includenu i segmenti S1 17, 21, 26 è l'estremità esterne di u segmentu S2 21. Un mutivu pussibule per u cunflittu. I risultati di sti studii hè chì l'accoppiamentu allostericu trà i VSD hè statu esaminatu in relazione à u prucessu di gating, chì dipende da i stati chjusi è aperti, è l'interfaccia trà VSD pò varià in diversi cambiamenti di statu in conformazione. Quì, avemu trovu chì 2-guanidinothiazole inibisce i canali Hv1 da u ligame sinergicu à dui VSD aperti, è hà utilizatu unu di i cumposti, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), per sonda l'interazzione trà subunità in u statu apertu. interfaccia.Avemu trovu chì a curva di ubligatoriu GBTA pò esse descritta bè da un mudellu quantitativu in quale ubligatoriu di un inhibitore à una subunità risultati in un aumentu di l'affinità di ubligatoriu di a subunità adiacente. canale 27, 28 è parte di u situ di ubligatoriu di u derivativu di guanidina 29 cuntrullanu a cooperatività di ubligatoriu GBTA. Mostremu chì u ligame cooperativu hè mantinutu in u dimeru Hv1, induve u CCD si separa da u segmentu S4, chì suggerenu chì l'interfaccia intersubunit in u CCD ùn hè micca direttamente diretta. mediate l'accoppiamentu allostericu trà i siti di ubligatoriu GBTA. In cuntrastu, truvamu chì u frammentu S1 hè parti di l'interfaccia trà e subunità è prupone un arrangiamentu di VSD adiacenti cù l'estremità extracellulare di l'helix S4 luntanu da u centru di u dimeru per permette. u frammentu S1 per esse in u statu apertu. L'inhibitori di molecule di Hv1 sò utili cum'è droghe anticancer è agenti neuroprotettivi. Tuttavia, finu à a data, pochi cumposti anu pussutu inibisce u canali 30,31,32,33. À mezu à elli, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, compostu [1] in Fig. 1a) è i so derivati ​​sò stati truvati per bluccà VSD29,32 permeazione di protoni à traversu u canali. U ligame di tali cumposti hè pensatu per esse indipindente in i dui subunits aperti.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, compostu [2] in Figura 1a) era. prima dimustratu per inibisce Hv1 guasi cum'è 2GBI quandu pruvatu à una cuncentrazione di 200 μM (Figura 1b). Avemu esaminatu altri derivati ​​​​thiazole è truvamu chì alcuni d'elli anu inhibitu u canali cù una putenza simile o più grande chì GBTA (Fig. 1 è Supplementary). testu).Avemu determinatu e curve di risposta di cuncentrazione di quattru derivati ​​di thiazole (GBTA è cumposti [3], [6] è [11], Fig. 1c) è truvaru chì eranu più ripidi di quelli di 2GBI.The Hill coefficients (h) di derivati ​​di thiazole variava da 1,109 ± 0,040 à 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c è Supplementary Fig. 1). In cuntrastu, u coefficient Hill per 2GBI era 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a è Supplementary Fig. 1). Un coefficient Hill sopra 1 indica a cooperatività di ubligatoriu. Perchè ogni subunità Hv1 hà u so propiu inhibitore- site di ubligatoriu,29,32 avemu ragiunatu chì u ligame di un derivativu di tiazolu à una subunità puderia rinfurzà u ligame di una seconda molècula inhibitore à a subunità adiacente.GBTA era u compostu di teste cù u coefficient Hill più altu. studià più u miccanisimu di sinergia di ubligatoriu è utilizatu 2GBI cum'è un cuntrollu negativu di riferimentu. (a) Test composti: [1] Riferimentu Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazole (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il) guanidina, [4] nafto [1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidina, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [7] famotidina, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazole-4-carbossilico estere etilico, [9] 2-guanidino-4-metiletil-1,3-tiazole-5-carbossilato, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etile acetato, [11]1-[4-(4-clorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina, [ 12] 1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine. (b) Inibizione di l'attività Hv1 umana da i guanidinothiazoles indicati è u compostu di riferimentu 2GBI (barre blu-verde) I currenti di protoni .Hv1 sò stati misurati in plaques inside-out di Xenopus oocytes in risposta à a depolarizazione da un putenziale di mantene di -80 mV à + 120 mV. Ogni inhibitore hè aghjuntu à u bagnu à una cuncentrazione di 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Data sò mean±SEM (n≥4).(c) Inibizione dipendente da a cuncentrazione di Hv1 umanu da cumposti [2], [3], [6] è [11].Ogni puntu rapprisenta l'inhibizione media ± SD di 3. à 15 misure. A linea hè una fitta di Hill utilizata per ottene i valori Kd apparenti riportati in a Tabella Supplementaria 1. I coefficienti di Hill sò stati determinati da l'adattamenti riportati in Fig. 0.033, h (3) = 1.25 ± 0.07, h (6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (vede Methods). (a, b) I composti 2GBI è GBTA inibite Hv1 dimericu è monomericu in modu dipendente da a cuncentrazione. Ogni puntu rapprisenta l'inhibizione media ± SD di 3 à 8 misure è a curva hè una fitta di Hill. I coefficienti Hill (h) mostrati in l'istogrammi inseriti sò stati determinati da l'adattamenti riportati in Figs Supplementari 3 è 4. A risposta di cuncentrazione di GBTA mostrata in (a) hè a stessa chì in a Fig. 1c.See Supplementary Table 1 for apparent Kd values. (c) u ligame cooperativu di GBTA à dimeric Hv1. A linea nera solida rapprisenta l'adattamentu à i dati sperimentali per l'equazioni (6), chì descrive u mudellu di ubligatoriu mostratu in (d). E linee tratteggiate marcate Sub 1 è Sub 2 rapprisentanu l'associazione bimolecular. -curve d'equilibriu di dissociazione di u primu è u secondu eventi di ligame, rispettivamente (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM; ).(d) Schematic diagram di u mecanismu prupostu di u bloccu Hv1.In u casu di GBTA, ubligatoriu à una subunità aperta aumenta l'affinità di a subunità aperta adiacente (Kd2 0,05) in u coefficient Hill di GBTA ubligatoriu à i canali GGG cumparatu cù u tipu salvaticu (Fig. 5c), chì suggerenu chì, malgradu u so rolu à mantene l'. duie subunità inseme impurtanti, ma CCD ùn media micca direttamente l'accoppiamentu allostericu intersubunità trà i siti di ubligatoriu GBTA. (a) Schema schematicu di u dimeru Hv1 cù una mutazione di triglicina à l'estremità interna di S4 cuncepitu per disturbà l'accoppiamentu intersubunità mediatu da u duminiu di bobina citoplasmatica (frecce blu). mutazioni indicati, cuncepitu per pruvà i frammenti S1 implicati in l'accoppiamentu trà subunità (frecce blu). (c–h) 2GBI (cian) è GBTA (russu scuru) inibiscenu i custruzzioni indicati in modu dipendente da a cuncentrazione. Ogni puntu rapprisenta l'inhibizione media. ± SD da 3 a 10 misure. A curva era una Hill fit aduprata per ottene i valori Kd apparenti (vede a Tabella Supplementaria 1). I coefficienti di Hill in l'istogrammi interpolati sò stati determinati cum'è descrittu in a sezione Metodi (vede Figs Supplementari 3 è 4). Riferimentu h valori per Hv1 WT sò mostrati cum'è linee tratteggiate. L'asterischi indicanu differenzi statisticamente significati trà i passaggi mutanti è WT (p 0.05, Fig. 5d, i). ). Per d 'altra banda, a mutazione D123A hà riduciutu significativamente u coefficient Hill di GBTA (p 0,05/14). Siccomu a neutralizazione di a carica in a pusizione 123 nantu à e duie subunità hà risultatu in un forte cambiamentu in a cooperatività di ubligatoriu GBTA, mentre chì l'inversione di a carica nantu à e duie subunità hà avutu solu un picculu effettu, avemu allargatu l'analisi per include una sola subunità cù u canali d'inversione di carica. generatu dimers Hv1-linked with D123R substitution in the C-terminal subunit (Fig. 5b) and measured the concentration-response inhibition by GBTA and 2GBI.We truvaru chì u coefficient Hill di GBTA ubligatoriu à i canali WT-D123R era significativamente più altu ch'è quellu. di Hv1 di tipu salvaticu (p 0.05). Avemu trovu ancu chì, in l'absenza di βME, u coefficient Hill di GBTA ligatu à u dimeru D112E I127C Hv1 era significativamente più altu ch'è quellu misuratu in presenza di agenti riducenti (Fig. 6e è Supplementary Fig. 4), chì implica chì a mutazione D112E. ùn hà micca abolitu l'aumentu di a cooperatività di ubligatoriu GBTA risultante da a cross-linking di cisteina 127. U coefficientu Hill di 2GBI binding to D112E, I127C Hv1 dimers hè statu ancu micca affettatu significativamente da a mutazione D112E (Figura 1).6d è Supplementary. Fig. 3). Inseme, questi risultati suggerenu chì l'associazione GBTA hè rinfurzata da l'interazzione trà l'estremità esterne di i frammenti S1 in subunità Hv1 adiacenti per interazzioni elettrostatiche attraenti o per a furmazione di legami covalenti trà cisteine ​​sustituite L'accoppiamentu allostericu trà i siti aumenta è risulta in cooperatività di legame. Mentre chì l'effettu di l'interazzioni elettrostatiche attrattivi nantu à a cooperatività pò esse abolitu da a mutazione D112E, l'effettu di i ligami covalenti ùn pò micca. In a nostra scuperta di u spaziu chimicu dispunibuli per ubligatoriu di derivati ​​di guanidine à i canali Hv1, avemu truvatu chì 2-guanidinothiazoles cum'è GBTA anu una dependenza di cuncentrazione più ripida di 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). L'analisi di coefficient Hill di GBTA ubligatoriu à i dui dimeric. è canali monomerichi (Fig. 2a, b) è à u canali dimeric in quale una subunità era pre-ligata à l'inhibitore (Fig. 4) hà purtatu à cuncludi chì l'inhibizione di Hv1 da GBTA L'azzione hè un prucessu sinergicu, è i siti di ubligatoriu di i cumposti in i dui subuniti sò allosterically accoppiati. A scuperta chì GBTA si lega à u canali apertu, cum'è prima dimustratu per u compostu ligatu 2GBI32, suggerisce chì l'accoppiamentu allostericu pò esse evaluatu specificamente in u statu apertu. hà sappiutu qualificatu quanti aibizione di Hv1 da Gbta (Fig. 2C) è spiegà e 2GBI nantu à a decadenza di a ripresa di u canale dopu à a nostra interpretazione di u prucessu di a membrana. A coccia massima chì pò esse ottenuta in una proteina allosterica cù dui siti di ligame) hè 2.Se misuratu à u coefficiente di 1.31, chì aumentata à Hv1 i127C. energia libera sinergica, a differenza trà i siti senza affinità di u più bassu è di u più altu), era 1,3 kCal / mole in u casu di Hv1 Wilight-Mole I127c.La di l'ossigenu à l'emoglobina hè più famosa un esempiu di colomu è ben amatu (un tetramo cù quattru beni di cucinata) - CLAL / MOL, secondu cundizioni sperimentale38. In u nostru mudellu di sinergia, u vigilatu di gbta moleculi à un subunitu risultati in un aumentu di l'affinità negra in u primu prucessu chì ci hè un adjunimentu di u primu postu (indipesu) porta Cambiamenti in l'interazzioni trà subunits.in risponde à questi cambiamenti, i sustiniti adiacenti cambianu i so siti di ligame, secondu questu prucessu di riescenza associata cù aumentata di ligame affinità.d112 hè stata prima dimustrata per esse parte di u chjassu di permeazione Hv1 Protozione è per agisce cum'è filtrettu di a selezzione. I nostri risultati mostranu chì i filati di a cena in i dui suntuniti di rivazioni sò allostericamente arruccate tutte e situ ultime 7a mostra u situ apprusimatu di u situ di GBTA, K125 è i11Vaticu di u basedinu di l'HV1 vsd Nantu à a struttura cristale di u Struttu HV1-Civp usati per accoppiamentu allostericu chì implicanu l'estremità extracellulare di S1 ​​sò mustrati cù frecce neri. (a) schematic di l'Hv1 vsft.Aase nantu à a struttura crestale di u Chimera HV1-Civp, sta configurazione, u CCD (micca dimustratu). I lochi previsti di Bully GBTA sò mustrati cum'è e frecce grigie.blackanu i chjassi in i residenti di i schi di u bughjone. (B) illustrazione In dui cunfressi cuncerti sustinutianu da u latu extracelloulario di u pannellu à a manca, u pannellu di a sinistra hè furmata da a pusizione S4 Averrearmina intornu à una assi perpendiculare à a pianificazione di membrania, accumpagnatu da a pianificazione di membrania, acompantibile da aereo di membrania Separazione di l'Alimamentu esterni di i dui assetti di dui s4 (produtti frecce), pruduce l'arriente, russibile d13 è i127 sò permessi di vene pigghiassi. In a cunfigurazione di Dimer hà truvatu in a Struttura di Crystal 4g80.position p140 in civvvi currisponde à a pusizione D123 in Hv1. I nostri risultati mostranu chì l'interazione elettrostatica repulsiva trà i residui 123 (123d / 123r livellu in u statu di u "normale" in l'interazione di u repulsione per attratte (123D / 123r) , aumentata a cooperazione (Fig. 5g) .it hè prevista chì a rimuzione di l'interazzione di u repulsione averia ancu a cuperturazione di a Cooperatività. L'spiegazione hè chì u effettu destilante di mette insezzioni hydrophobici in un ambiente hydrophilicu pò superà l'effettu trà l'eliminazione di a riduzzione in leggeru chì hè approssimularia A pusizione D171 di Ciona Garis ciis cia-Hv1 (respondante à D143 in umana Hv1) ​​hè a divellaosa, supportante l'ambiente hydrophilicu in u statu odtrophilicu in u statu odtrophilicu in u statu odtrophilicu in u statu odtrophilicu in u statu odtrophilicu in u statu odfiliu. A rivisione di Hv1 Candizia hè cunnisciuta per accade à parechje transizioni19,20,26,39.40 ,4 sensore di Ci-Hv , seguitu da una transizione distinta chì causa di protoni per a conduzione aperta in fiore cunfurmamente di u sensuramentu di a tensione è di a mità di a tensione da a mutuazione nè à pusizione d171. A Perturbazione di u Signale fluorescente hè cunfinatu cù a presenza di l'elorzioni elettrostati trà e cuncurrenti di cunfinazione. Quì a interpretazione adiacente? è mediate accoppiamentu allostericu trà i siti di legame GBTA. Fujiwara et Al25 hà proposta di u duminiu citoplasmicu chì si stende in a membrana per cuntene dui aliziali (fig. 7b, un mudellu à manca in l'analisi di critica in critica L'analisi: a regione di VSD è funzionanu à a CCD.In l'assenza, l'absenza di un capanno transmiglie, è u criticu hè stata predominante chjuse. Dunque, a interfaccia di S4 destinate à a cunfigurazione sustinuitu di u subunitatu state per a disgrazia di S1 ​​è S2 in intersubunit cun cunfigurazioni sfarenti in l'apertura è STATI CHIUSU, una idea coherente cù i scuperti di Mony et al. S1 si move 39 durante a gatina. Eccu, mostre micca, in u statu aperu, l'estremu extracellulari in supportu strincianu per interattizioni elettriche chì mediate l'interazzioni alloscenti cù l'interazzioni all-ste-s4 Oltre l'una di l'altru per interagisce, una rotazione di 20 ° clockw in un assi di clocke intornu à l'Axis Perpendiculare à a Separazione di a Separazione di e duie S1 Helette Cù i nostri scupertassi (fig. 7b, pannellu diritta). Con cunsigliatu sta cunfigurazione per u canale in u statu apertu. Ancu se The CivisMoMe hè pensatu à a funzione cum'è Monomeru, a struttura cristale di u so discorsu in un statu esternu in questu discorsu sò sfurtiamente vicinu, è a cunfigurazione hè simplice à quella prumetta per Hv1 (Fig. 7c) .in The I Civs Residua da u Subunitu Adiacente hè stata Proline A Posizione 140 (P140 in CIVSP chì a cunfigurazione di Hv1 è i ricorri civps suggerenu chì i vsdi di queste proteine ​​anu una tendenza intrinsica per furmà una interfaccia induve l'estrarulari finiscinu di s1 interagisce S1. U rolu essenziale di Hv1 in l'attivazione di a Cellula di l'equipaggiamentu face stu canale di drogu per u cuntrollu di a fertilità maschile.Enhatu SURvisiamentu in i pazienti cun u senu 12 o u colore colorectale 13 È hè pensatu à l'agenti di u tarrazzu di u picculu molécule. A scuperta Apri Hv1 Subunitu, chì porta à aumentata aumentata di l'affinità, pò purtà à u sviluppu di a droga più potenti digeting hv1 canali hv1. Mutaglie di u situ Hv Realizatu U Umanu Azzione di l'Umici DCR Standard.in U Hv1ncccivsp, Residui 1-96 è 228-276 di i 24--576 di i Cierca di Civice U CNUBUTU CUNOKED AJE LISTATU À U SECNICATU DI U SINDICATURA DI PEGEME CRESTRISTI) E RNA SYRITSISS ELLINAIS HATALETA CON U T7 Mmessage Mmachine Kit di trascrizione Mmachine .1-3 ghjorni prima di misure elettrophiologiche, Crna μg / μL) di Xenopus Laevis (Nasco) sò stati ottenuti Da ecoCYTE BIUSIENZA.MOLLO INJETZIONI RNA, e cellule sò stati mantenuti in ND96 si cuntene 96 MM NAVLU, 1.8 MM CACL, 100 mm MM . 2-guanidino-Benzimidazole [1], 2-guanidino-BenzotiaCole [2], (4-Methyl-1,3-Thozol-4-II, 5-Bromo-4 -Methyl-1,3 -thizol-2-yl) Guanidine) [6], Stevana 2-guandiin-5-Methyl-1,3-Thecoole-4-Carboxylate [8], Steil 2-guandiin-4- Methil-1,3-Thincel-1,- Methil-1,3-Thince 1 5-carboxylate [9] è (2-Guandiin-4,3 Methyl-1-Methal-5-YL) ERA DI SIGMA-ALDRICH.FOMOTIDINE [7] era di MP Biomedici.1- 4 - (4-Chlorophenil) -1,3-THIZOLA-2-YL] guanidine [11] è 1- 4- $ 3,4-dimetroxyphenyl) -1,3- THIACOLA-2-YL] GUANIDELLE-2-YL] da matrix scientific.theposti sò di e più purità finale dispunibule in u dM se secca, chì era diluita in a suluzione di registrazione desiderata 3 è 4 eranu Sintesizzati quì almenu 99% purità. À una sospesa di 2-Amino-4- (trifluorometlhyl enturoclorica (1.02 g, 4.5 MX'TAGE DYCIAZARIZICA 6,80 MG, 4,5 MG, 4,5 MG, 4,5 MG, 4,5 MG), motta Hether), è a hè stata rifiutata cù una visione vigorosa per 4 ore. A mistura di reazione hè stata rinfurzata à l'addizione di a cugliera di 10 65 ° C) Ogni ore di parechje, e poi ricristitevate da etil acetate / pitrosu ethert per dà un solidu biancu (500 mg, 48%);; MP 221-222 ° C (Light 225-226 ° C) 45; 1h nmr (500 mhz, dmso-D6): PPM] = 7.25 (Moltu largu, 4 h), 7. 0,40 HZ), 7,73 (7 (D , 1 H, J = 81 hz) .13c nMR (200.C NMR (200 MHZ, DMSO-D6): В.5 hz) * 124. 19 ° = 272 hz), 126.. (Q, J = 272 Hz) = u 31,6 HZ), 134,8, 155.4, 175.5.Hrms.for c9h83.s.s (m + h) +: 261,0416, truvatu : 261.0419. NAPHTO [1,2-d] THEAZCON-2-AMPIN) 1,5 MM, 1,5 MMOL), sintesizatu cum'è discricatu, hè stata calata à 200 ° C in un bagnu di veste in un bagnu di test. 1.0 ml Rec.te u cumpostu caldu era aghjustatu l'acidu idromoricu è a mischja hè stata guardata in u bagnu di a salute era allora stata chjesa à a temperatura di l'acqua è u materiale sducidueru hè stata rotta in picculi pezzi è lavatu cù l'acqua per furnisce un solidu amorfu giallu pallidu. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHZ, DMSO-D6, DKO): [PPM] = 7,59 (T, 1 H, 1 H, J = 1.3 HZ), 7,77 (D, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = J = J = 1 # J = 83 Hz) .13c NMR (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.5, 123.9, 126,5, 126,5, 126.5, 127, U 127, 1460, 120.Her): M / Z calculà valore.for c15H19N4S. (m + h) +: 243.0699 , truvatu: 243.0704. I currenti protoni sò stati misurati in i patch interni è esterni chì esprimenu diverse constructire di a Axopatch 200b à a Stella Software. ) acidu etanesfonicu (mes), 30 mm tetelammonium (tè) mesylate, 5 mm etylene glycol-bis iris (2-Aminoetil) -N. af-tetraacetiche acidu (Equeta), adolcatu PH 60 Cù TEA Idroxidide.all missione ± 2 ° CIPLET hà un trattamentu di l'accessu à 1 Khz, Samplatu a 5 KHZ è analisi di ClampFiit10.2 (Disposizioni moleculari ) è Origine8.1 (Origintumab). Soluzioni chì cuntene diverse cuncentrazioni di l'inibitu HV1 è in certi casi sò stati intenti in u maghjinu à a valvola di profunzione (chì era passatu à u blindy software TTL (TWESTERT- A logica di i transistor) Signali di Perfusion.Repidi sò stati realizati utilizati un penna di perfuser multi-tube.) Cù una misura di diameter di 360 μm +120 MV Dipolarizing Puli Misurazione sò stati discritti18,20.4Tate i currenti à a TVe da -20 MV à u polu di a prova usatu per corriggerà u 18 di a decadenza attuale. L'equazione di Boltzmann di a Citants di Boltzmann 1 di l'inibizione di l'inibizione (mezios% inibizione) Cù a cullette equazione: induve hè a cuncentrazione di l'inhibitore i è H hè a Collo Coefficiente.Po calculà a Colline Coefficiente, Equazione (2) hè riarrana cum'è: