Untersuchung der Intersubunit-Schnittstelle des offenen Hv1-Protonenkanals mit einer allosterisch gekoppelten Sonde

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Allerdings wurden solche Schnittstellen in offenen Hv1-Kanälen nicht identifiziert. Hier zeigen wir, dass 2-Guanidinothiazol-Derivate zwei Hv1-VSDs kooperativ blockieren und eine dieser Verbindungen als Sonde für die allosterische Kopplung zwischen offenen Untereinheiten verwenden. Wir fanden heraus, dass die extrazelluläre Das Ende des ersten Transmembranfragments von VSD bildet eine Schnittstelle zwischen Untereinheiten, die die Kopplung zwischen Bindungsstellen vermittelt, während die Coiled-Coil-Domäne nicht direkt an diesem Prozess beteiligt ist. Wir fanden auch starke Hinweise darauf, dass der protonenselektive Filter des Kanals die Kooperativität der Blockerbindung steuert . Spannungsgesteuerte Protonenkanäle spielen in einer Vielzahl von Organismen, vom Phytoplankton bis zum Menschen1, eine wichtige Rolle. In den meisten Zellen vermitteln diese Kanäle den Protonenausfluss aus der Protonenmembran und regulieren die Aktivität der NADPH-Oxidase. Der einzige bekannte spannungsgesteuerte Protonenkanal beim Menschen ist Hv1, das das Produkt des HVCN1-Gens2,3 ist. Hv1 (auch bekannt als VSOP) spielt nachweislich eine Rolle bei der B-Zell-Proliferation4, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch das angeborene Immunsystem5,6,7,8, Spermien Motilität9 und pH-Regulierung der Atemwegsoberflächenflüssigkeit10. Dieser Kanal ist an verschiedenen Krebsarten beteiligt, beispielsweise bei bösartigen B-Zell-Erkrankungen4,11 sowie Brust- und Darmkrebs12,13. Es wurde festgestellt, dass eine übermäßige Hv1-Aktivität das Metastasierungspotenzial von Krebszellen erhöht 11, 12. Im Gehirn wird Hv1 exprimiert durch Mikroglia, und es wurde gezeigt, dass seine Aktivität in Modellen für ischämischen Schlaganfall die Hirnschädigung verschlimmert. Das Hv1-Protein enthält eine spannungsempfindliche Domäne (VSD), die aus vier Transmembransegmenten mit der Bezeichnung S1 bis S414 besteht. Die VSD ähnelt den entsprechenden Domänen spannungsgesteuerter Na+-, K+- und Ca2+-Kanäle und spannungsempfindlicher Phosphatasen wie CiVSP von Ciona gutis15. Bei diesen anderen Proteinen ist der C-Terminus von S4 an ein Effektormodul, die Porendomäne oder ein Enzym, gebunden. Bei Hv1 ist S4 an die Coiled-Coil-Domäne (CCD) gebunden, die sich auf der zytoplasmatischen Seite der Membran befindet Der Kanal ist ein dimerer Komplex, der aus zwei VSDs besteht, die jeweils einen gesteuerten Protonenpermeationsweg enthalten16,17,18. Es wurde festgestellt, dass sich diese beiden Hv1-Untereinheiten kooperativ öffnen19,20,21,22, was darauf hindeutet, dass allosterische Kopplung und Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten eine Rolle spielen eine wichtige Rolle im Gating-Prozess. Die Schnittstelle zwischen den Untereinheiten innerhalb der Coiled-Coil-Domäne ist gut definiert, da die Kristallstrukturen der beiden isolierten Domänen verfügbar sind22,23. Die Schnittstelle zwischen VSDs innerhalb der Membran ist dagegen nicht verfügbar gut verstanden. Die Kristallstruktur des chimären Hv1-CiVSP-Proteins liefert keine Informationen über diese Schnittstelle, da die trimere Organisation des kristallisierten Kanalkomplexes möglicherweise aus dem Ersatz des nativen Hv1-CCD durch den Hefe-Leucin-Zipper GCN424 resultiert. Eine kürzlich durchgeführte Studie zur Organisation der Untereinheiten des Hv1-Kanals kam zu dem Schluss, dass zwei S4-Helices ohne ernsthafte Störung der Sekundärstruktur in das CCD übergehen, was zu langen Helices führt, die von der Membran ausgehen und in das Zytoplasma hineinragen. Basierend auf der Cystein-Vernetzungsanalyse, Diese Studie schlägt vor, dass Hv1-VSDs einander entlang des S4-Segments kontaktieren. Andere Studien haben jedoch alternative Schnittstellen zwischen VSDs vorgeschlagen. Zu diesen Schnittstellen gehören die S1-Segmente 17, 21, 26 und die äußeren Enden von S2-Segment 21. Ein möglicher Grund für den Konflikt Das Ergebnis dieser Studien ist, dass die allosterische Kopplung zwischen VSDs in Bezug auf den Gating-Prozess untersucht wurde, der vom geschlossenen und offenen Zustand abhängt, und dass die Schnittstelle zwischen VSDs bei verschiedenen Zustandsänderungen in der Konformation variieren kann. Hier fanden wir heraus, dass 2-Guanidinothiazol Hv1-Kanäle durch synergistische Bindung an zwei offene VSDs hemmt, und verwendeten eine der Verbindungen, 2-Guanidinobenzothiazol (GBTA), um die Wechselwirkung zwischen Untereinheiten im offenen Zustand zu untersuchen. Schnittstelle. Wir haben herausgefunden, dass die GBTA-Bindungskurve gut durch ein quantitatives Modell beschrieben werden kann, bei dem die Bindung eines Inhibitors an eine Untereinheit zu einer Erhöhung der Bindungsaffinität der benachbarten Untereinheit führt. Wir haben auch herausgefunden, dass die Reste D112 Selektivitätsfilter für die Kanal 27, 28 und ein Teil der Guanidinderivat-Bindungsstelle 29 steuern die GBTA-Bindungskooperativität. Wir zeigen, dass die kooperative Bindung im Hv1-Dimer aufrechterhalten wird, wo sich das CCD vom S4-Segment trennt, was darauf hindeutet, dass die Schnittstelle zwischen den Untereinheiten im CCD dies nicht direkt tut vermitteln die allosterische Kopplung zwischen GBTA-Bindungsstellen. Im Gegensatz dazu stellen wir fest, dass das S1-Fragment Teil der Schnittstelle zwischen den Untereinheiten ist, und schlagen eine Anordnung benachbarter VSDs mit dem extrazellulären Ende der S4-Helix vom Zentrum des Dimers entfernt vor, um dies zu ermöglichen Das S1-Fragment befindet sich im offenen Zustand. Niedermolekulare Hv1-Inhibitoren eignen sich als Krebsmedikamente und neuroprotektive Mittel. Bisher konnten jedoch nur wenige Verbindungen den Kanal hemmen30,31,32,33. Unter ihnen ist 2-Guanidinobenzimidazol (2GBI, Verbindung [1] in Abb Es wurde festgestellt, dass 1a) und seine Derivate die Protonenpermeation von VSD29,32 durch den Kanal blockieren. Es wird angenommen, dass die Bindung solcher Verbindungen unabhängig in den beiden offenen Untereinheiten erfolgt. 2-Guanidinobenzothiazol (GBTA, Verbindung [2] in Abbildung 1a) war Es wurde zuvor gezeigt, dass es Hv1 bei Tests in einer Konzentration von 200 μM fast genauso wirksam hemmt wie 2GBI (Abbildung 1b). Wir untersuchten andere Thiazol-Derivate und stellten fest, dass einige von ihnen den Kanal mit ähnlicher oder größerer Wirksamkeit als GBTA hemmten (Abb. 1 und Ergänzung). Text).Wir haben die Konzentrations-Reaktionskurven von vier Thiazol-Derivaten (GBTA und Verbindungen [3], [6] und [11], Abb. 1c) bestimmt und festgestellt, dass sie steiler waren als die von 2GBI. Die Hill-Koeffizienten (h) der Thiazol-Derivate lag zwischen 1,109 ± 0,040 und 1,306 ± 0,033 (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1).Im Gegensatz dazu betrug der Hill-Koeffizient für 2GBI 0,975 ± 0,024 29, Abb. 2a und ergänzende Abb. 1).Ein Hill-Koeffizient über 1 weist auf Bindungskooperativität hin. Da jede Hv1-Untereinheit ihre eigene Inhibitor- Bindungsstelle,29,32 Wir kamen zu dem Schluss, dass die Bindung eines Thiazolderivats an eine Untereinheit die Bindung eines zweiten Inhibitormoleküls an die benachbarte Untereinheit verstärken könnte. GBTA war die Testverbindung mit dem höchsten Hill-Koeffizienten. Daher haben wir diese Verbindung ausgewählt untersuchten den Mechanismus der Bindungssynergie weiter und verwendeten 2GBI als Referenz-Negativkontrolle. (a) Testverbindungen: [1] Referenz-Hv1-Inhibitor 2-Guanidino-Benzimidazol (2GBI).[2] 2-Guanidino-Benzothiazol (GBTA), [3] (5-Trifluormethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidin, [4] Naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -Guanidin, [5](4-Methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [6](5-Brom-4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [7] Famotidin, [8] 2-Guanidino-5-methyl-1,3-thiazol-4-carbonsäureethylester, [9] 2-Guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazol-5-carboxylat, [10 ](2-Guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethylacetat, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-Dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidin. (b) Hemmung der menschlichen Hv1-Aktivität durch die angegebenen Guanidinothiazole und die Referenzverbindung 2GBI (blaugrüne Balken) .Hv1-Protonenströme wurden in Inside-Out-Plaques von Xenopus-Oozyten als Reaktion auf die Depolarisation von einem Haltepotential von -80 mV bis +120 mV gemessen. Jeder Inhibitor wurde dem Bad in einer Konzentration von 200 μM zugesetzt.pHi = pHo = 6,0 .Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n≥4). (c) Konzentrationsabhängige Hemmung von menschlichem Hv1 durch die Verbindungen [2], [3], [6] und [11]. Jeder Punkt stellt die mittlere Hemmung ± SD von 3 dar bis 15 Messungen. Die Linie ist eine Hill-Anpassung, die verwendet wird, um die in der Ergänzungstabelle 1 angegebenen scheinbaren Kd-Werte zu erhalten. Die Hill-Koeffizienten wurden aus den in der Ergänzungstabelle 1 angegebenen Anpassungen bestimmt: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (siehe Methoden). (a,b) Die Verbindungen 2GBI und GBTA hemmten dimeres und monomeres Hv1 in konzentrationsabhängiger Weise. Jeder Punkt stellt die mittlere Hemmung ± SD von 3 bis 8 Messungen dar und die Kurve ist eine Hill-Anpassung. Die Hill-Koeffizienten (h) sind in dargestellt Die eingefügten Histogramme wurden aus den in den ergänzenden Abbildungen 3 und 4 angegebenen Anpassungen ermittelt. Die in (a) gezeigte Konzentrationsreaktion von GBTA ist dieselbe wie die in Abb. 1c. Die scheinbaren Kd-Werte finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. (c) Modellierung von die kooperative Bindung von GBTA an dimeres Hv1. Die durchgezogene schwarze Linie stellt die Anpassung an die experimentellen Daten durch Gleichung (6) dar, die das in (d) gezeigte Bindungsmodell beschreibt. Die gestrichelten Linien mit der Bezeichnung Sub 1 und Sub 2 stellen die bimolekulare Assoziation dar -Dissoziationsgleichgewichtskurven des ersten bzw. zweiten Bindungsereignisses (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Schematische Darstellung des vorgeschlagenen Mechanismus des Hv1-Blocks. Im Fall von GBTA erhöht die Bindung an eine offene Untereinheit die Affinität der benachbarten offenen Untereinheit (Kd2 0,05) Abnahme des Hill-Koeffizienten der GBTA-Bindung an GGG-Kanäle im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 5c), was darauf hindeutet, dass trotz seiner Rolle bei der Aufrechterhaltung der zwei Untereinheiten zusammen wichtig, aber CCD vermittelt nicht direkt die allosterische Kopplung zwischen den Untereinheiten zwischen GBTA-Bindungsstellen. (a) Schematische Darstellung des Hv1-Dimers mit einer Triglycin-Mutation am inneren Ende von S4, die die durch die zytoplasmatische Coiled-Coil-Domäne vermittelte Kopplung zwischen Untereinheiten unterbrechen soll (blaue Pfeile). (b) Schematische Darstellung von Hv1-Dimeren und Ligationsdimeren mit Angezeigte Mutationen, die dazu dienen, S1-Fragmente zu testen, die an der Kopplung zwischen Untereinheiten beteiligt sind (blaue Pfeile). (c–h) 2GBI (Cyan) und GBTA (Dunkelrot) hemmen die angegebenen Konstrukte in konzentrationsabhängiger Weise. Jeder Punkt stellt die mittlere Hemmung dar ± SD von 3 bis 10 Messungen. Die Kurve war eine Hill-Anpassung, die verwendet wurde, um scheinbare Kd-Werte zu erhalten (siehe Ergänzungstabelle 1). Die Hill-Koeffizienten in den interpolierten Histogrammen wurden wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben bestimmt (siehe ergänzende Abbildungen 3 und 4). Referenz-h-Werte für Hv1-WT werden als gestrichelte Linien dargestellt. Sternchen zeigen statistisch signifikante Unterschiede zwischen Mutanten- und WT-Passagen an (p 0,05, Abb. 5d,i). ). Andererseits reduzierte die Mutation D123A den Hill-Koeffizienten von GBTA signifikant (p 0,05/14). Da die Neutralisierung der Ladung an Position 123 auf beiden Untereinheiten zu einer starken Änderung der GBTA-Bindungskooperativität führte, während die Umkehrung der Ladung auf beiden Untereinheiten nur einen geringen Effekt hatte, erweiterten wir die Analyse auf nur eine Untereinheit mit dem Umkehrkanal der Ladung.We erzeugte Hv1-verknüpfte Dimere mit D123R-Substitution in der C-terminalen Untereinheit (Abb. 5b) und maß die Konzentrations-Reaktionshemmung durch GBTA und 2GBI. Wir fanden heraus, dass der Hill-Koeffizient der GBTA-Bindung an WT-D123R-Kanäle deutlich höher war von Wildtyp-Hv1 (p 0,05). Wir fanden auch heraus, dass in Abwesenheit von βME der Hill-Koeffizient der GBTA-Bindung an das D112E I127C Hv1-Dimer signifikant höher war als der in Gegenwart von Reduktionsmitteln gemessene Wert (Abb. 6e und ergänzende Abb. 4), was darauf hindeutet, dass die D112E-Mutation vorliegt hat den Anstieg der GBTA-Bindungskooperativität, der sich aus der Vernetzung von Cystein 127 ergibt, nicht aufgehoben. Der Hill-Koeffizient der 2GBI-Bindung an D112E-, I127C-Hv1-Dimere wurde durch die D112E-Mutation ebenfalls nicht signifikant beeinflusst (Abbildung 1).6d und Ergänzung Abb. 3). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die GBTA-Bindung durch die Wechselwirkung zwischen den äußeren Enden von S1-Fragmenten in benachbarten Hv1-Untereinheiten durch attraktive elektrostatische Wechselwirkungen oder durch die Bildung kovalenter Bindungen zwischen substituierten Cysteinen verstärkt wird. Die allosterische Kopplung zwischen Stellen nimmt zu und führt zu Bindungskooperativität. Während die Wirkung attraktiver elektrostatischer Wechselwirkungen auf die Kooperativität durch die Mutation D112E aufgehoben werden kann, ist die Wirkung kovalenter Bindungen nicht möglich. Bei unserer Untersuchung des chemischen Raums, der für die Bindung von Guanidinderivaten an Hv1-Kanäle zur Verfügung steht, stellten wir fest, dass 2-Guanidinothiazole wie GBTA eine steilere Konzentrationsabhängigkeit aufweisen als 2-Guanidinobenzimidazole (Abb. 1c). Die Hill-Koeffizientenanalyse der GBTA-Bindung an beide Dimere und Monomerkanäle (Abb. 2a, b) und zum Dimerkanal, in dem eine Untereinheit vorab an den Inhibitor gebunden war (Abb. 4), führten uns zu dem Schluss, dass die Hemmung von Hv1 durch GBTA Die Wirkung ist ein synergistischer Prozess und Die Bindungsstellen der Verbindungen in den beiden Untereinheiten sind allosterisch gekoppelt. Die Entdeckung, dass GBTA an den offenen Kanal bindet, wie zuvor für die verwandte Verbindung 2GBI32 gezeigt, legt nahe, dass die allosterische Kopplung spezifisch im offenen Zustand beurteilt werden kann. Unser kooperatives Bindungsmodell konnte die Hemmung von Hv1 durch GBTA quantitativ beschreiben (Abb. 2c) und die unterschiedlichen Auswirkungen von 2GBI und GBTA auf den Zerfall von Kanalschwanzströmen nach Membranrepolarisation erklären, was unsere Interpretation des Bindungsprozesses unterstützt. Der maximale Hügelkoeffizient, der in einem allosterischen Protein mit zwei Bindungsstellen (wie HV1) erreicht werden kann Synergistische freie Energie, die Differenz zwischen den bindenden freien Energien der niedrigsten und höchsten Affinitätsstellen (siehe Methoden), im Fall von HV1-Wildtyp und 2,7 kcal/Mol im Fall von HV1 I127C.The Bindung von Sauerstoff zu Hämoglobin ist das berühmteste und am besten untersuchte Beispiel des kollaborativen Prozesses38. Für humane Hämoglobin (ein Tetramer mit vier allosterisch gekoppelten Bindungsstellen) reicht der Hill-Koeffizient zwischen 2,5 und 3,0, wobei die Werte zwischen 1,26 bis 3,64 reichten. KCAL/Mol in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen38. In Bezug auf die globale Energetik unterscheidet sich die Kooperativität der GBTA -Bindung an HV1 nicht wesentlich von der der O2 -Bindung an Hämoglobin, wenn die unterschiedliche Anzahl von Proteinuntereinheiten in den beiden Systemen berücksichtigt wird. In unserem Synergie -Modell führt die Bindung von GBTA -Molekülen an eine Untereinheit zu einer Erhöhung der Bindungsaffinität der benachbarten Untereinheit. Wir stellen uns einen Prozess vor Änderungen in den Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten. In Reaktion auf diese Änderungen verändern benachbarte Untereinheiten ihre Bindungsstellen, was zu einer stickeren GBTA -Bindung führt. Bei diesem Prozess ist das S1 -Aspartat D112 für die Umlagerung der Bindungsstelle verantwortlich, die mit einer erhöhten Bindungsaffinität verbunden ist.D112 Es wurde zuvor gezeigt, dass er Teil des HV1 -Protonenpermeationswegs war und als Selektivitätsfilter 27,28 fungiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Selektivitätsfilter in den beiden HV1 -Untereinheiten im offenen Zustand allosterisch gekoppelt sind Auf der Kristallstruktur der HV1-CIVSP-Chimären. (a) Schema des HV1-VSD. Basierend auf der Kristallstruktur der HV1-CIVSP-Chimäre wird gezeigt, dass die helikalen Segmente zylindrisch sind. In dieser Konfiguration verschiebt sich das innere Ende des S4-Segments mit dem CCD (nicht gezeigt). Die vorhergesagten Stellen von gebundenem GBTA werden als graue Ovale dargestellt. Black -Pfeile geben Wege an In zwei verschiedenen Dimer -Konfigurationen, wie aus der extrazellulären Seite der Membranebene hervorgeht. Auf der linken Platte wird die Dimer -Grenzfläche durch die S4 -Helix gebildet. Dehnung der beiden VSDs 20 Grad im Uhrzeigersinn um eine Achse senkrecht zur Membranebene, begleitet von von von Die Trennung der äußeren Enden der beiden S4 -Helices (gestrichelte Pfeile) erzeugt die rechts gezeigte Anordnung. In dieser Konfiguration dürfen die Reste D123 und I127 von benachbarten Untereinheiten nahe beieinander kommen. (c) Schematische Darstellung des Civsp VSD In der Dimer -Konfiguration, die in der 4G80 -Kristallstruktur gefunden wurde. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die abstoßende elektrostatische Wechselwirkung zwischen Rückstand 123 (123d/123d oder 123R/123R) mit einem "normalen" Niveau der GBTA-bindenden Kooperativität im offenen Zustand assoziiert ist und die Wechselwirkung von der Abstoßung auf angezogenes (123D/123R) verschiebt (123D/123R) , erhöhte Zusammenarbeit (Abb. 5G). Es wird erwartet Erklärung ist, dass der destabilisierende Effekt von hydrophoben Rückständen in einer hydrophilen Umgebung den Stabilisierungseffekt aufgrund der Eliminierung abstoßender Wechselwirkungen zwischen D123 -Resten überwiegen kann. Die Position D171 von Ciona Gutis CI-HV1 (entsprechend D123 in menschlichem HV1) wird bei der Aktivierung erhöht und unterstützt die Vorstellung, dass sich D123 in einer hydrophilen Umgebung im offenen Zustand befindet. Es ist bekannt, dass das Gating von HV1-Kanälen durch mehrere Übergänge auftritt. , gefolgt von einem deutlichen Übergang, bei dem Protonen im Pfad der Untereinheiten geöffnet werden. Die Konformationsänderung des Spannungssensors wurde durch Spannungsklemmefluoreszenz überwacht, und es wurde festgestellt, dass der zweite Übergang durch die Mutation an Position D171 selektiv gestört wurde. Die Störung des Fluoreszenzsignals stimmt mit dem Vorhandensein elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen den D171 -Resten benachbarter Untereinheiten entlang der Reaktionskoordinaten der Konformationsänderung überein. Diese Interpretation stimmt mit unserem Befund überein, dass der D123 -Rest elektrostatisch im offenen Zustand interagiert und vermittelt die allosterische Kopplung zwischen GBTA -Bindungsstellen. Fujiwara et al. 25 schlugen vor, dass sich die Dimer-Grenzfläche der zytoplasmatischen Coiled-Coil-Domäne in die Membran erstreckt, um zwei S4-Helices zu enthalten (Abb. 7b, linke Feld) .a Modell dieser Intersubunit-Wechselwirkung basiert auf der Cystein-Vernetzungsanalyseabdeckung, die Abdeckung der Cysteinverbindungsanalyse basiert Die gesamte VSD- und Funktionsanalyse der Region, die die S4 -Helix und die CCD verbindet. In der Abwesenheit eines Transmembran -pH -Gradienten erfordern HV1 -Kanäle eine beträchtliche Membran -Depolarisation zum Öffnen, und Cystein -Kreuzverbindung erfolgt unter Bedingungen, unter denen der Kanal vorwiegend geschlossen ist. Daher spiegelt die erkannte S4-S4-Schnittstelle wahrscheinlich die Konfiguration der Untereinheit der Off-State-Untereinheit wider. Andere Studien haben Hinweise auf die Beteiligung von S1 und S2 in Intersubunit-Interaktionen während des Gatings 17,21,26 festgestellt, was darauf hindeutet geschlossene Zustände, eine Idee, die mit den Ergebnissen von Mony et al. S1 bewegt sich während des Gatings 39. Hier zeigen wir, dass im offenen Zustand die extrazellulären Enden der S1-Helix nahe genug sind, um direkte elektrostatische Wechselwirkungen zu unterstützen, die die allosterische Kopplung zwischen Untereinheiten vermitteln. In der Dimerkonfiguration mit erweiterten S4-S4-Wechselwirkungen sind die S1-Helices zu weit Abgesehen voneinander, um direkt zu interagieren. Mit unseren Ergebnissen (Abb. 7b, rechtes Panel) empfehlen wir diese Konfiguration für den Kanal im offenen Zustand. Obwohl angenommen wird, dass das Civsp -Enzym als Monomer fungiert, wird die Kristallstruktur seiner isolierten VSD in einem Dimerzustand erfasst. Die äußeren Enden der S1 -Helices in diesem Dimer sind räumlich nahe beieinander, und die Gesamtkonfiguration ähnelt der vorgeschlagenen Konfiguration. Für HV1 (Abb. 7c). In dem Civsp -Dimer war der nächstgelegene Rest aus der benachbarten Untereinheit an Position 140 Prolin (Abb. 7c). Interessevollerweise entspricht P140 in CIVSP der Position D123 in HV1. Die Ähnlichkeit in der Untereinheitskonfiguration zwischen HV1 und CIVSP -Dimere legen nahe, dass die VSD dieser Proteine ​​eine intrinsische Tendenz haben, eine Grenzfläche zu bilden, an der die extrazellulären Enden von S1 interagieren. Die wesentliche Rolle von HV1 bei der Aktivierung von Spermienzellen macht diesen Kanal zu einem attraktiven Arzneimittelziel für die Kontrolle der männlichen Fertilität. Das Überleben bei Patienten mit Brust 12 oder Darmkrebs 13 und soll zu Malignitäten von B-Zell beitragen. Offene HV1 -Untereinheit, die zu einer erhöhten Bindungsaffinität führt, kann zur Entwicklung wirksamerer Arzneimittel gegen HV1 -Kanäle führen. Die ortsgesteuerte Mutagenese des menschlichen HV1 wurde unter Verwendung von Standard-PCR-Techniken durchgeführt. Im HV1NCCIVSP-Konstrukt wurden die Reste 1-96 und 228-273 von HV1 durch Reste 1-113 und 240-576 von Civsp18 ersetzt. Im HV1-verknüpften Dimer, Dimer, Dimer, 240-576 von Civsp18. Der C-Terminus einer Untereinheit ist mit dem N-Terminus der zweiten Untereinheit durch den GGSGGSGGSGSGGSGG-Linker verbunden. Die PGEMHE-Plasmide, die die verschiedenen Konstrukte enthielten, wurden linearisiert mit NHE1 oder SPH1-Restriktionenzymen (New England Biolabs) und RNA-Synthese wurde mit der Synthese durchgeführt, die mit der Synthese ausgeführt wurden, die mit der mit der Synthese durchgeführten Synthese mit dem mit der Synthese durchgeführten Synthese ausgeführt wurden) und wurde mit der mit der THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE THE. T7 Mmessage MMACHINE-Transkriptionskit (Ambion) .1-3 Tage vor elektrophysiologischen Messungen wurde CRNA in Xenopus-Oozyten (50 nl pro Zelle, 0,3-1,5 μg/μl) injiziert. Aus Ecozyten -Bioscience.folinging RNA -Injektion wurden die Zellen in ND96 -Medium gehalten, das 96 mM NaCl, 2 mM kcl, 1,8 mM CaCl, 1 mm mgcl, 10 mM Hepes, 5 mM Pyruvat, 100 μg/ml Gentamicin, pH 7,2 18 ° C enthielt . 2-Guanidino-Benzimidazol [1], 2-Guanidino-Benzothiazol [2] (4-Methyl-1,3-Thiazol-2-yl) Guanidin [5] (5-Brom-4-Methyl-1,3 -Thiazol-2-yl) Guanidin) [6], Ethyl 2-Guanidino-5-Methyl-1,3-Thiazol-4-Carboxylat [8], Ethyl 2-Guanidino-4- Methyl-1,3-Thiazol- 5-carboxylat [9] und (2-Guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) Ethylacetat [10] stammten von Sigma-Aldrich.famotidin [7] von MP Biomedicals.1- [4 -(4-Chlorphenyl) -1,3-thiazol-2-yl] Guanidin [11] und 1- [4- (3,4-Dimethoxyphenyl) -1,3- Thiazol-2-yl] Guanidin [12] war von matrix Scientific. Diese Verbindungen sind von der höchsten Reinheit im Handel erhältlich. Sie wurden in trockenem DMSO gelöst, um eine 100 mm -Stammlösung zu erzeugen, die dann in der Aufzeichnungslösung bei der gewünschten Endkonzentration verdünnt wurde. Mindestens 99% Reinheit. Zu einer Suspension von 2-Amino-4- (Trifluormethyl) Benzolethiolhydrochlorid (1,02 g, 4,5 mmol) in 25 ml wässriger Salzsäure (2,5 n) wurde feste Dizyandiamid (380 mg, 4,5 mmol) und der resultierende Heterogenmisch wurde 4 Stunden lang mit kräftigem Rühren zurückgeflutet. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und durch allmähliche Zugabe von 10 n Kaliumhydroxid neutralisiert. Der gebildete weiße Niederschlag wurde gefiltert, mit kaltem Wasser (3 × 50 ml) gewaschen, in einem Ofen (getrocknet) (in einem Ofen (getrocknet) (getrocknet 65 ° C) für mehrere Stunden und dann aus Ethylacetat/Erdöl Ether umkristallisiert, um einen weißen Feststoff zu ergeben (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (Licht 225–226 ° C) 45; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7,25 (sehr breit S, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (D) , 1 h, j = 8,1 Hz). = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.hrms (ESI): M/Z Kalkulierter Wert : 261.0419. Naphtho [1,2-d] Thiazol-2-Amin (300 mg, 1,5 mmol), das wie zuvor beschrieben synthetisiert wurde 1,0 ml conc. To Heißverbindung wurde schnell Salzsäure zugesetzt und die Mischung wurde etwa 2 Minuten im Ölbad aufbewahrt. Während dieser Zeit verdampfte die meiste Zeit des Wasser wurde in kleine Stücke zerlegt und mit Wasser gewaschen, um einen hellgelben amorphen Feststoff zu liefern. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h) , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 Hz) .13c nmr (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132.1, 140,7, 169,1.HRMs (ESI): M/Z Calculed Value.FoR C12H11N4S (M + H) +: 243.0699999999S (M + H) +: 243.069999 , gefunden: 243.0704. Protonenströme wurden in internen und externen Flecken von Oozyten gemessen, die verschiedene Konstrukte unter Verwendung eines von einem Axon Digidata 1440A (molekularen Geräte) gesteuerten Axopatch-200b-Verstärkers mit PCLAMP10-Software haben. ) Ethanesulfonsäure (MES), 30 mM Tetraethylammonium (Tee) Mesylat, 5 mm Teechlorid, 5 mM Ethylenglykol-Bis (2-Aminoethyl) -n, N, N ', N'-Tetraessigsäure (EGTA), angepasst an pH 6,0 mit Teehydroxid. Alle Messungen wurden bei 22 ± 2 ° C durchgeführt ) und Origin8.1 (OriginLab). Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen des HV1-Inhibitors und in einigen Fällen wurden 10 mM βME durch den Schwerkraft durch einen Verteiler, der mit einem VC-6-Perfusionsventilsystem (Warner Instr.) Verbunden ist, in das Bad eingeführt, das durch die PCLAMP-Software TTL (Transistor- Transistor-Logik) Signale.Rapid-Perfusionsexperimente wurden unter Verwendung eines Multi-Röhrchen-Perfusionsstifts (Automaten-Sci.) Durchgeführt, mit einer Abgabespitze mit einem Durchmesser von 360 μm, der vor einer Patch-Pipette montiert wurde +120 mV depolarisierende Impuls.GV Wird verwendet, um den Stromverfall zu korrigieren. 18. Der GV -Diagramm passt zur Boltzmann -Gleichung: Die scheinbaren Dissoziationskonstanten (KD) für verschiedene Kombinationen von Kanälen und Inhibitoren (ergänzende Tabelle 1) wurden durch Anpassung der Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung (Mittelwert % -Inhibwerte) bestimmt Mit der Hügelgleichung: wobei [i] die Konzentration des Inhibitors I und H der Hügelkoeffizient ist. Um den Hügelkoeffizienten zu berechnen, wird Gleichung (2) als: