Interrogación de la interfaz entre subunidades del canal de protones abierto Hv1 con una sonda acoplada alostéricamente

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Aquí demostramos que los derivados de 2-guanidinotiazol bloquean dos VSD Hv1 de manera cooperativa y utilizan uno de estos compuestos como sonda para el acoplamiento alostérico entre subunidades abiertas. El extremo del primer fragmento transmembrana de VSD forma una interfaz entre subunidades que media el acoplamiento entre los sitios de unión, mientras que el dominio en espiral no está directamente involucrado en este proceso. También encontramos evidencia sólida de que el filtro selectivo de protones del canal controla la cooperatividad de unión al bloqueador. . Los canales de protones dependientes de voltaje desempeñan funciones importantes en una variedad de organismos, desde el fitoplancton hasta los humanos1. En la mayoría de las células, estos canales median el flujo de protones desde la membrana de protones y regulan la actividad de la NADPH oxidasa. El único canal de protones dependiente de voltaje conocido en humanos es Hv1, que es el producto del gen HVCN12,3. Se ha demostrado que Hv1 (también conocido como VSOP) desempeña un papel en la proliferación de células B4, la producción de especies reactivas de oxígeno por parte del sistema inmunológico innato5,6,7,8, espermatozoides motilidad9 y regulación del pH del líquido de la superficie de las vías respiratorias10. Este canal está involucrado en varios tipos de cáncer, como las neoplasias malignas de células B4,11 y los cánceres de mama y colorrectal12,13. Se encontró que la actividad excesiva de Hv1 aumenta el potencial metastásico de las células cancerosas 11, 12. En el cerebro, Hv1 se expresa por la microglía, y se ha demostrado que su actividad exacerba el daño cerebral en modelos de accidente cerebrovascular isquémico. La proteína Hv1 contiene un dominio sensor de voltaje (VSD), que consta de cuatro segmentos transmembrana llamados S1 a S414. El VSD se asemeja a los dominios correspondientes de los canales de Na+, K+ y Ca2+ dependientes de voltaje y a las fosfatasas sensibles al voltaje, como CiVSP de Ciona gutis15. En estas otras proteínas, el extremo C de S4 está unido a un módulo efector, el dominio de poro o enzima. En Hv1, S4 está vinculado al dominio en espiral (CCD) ubicado en el lado citoplasmático de la membrana. El canal es un complejo dimérico que consta de dos VSD, cada uno de los cuales contiene una vía de permeación de protones cerrada16,17,18. Se descubrió que estas dos subunidades Hv1 se abren cooperativamente19,20,21,22, lo que sugiere que el acoplamiento alostérico y las interacciones entre subunidades juegan un papel importante. un papel importante en el proceso de activación. La interfaz entre las subunidades dentro del dominio de bobina enrollada está bien definida porque las estructuras cristalinas de los dos dominios aislados están disponibles22,23. Por otro lado, la interfaz entre los VSD dentro de la membrana no está bien entendido. La estructura cristalina de la proteína quimérica Hv1-CiVSP no proporciona información sobre esta interfaz, ya que la organización trimérica del complejo de canales cristalizado puede resultar de la sustitución del CCD Hv1 nativo por la cremallera de leucina de levadura GCN424. Un estudio reciente de la organización de las subunidades del canal Hv1 concluyó que dos hélices S4 pasan al CCD sin una alteración grave de la estructura secundaria, lo que da como resultado hélices largas que parten de la membrana y se proyectan hacia el citoplasma. Según el análisis de entrecruzamiento de cisteína, Este estudio propone que los VSD Hv1 entren en contacto entre sí a lo largo del segmento S4. Sin embargo, otros estudios han propuesto interfaces alternativas entre los VSD. Estas interfaces incluyen los segmentos S1 17, 21, 26 y los extremos exteriores del segmento S2 21. Una posible razón para el conflicto Los resultados de estos estudios es que el acoplamiento alostérico entre VSD se examinó en relación con el proceso de activación, que depende de los estados cerrado y abierto, y la interfaz entre VSD puede variar en diferentes cambios de estado en la conformación. Aquí, encontramos que el 2-guanidinotiazol inhibe los canales Hv1 al unirse sinérgicamente a dos VSD abiertos, y utilizamos uno de los compuestos, 2-guanidinobenzotiazol (GBTA), para probar la interacción entre subunidades en el estado abierto. interfaz. Encontramos que la curva de unión de GBTA puede describirse bien mediante un modelo cuantitativo en el que la unión de un inhibidor a una subunidad da como resultado un aumento en la afinidad de unión de la subunidad adyacente. También encontramos que los residuos D112, filtros de selectividad para la Los canales 27, 28 y parte del sitio de unión del derivado de guanidina 29 controlan la cooperatividad de unión de GBTA. Mostramos que la unión cooperativa se mantiene en el dímero Hv1, donde el CCD se separa del segmento S4, lo que sugiere que la interfaz entre subunidades en el CCD no se une directamente. mediar el acoplamiento alostérico entre los sitios de unión de GBTA. Por el contrario, encontramos que el fragmento S1 es parte de la interfaz entre las subunidades y proponemos una disposición de VSD adyacentes con el extremo extracelular de la hélice S4 alejado del centro del dímero para permitir el fragmento S1 esté en estado abierto. Los inhibidores de moléculas pequeñas de Hv1 son útiles como fármacos anticancerígenos y agentes neuroprotectores. Sin embargo, hasta la fecha, pocos compuestos han podido inhibir el canal30,31,32,33.Entre ellos, el 2-guanidinobencimidazol (2GBI, compuesto [1] en la Fig. 1a) y sus derivados bloquean la permeación de protones de VSD29,32 a través del canal. Se cree que la unión de dichos compuestos ocurre de forma independiente en las dos subunidades abiertas. Se encontró 2-guanidinobenzotiazol (GBTA, compuesto [2] en la Figura 1a). Se demostró anteriormente que inhibe Hv1 casi tan eficazmente como 2GBI cuando se probó a una concentración de 200 μM (Figura 1b). Examinamos otros derivados de tiazol y descubrimos que algunos de ellos inhibían el canal con una potencia similar o mayor que GBTA (Fig. 1 y Suplementario). texto). Determinamos las curvas de respuesta de concentración de cuatro derivados de tiazol (GBTA y compuestos [3], [6] y [11], Fig. 1c) y encontramos que eran más pronunciadas que las de 2GBI. Los coeficientes de Hill (h) de derivados de tiazol osciló entre 1,109 ± 0,040 y 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c y Fig. 1 complementaria). Por el contrario, el coeficiente de Hill para 2GBI fue 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a y Fig. 1 complementaria). Un coeficiente de Hill superior a 1 indica cooperatividad de unión. Debido a que cada subunidad Hv1 tiene su propio inhibidor. sitio de unión,29,32 razonamos que la unión de un derivado de tiazol a una subunidad podría mejorar la unión de una segunda molécula inhibidora a la subunidad adyacente. GBTA fue el compuesto de prueba con el coeficiente de Hill más alto. Por lo tanto, elegimos este compuesto para Estudió más a fondo el mecanismo de sinergia de unión y utilizó 2GBI como control negativo de referencia. (a) Compuestos de prueba: [1] Inhibidor de Hv1 de referencia 2-guanidino-bencimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidina, [4] nafto[1,2-d][1,3]tiazol-2-ilo -guanidina, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [7] famotidina, [8] éster etílico del ácido 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxílico, [9] etil-1,3-tiazol-5-carboxilato de 2-guanidino-4-metilo, [10 ]acetato de (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etilo, [11]1-[4-(4-clorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina. (b) Inhibición de la actividad del Hv1 humano por los guanidinitiazoles indicados y el compuesto de referencia 2GBI (barras azul-verde) Las corrientes de protones Hv1 se midieron en placas de adentro hacia afuera de ovocitos de Xenopus en respuesta a la despolarización desde un potencial de retención de -80 mV a +120 mV. Cada inhibidor se agregó al baño a una concentración de 200 μM. pHi = pHo = 6,0 Los datos son media ± SEM (n≥4). (c) Inhibición dependiente de la concentración de Hv1 humano por los compuestos [2], [3], [6] y [11]. Cada punto representa la inhibición media ± DE de 3. hasta 15 mediciones. La línea es un ajuste de Hill utilizado para obtener los valores aparentes de Kd informados en la Tabla complementaria 1. Los coeficientes de Hill se determinaron a partir de los ajustes informados en la Figura complementaria 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (ver Métodos). (a,b) Los compuestos 2GBI y GBTA inhibieron Hv1 dimérico y monomérico de una manera dependiente de la concentración. Cada punto representa la inhibición media ± DE de 3 a 8 mediciones y la curva es un ajuste de Hill. Los coeficientes de Hill (h) que se muestran en los histogramas insertados se determinaron a partir de los ajustes informados en las figuras 3 y 4 complementarias. La respuesta de concentración de GBTA que se muestra en (a) es la misma que la de la figura 1c. Consulte la Tabla 1 complementaria para conocer los valores de Kd aparentes. (c) Modelado de la unión cooperativa de GBTA al dimérico Hv1. La línea negra sólida representa el ajuste a los datos experimentales mediante la ecuación (6), que describe el modelo de unión que se muestra en (d). Las líneas discontinuas etiquetadas como Sub 1 y Sub 2 representan la asociación bimolecular. -curvas de equilibrio de disociación del primer y segundo evento de unión, respectivamente (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ). (d) Diagrama esquemático del mecanismo propuesto del bloqueo Hv1. En el caso de GBTA, la unión a una subunidad abierta aumenta la afinidad de la subunidad abierta adyacente (Kd2 0,05) en el coeficiente de Hill de unión de GBTA a los canales de GGG en comparación con el tipo salvaje (Fig. 5c), lo que sugiere que a pesar de su papel en el mantenimiento de la dos subunidades juntas son importantes, pero CCD no media directamente el acoplamiento alostérico entre subunidades entre los sitios de unión de GBTA. (a) Diagrama esquemático del dímero Hv1 con una mutación de triglicina en el extremo interno de S4 diseñado para interrumpir el acoplamiento entre subunidades mediado por el dominio en espiral citoplasmático (flechas azules). (b) Representación esquemática de los dímeros Hv1 y los dímeros de ligación con mutaciones indicadas, diseñadas para probar fragmentos S1 involucrados en el acoplamiento entre subunidades (flechas azules). (c – h) 2GBI (cian) y GBTA (rojo oscuro) inhiben las construcciones indicadas de una manera dependiente de la concentración. Cada punto representa la inhibición media ± DE de 3 a 10 mediciones. La curva fue un ajuste de Hill utilizado para obtener valores de Kd aparentes (consulte la Tabla complementaria 1). Los coeficientes de Hill en los histogramas interpolados se determinaron como se describe en la sección Métodos (consulte las Figuras 3 y 4 complementarias). Valores h de referencia para Hv1 WT se muestran como líneas discontinuas. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre los pasajes mutantes y WT (p 0,05, Fig. 5d, i). ). Por otro lado, la mutación D123A redujo significativamente el coeficiente de Hill de GBTA (p 0,05/14). Dado que neutralizar la carga en la posición 123 en ambas subunidades resultó en un fuerte cambio en la cooperatividad de unión de GBTA, mientras que revertir la carga en ambas subunidades tuvo solo un efecto pequeño, ampliamos el análisis para incluir solo una subunidad con el canal de inversión de carga. generó dímeros unidos a Hv1 con sustitución D123R en la subunidad C-terminal (Fig. 5b) y midió la inhibición de la respuesta a la concentración por GBTA y 2GBI. Descubrimos que el coeficiente de Hill de la unión de GBTA a los canales WT-D123R era significativamente mayor que el de Hv1 de tipo salvaje (p 0,05). También encontramos que en ausencia de βME, el coeficiente de Hill de unión de GBTA al dímero D112E I127C Hv1 fue significativamente mayor que el medido en presencia de agentes reductores (Fig. 6e y Fig. 4 complementaria), lo que implica que la mutación D112E no eliminó el aumento en la cooperatividad de unión de GBTA resultante del entrecruzamiento de la cisteína 127. El coeficiente de Hill de la unión de 2GBI a los dímeros D112E, I127C Hv1 tampoco se vio afectado significativamente por la mutación D112E (Figura 1).6d y Suplementario Fig. 3). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la unión de GBTA se ve reforzada por la interacción entre los extremos externos de los fragmentos S1 en las subunidades Hv1 adyacentes a través de interacciones electrostáticas atractivas o mediante la formación de enlaces covalentes entre cisteínas sustituidas. El acoplamiento alostérico entre sitios aumenta y da como resultado la cooperatividad de unión. Mientras que el efecto de las interacciones electrostáticas atractivas sobre la cooperatividad puede anularse mediante la mutación D112E, el efecto de los enlaces covalentes no puede serlo. En nuestra exploración del espacio químico disponible para unir derivados de guanidina a los canales Hv1, encontramos que los 2-guanidinotiazoles como GBTA tienen una dependencia de la concentración más pronunciada que los 2-guanidinobencimidazoles (Fig. 1c). El análisis del coeficiente de Hill de la unión de GBTA a ambos diméricos y canales monoméricos (Fig. 2a, b) y al canal dimérico en el que una subunidad estaba preunida al inhibidor (Fig. 4) nos llevó a concluir que la inhibición de Hv1 por GBTA La acción es un proceso sinérgico, y los sitios de unión de los compuestos en las dos subunidades están acoplados alostéricamente. El descubrimiento de que GBTA se une al canal abierto, como se demostró previamente para el compuesto relacionado 2GBI32, sugiere que el acoplamiento alostérico se puede evaluar específicamente en el estado abierto. Nuestro modelo de unión cooperativa Pudo describir cuantitativamente la inhibición de Hv1 por GBTA (Fig. 2c) y explicar los diferentes efectos de 2GBI y GBTA en la decadencia de las corrientes de la cola del canal después de la repolarización de la membrana, lo que respalda nuestra interpretación del proceso de unión. El coeficiente de colina máximo que se puede lograr en una proteína alostérica con dos sitios de unión (como HV1) es 2. Medimos GBTA para unir el tipo salvaje HV1 con un coeficiente de 1.31, que aumentó a 1.88 en HV1 I127C. La energía libre sinérgica, la diferencia entre las energías libres de unión de los sitios de afinidad más bajos y más altos (ver métodos), fue de 1.3 kcal/mol en el caso de HV1 de tipo salvaje y 2.7 kcal/moles en el caso de HV1 i127C.The Bindinging de oxígeno a la hemoglobina es el ejemplo más famoso y bien estudiado del proceso de colaboración38. Para la hemoglobina humana (un tetrámero con cuatro sitios de unión acoplados alostéricamente), el coeficiente de colina varía de 2.5-3.0, con valores que varían de 1.26 a 3.64 Kcal/mol, dependiendo de las condiciones experimentales38. Por lo tanto, en términos de energía global, la cooperatividad de la unión de GBTA a HV1 no es sustancialmente diferente de la de la unión de O2 a la hemoglobina cuando se consideran los diferentes números de subunidades de proteínas en los dos sistemas. En nuestro modelo de sinergia, la unión de las moléculas de GBTA a una subunidad da como resultado un aumento en la afinidad de unión de la subunidad adyacente. Imaginamos un proceso en el que una reordenamiento del entorno de unión resultante del primer evento de unión (ajuste inducido) conduce a cambios en las interacciones entre las subunidades. En respuesta a estos cambios, las subunidades adyacentes cambian sus sitios de unión, lo que resulta en una unión de GBTA más estricta. Durante este proceso, el aspartato S1 D112 es responsable del reordenamiento del sitio de unión asociado con una mayor afinidad de unión. D11222 previamente se demostró que era parte de la vía de permeación de protones HV1 y actuaba como filtro de selectividad27,28. Nuestros resultados muestran que los filtros de selectividad en las dos subunidades HV1 se acoplan alostéricamente en el estado abierto. Figura 7a muestra la ubicación aproximada del sitio de unión GBTA y la ubicación de los residuos D112, D123, K125 e I127 en un esquema del HV1 VSD basado en VSD. En la estructura cristalina de la quimera HV1-CIVSP. Las direcciones sugeridas para el acoplamiento alostérico que involucra el extremo extracelular de S1 se muestran con flechas negras. (a) Esquema del HV1 VSD basado en la estructura cristalina de la quimera HV1-CIVSP, se muestra que los segmentos helicoidales son cilíndricos. En esta configuración, el extremo interno del segmento S4 se fusiona con el CCD (no se muestra). Las ubicaciones predichas de GBTA unida se muestran como óvalos grises. Las flechas negras indican vías involucradas en el acoplamiento alostérico entre los sitios de unión en dos subunidades adyacentes. Las posiciones de los residuos S1 investigados están marcadas con esferas de color. (B) Ilustración esquemática de las subunidades HV1 dispuestas en dos configuraciones de dímero diferentes como se ve desde el lado extracelular del plano de la membrana. En el panel izquierdo, la interfaz del dímero está formada por la hélice S4. Separación de los extremos exteriores de las dos hélices S4 (flechas discontinuas), produce la disposición que se muestra a la derecha. En esta configuración, los residuos D123 e I127 de las subunidades adyacentes pueden reunirse juntas. (C) Representación esquemática del CIVSP VSD En la configuración del dímero que se encuentra en la estructura cristalina 4G80. La posición P140 en CIVSP corresponde a la posición D123 en HV1. Nuestros resultados muestran que la interacción electrostática repulsiva entre el residuo 123 (123d/123d o 123R/123R) está asociada con un nivel "normal" de cooperatividad de unión a GBTA en el estado abierto y cambia la interacción de la repulsión a atraída (123d/123R) , aumentó la cooperación (Fig. 5G). Se espera que la eliminación de la interacción repulsiva con la sustitución de alanina también conduzca a una mayor cooperatividad. Sin embargo, se observó una disminución en la cooperatividad del dímero 123A/123A (Fig. 5e). La explicación es que el efecto desestabilizador de colocar residuos hidrofóbicos en un entorno hidrofílico puede superar el efecto estabilizador debido a la eliminación de las interacciones repulsivas entre los residuos D123, lo que resulta en una reducción general en la cooperatividad de unión. Mony et al.39 informaron recientemente que la accesibilidad de solvente AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT La posición D171 de Ciona Gutis CI-HV1 (correspondiente a D123 en HV1 humano) aumenta tras la activación, lo que respalda la noción de que D123 se encuentra en un entorno hidrofílico en el estado abierto. Se sabe que la activación de los canales HV1 ocurre a través de múltiples transiciones 19,20,26,39,40,41.qiu et al26 encontraron que tras la despolarización de la membrana, el sensor de voltaje de CI-HV1 sufre un cambio conformacional que deja el canal activado pero aún cerrado pero aún cerrado , seguido de una transición distinta que hace que los protones abran la conducción en ambas subunidades. El cambio conformacional del sensor de voltaje fue monitoreado por la fluorescencia de la cuello de voltaje, y se descubrió que la segunda transición fue perturbada selectivamente por la mutación en la posición D171. La perturbación de la señal fluorescente es consistente con la presencia de interacciones electrostáticas entre los residuos D171 de las subunidades adyacentes en algún momento a lo largo de las coordenadas de reacción del cambio conformacional. Esta interpretación es consistente con nuestro hallazgo de que el residuo D123 interactúa electrostáticamente en el estado abierto en el estado abierto en el estado abierto. y media el acoplamiento alostérico entre los sitios de unión GBTA. Fujiwara et al25 propusieron que la interfaz del dímero del dominio citoplasmático de bobina en espiral se extiende hacia la membrana para contener dos hélices S4 (Fig. 7b, panel izquierdo). Un modelo de esta interacción entre subunidades se basa en Todo el VSD y el análisis funcional de la región que conecta la hélice S4 y el CCD. En ausencia de un gradiente de pH transmembrana, los canales HV1 requieren una despolarización de membrana considerable para abrir, y la reticulación de cisteína se produce en condiciones donde el canal está predominantemente cerrado. Por lo tanto, la interfaz S4-S4 detectada probablemente refleja la configuración de subunidad fuera del estado. Otros estudios han encontrado evidencia de la participación de S1 y S2 en las interacciones entre subunidades durante la activación de 17,21,26 que sugieren que los canales pueden adoptar diferentes configuraciones de subunidades en el Abierto y Open y Estados cerrados, una idea consistente con los hallazgos de Mony et al. S1 se mueve 39 durante la activación. Aquí, mostramos que, en el estado abierto, los extremos extracelulares de la hélice S1 están lo suficientemente cerca como para soportar interacciones electrostáticas directas que median el acoplamiento alostérico entre las subunidades. En la configuración del dímero con interacciones S4-S4 extendidas, las hélices S1 están demasiado lejos aparte del uno por el otro para interactuar directamente. Sin embargo, una rotación en sentido horario de 20 ° de las dos subunidades VSD alrededor de un eje perpendicular al plano de membrana, combinado con la separación de los extremos exteriores de las dos hélices S4, produjo una configuración S1-S1 consistente con nuestros hallazgos (Fig. 7B, panel derecho). Recomendamos esta configuración para el canal en el estado abierto. Aunque se cree que la enzima CIVSP funciona como un monómero, la estructura cristalina de su VSD aislado se captura en un estado de dímero. Los extremos externos de las hélices S1 en este dímero están espacialmente juntas, y la configuración general es similar a la propuesta Para HV1 (Fig. 7C). En el dímero CIVSP, el residuo más cercano de la subunidad adyacente fue la prolina en la posición 140 (Fig. 7c). Interrumpentemente, P140 en CIVSP corresponde a la posición D123 en HV1. La similitud en la configuración de la subunidad entre HV1 entre HV1 y los dímeros CIVSP sugieren que los VSD de estas proteínas tienen una tendencia intrínseca a formar una interfaz donde interactúan los extremos extracelulares de S1. El papel esencial de HV1 en la activación de las células de los espermatozoides hace que este canal sea un objetivo de fármaco atractivo para el control de la fertilidad masculina. Se ha demostrado que la activación de HV1 en microglia empeora la recuperación de la accidente cerebrovascular isquémico. Se encontró que la actividad de HV1, se asoció con menor Supervivencia en pacientes con seno 12 o cáncer colorrectal 13 y se cree que contribuye a las neoplasias malignas de células B 11. La subunidad HV1 abierta, que conduce a una mayor afinidad de unión, puede conducir al desarrollo de medicamentos más potentes dirigidos a los canales de HV1. La mutagénesis dirigida al sitio de HV1 humano se realizó utilizando técnicas de PCR estándar. En la construcción HV1NCCIVSP, los residuos 1-96 y 228-273 de HV1 fueron reemplazados por los residuos 1-113 y 240-576 de Civsp18. El terminal C de una subunidad está vinculado al extremo n de la segunda subunidad a través del enlazador GGSGGSGGSGSGGSGG. Kit de transcripción de mmmachine T7 MMessage (Ambion) .1-3 días antes de las mediciones electrofisiológicas, se inyectó CRNA en los ovocitos de Xenopus (50 nl por célula, se obtuvieron 0.3-1.5 μg/μl). Se obtuvieron ovocitos VI y VI de Xenopus laevis (Nasco) De la biosciencia de ecocitos. Inyección de ARN de seguimiento, las células se mantuvieron en medio ND96 que contenía NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl 1,8 mM, 1 mM MgCl, HEPES 10 mM, piruvato 5 mM, 100 μg/ml gentamicina, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzotiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidina [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -Thiazol-2-il) guanidina) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxilato [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-tiazol- 5-carboxilato [9] y (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) acetato de etilo [10] fueron de Sigma-Aldrich.famotidina [7] de biomédicos de MP.1- [4 -(4-clorofenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidina [11] y 1- [4- (3,4-dimetoxifenil) -1,3- tiazol-2-il] guanidina [12] fue de Matrix Scientific. Estos compuestos son de la más alta pureza disponible comercialmente. Se disolvieron en DMSO seco para generar una solución madre de 100 mM, que luego se diluyó en la solución de grabación en la concentración final deseada. Al menos 99% de pureza. A una suspensión de clorhidrato de 2-amino-4- (trifluorometil) benzenetiol (1.02 g, 4.5 mmol) en 25 ml de ácido clorhídrico acuoso (2.5 n) se agregó diicyandiamida sólida (380 mg, 4.5 mmol), y la mezcla heterogénea sólida resultante se reflejó con agitación vigorosa durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se neutralizó mediante la adición gradual de hidróxido de potasio 10n. El precipitado blanco formado se filtró, se lavó con agua fría (3 × 50 ml), se secó en un horno (( 65 ° C) durante varias horas, y luego se recristalizan del éter de acetato de etilo/petróleo para dar un sólido blanco (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (luz 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7.25 (muy amplio s, 4 h), 7.40 (d, 1 h, j = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 h), 7.92 (D , 1 H, J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114.2 (D, J = 3.5 Hz), 117.5 (D, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (Q, J = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): valor calculado m/z para C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, encontrado : 261.0419. Nafto [1,2-d] tiazol-2-amina (300 mg, 1,5 mmol), sintetizado como se describió anteriormente, se calentó a 200 ° C en un baño de aceite en un pequeño tubo de ensayo. 300 mg (exceso) de cianamida y 1.0 ml Conc. Al compuesto caliente se agregó ácido clorhídrico rápidamente rápidamente y la mezcla se mantuvo en el baño de aceite durante aproximadamente 2 minutos, durante el cual la mayor parte del agua se evaporó. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el material solidificado resultante resultante se rompió en trozos pequeños y se lavó con agua para proporcionar un sólido amorfo amarillo pálido (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 h, j = 8.2 hz), 7.66 (t, 1 h, j = 8.3 hz), 7.77 (d, 1 h , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 h, j = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 h, j = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 h, j = 8.3 Hz) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z Valor calculado. Para C12H11N4 (M + H) +: 243.0699 , encontrado: 243.0704. Las corrientes de protones se midieron en parches internos y externos de ovocitos que expresan diferentes construcciones utilizando un amplificador Axopatch 200b controlado por un axón digidata 1440a (dispositivos moleculares) con software pClamp10. ) ácido etanosulfónico (MES), mesilato de tetraetilamonio (té) 30 mM, cloruro de té 5 mM, ácido de etilenglicol 5 mM (2-aminoetil) -n, N, N ', ácido n'-tetraacético (EGTA), ajustado a TO pH 6.0 con hidróxido de té. Todas las mediciones se realizaron a 22 ± 2 ° C. La pipeta tiene una resistencia de acceso de 1.5–4 MΩ. Las trazas de corriente se filtraron a 1 kHz, se muestrearon a 5 kHz y se analizaron con Clampfit10.2 (dispositivos moleculares (dispositivos moleculares (dispositivos moleculares ) y Origin8.1 (OriginLab). Las soluciones que contienen varias concentraciones de inhibidor de HV1 y en algunos casos βME 10 mM se introdujeron en el baño por gravedad a través de un colector conectado a un sistema de válvulas de perfusión VC-6 (Warner Instr.), Que se pasó a través del software PCLAMP TTL (Transistor- Lógica del transistor) señales. Los experimentos de perfusión de los rapid se realizaron utilizando un lápiz de perfusión de múltiples tubos (Automatice Sci.) Con una punta de suministro de 360 ​​μm de diámetro montada frente a una pipeta de parche. La inhibición del canal se determinó mediante mediciones amperométricas isocronales al final de la +120 mV pulso de despolarización. Las mediciones de GV se realizaron como se describió anteriormente 18,20. Las corrientes de la cola se registraron a -40 mV después de los pasos de despolarización a diferentes voltajes de -20 mV a +120 mV a menos que se indique lo contrario. El pulso de referencia precede al pulso de prueba es Utilizado para corregir la descomposición actual 18. El gráfico GV se ajusta a la ecuación de Boltzmann: las constantes de disociación aparentes (KD) para diferentes combinaciones de canales e inhibidores (Tabla complementaria 1) se determinaron ajustando la dependencia de la concentración de la inhibición ( %de valores medios de inhibición) Con la ecuación de la colina: donde [i] es la concentración del inhibidor I y H es el coeficiente de la colina. Para calcular el coeficiente de la colina, la ecuación (2) se reorganiza como: