Interogasi antarmuka antarsubunit saluran proton Hv1 terbuka dengan probe yang digabungkan secara alosterik

Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau mematikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan lanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript. Saluran proton berpintu tegangan Hv1 adalah kompleks dimer yang terdiri dari dua domain penginderaan tegangan (VSD), yang masing-masing berisi jalur permeasi proton berpintu. Dimerisasi dikendalikan oleh domain kumparan sitoplasma. Transisi dari keadaan tertutup ke keadaan tertutup keadaan terbuka pada kedua VSD diketahui terjadi secara kooperatif; namun, sedikit yang diketahui tentang mekanisme yang mendasarinya. Antarmuka antarsubunit memainkan peran penting dalam proses alosterik; namun, antarmuka tersebut belum teridentifikasi dalam saluran Hv1 terbuka. Di sini kami menunjukkan bahwa turunan 2-guanidinothiazole memblokir dua VSD Hv1 secara kooperatif dan menggunakan salah satu dari senyawa ini sebagai penyelidikan untuk penggabungan alosterik antara subunit terbuka. Kami menemukan bahwa ekstraseluler ujung fragmen transmembran pertama VSD membentuk antarmuka intersubunit yang memediasi penggandengan antara situs pengikatan, sedangkan domain kumparan tidak terlibat langsung dalam proses ini. Kami juga menemukan bukti kuat bahwa filter selektif proton saluran mengontrol kooperatifitas pengikatan penghambat . Saluran proton berpintu tegangan memainkan peran penting dalam berbagai organisme, dari fitoplankton hingga manusia1. Di sebagian besar sel, saluran ini memediasi penghabisan proton dari membran proton dan mengatur aktivitas NADPH oksidase. Satu-satunya saluran proton berpintu tegangan yang diketahui pada manusia adalah Hv1, yang merupakan produk dari gen HVCN12,3.Hv1 (alias VSOP) telah terbukti berperan dalam proliferasi sel B4, produksi spesies oksigen reaktif oleh sistem kekebalan bawaan5,6,7,8, sel sperma motilitas9 dan pengaturan pH cairan permukaan saluran napas10. Saluran ini terlibat dalam beberapa jenis kanker yang diekspresikan secara berlebihan seperti keganasan sel B4,11 dan kanker payudara dan kolorektal12,13. Aktivitas Hv1 yang berlebihan ditemukan meningkatkan potensi metastasis sel kanker 11, 12 .Di otak, Hv1 diekspresikan oleh mikroglia, dan aktivitasnya telah terbukti memperburuk kerusakan otak pada model stroke iskemik. Protein Hv1 mengandung domain penginderaan tegangan (VSD), yang terdiri dari empat segmen transmembran yang disebut S1 hingga S414. VSD menyerupai domain yang sesuai dari saluran Na+, K+ dan Ca2+ yang diberi gerbang tegangan dan fosfatase peka tegangan, seperti CiVSP dari Ciona gutis15.Dalam protein lain ini, terminal-C S4 melekat pada modul efektor, domain pori atau enzim. Dalam Hv1, S4 dihubungkan dengan domain koil-koil (CCD) yang terletak di sisi sitoplasma membran .Saluran tersebut merupakan kompleks dimer yang terdiri dari dua VSD, masing-masing berisi jalur permeasi proton yang terjaga keamanannya16,17,18. Kedua subunit Hv1 ini ditemukan terbuka secara kooperatif19,20,21,22, menunjukkan bahwa penggandengan alosterik dan interaksi antar-subunit berperan peran penting dalam proses gating. Antarmuka antara subunit dalam domain kumparan terdefinisi dengan baik karena struktur kristal dari dua domain terisolasi tersedia. Di sisi lain, antarmuka antara VSD dalam membran tidak dipahami dengan baik.Struktur kristal protein chimeric Hv1-CiVSP tidak memberikan informasi tentang antarmuka ini, karena organisasi trimerik dari kompleks saluran yang mengkristal mungkin dihasilkan dari penggantian CCD Hv1 asli dengan ritsleting leusin ragi GCN424. Sebuah studi baru-baru ini tentang organisasi subunit saluran Hv1 menyimpulkan bahwa dua heliks S4 bertransisi ke CCD tanpa gangguan parah pada struktur sekunder, menghasilkan heliks panjang yang dimulai dari membran dan menonjol ke sitoplasma. Berdasarkan analisis ikatan silang sistein, penelitian ini mengusulkan bahwa VSD Hv1 saling bersentuhan di sepanjang segmen S4. Namun, penelitian lain telah mengusulkan antarmuka alternatif antara VSD. Antarmuka ini mencakup segmen S1 17, 21, 26 dan ujung luar segmen S2 21. Kemungkinan alasan terjadinya konflik Hasil penelitian ini adalah bahwa kopling alosterik antara VSD diperiksa dalam kaitannya dengan proses gating, yang bergantung pada keadaan tertutup dan terbuka, dan antarmuka antara VSD dapat bervariasi dalam perubahan konformasi keadaan yang berbeda. Di sini, kami menemukan bahwa 2-guanidinothiazole menghambat saluran Hv1 dengan mengikat secara sinergis ke dua VSD terbuka, dan menggunakan salah satu senyawa, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), untuk menyelidiki interaksi antara subunit dalam keadaan terbuka. antarmuka.Kami menemukan bahwa kurva pengikatan GBTA dapat dijelaskan dengan baik oleh model kuantitatif di mana pengikatan inhibitor ke satu subunit menghasilkan peningkatan afinitas pengikatan subunit yang berdekatan. Kami juga menemukan bahwa residu D112, filter selektivitas untuk saluran 27, 28 dan bagian dari situs pengikatan turunan guanidin 29 mengontrol kooperatifitas pengikatan GBTA. Kami menunjukkan bahwa pengikatan kooperatif dipertahankan dalam dimer Hv1, di mana CCD terpisah dari segmen S4, menunjukkan bahwa antarmuka antarsubunit di CCD tidak secara langsung memediasi kopling alosterik antara situs pengikatan GBTA. Sebaliknya, kami menemukan bahwa fragmen S1 adalah bagian dari antarmuka antara subunit dan mengusulkan susunan VSD yang berdekatan dengan ujung ekstraseluler heliks S4 menjauh dari pusat dimer untuk memungkinkan fragmen S1 berada dalam keadaan terbuka. Inhibitor molekul kecil Hv1 berguna sebagai obat antikanker dan agen neuroprotektif. Namun, hingga saat ini, hanya sedikit senyawa yang mampu menghambat saluran tersebut30,31,32,33. Diantaranya, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, senyawa [1] pada Gambar .1a) dan turunannya ditemukan menghalangi permeasi VSD29,32 proton melalui saluran. Pengikatan senyawa tersebut diperkirakan terjadi secara independen dalam dua subunit terbuka.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, senyawa [2] pada Gambar 1a) adalah sebelumnya terbukti menghambat Hv1 hampir sama efektifnya dengan 2GBI ketika diuji pada konsentrasi 200 μM (Gambar 1b). Kami memeriksa turunan tiazol lainnya dan menemukan bahwa beberapa di antaranya menghambat saluran dengan potensi yang sama atau lebih besar daripada GBTA (Gbr. 1 dan Tambahan teks).Kami menentukan kurva respons konsentrasi dari empat turunan tiazol (GBTA dan senyawa [3], [6] dan [11], Gambar 1c) dan menemukan bahwa kurva tersebut lebih curam dibandingkan dengan 2GBI. Koefisien Hill (h) turunan tiazol berkisar antara 1,109 ± 0,040 hingga 1,306 ± 0,033 (Gbr. 1c dan Gambar Tambahan 1). Sebaliknya, koefisien Hill untuk 2GBI adalah 0,975 ± 0,024 (29, Gambar 2a dan Gambar Tambahan 1). Koefisien Hill di atas 1 menunjukkan kooperatifitas pengikatan. Karena setiap subunit Hv1 memiliki inhibitor-nya sendiri. situs pengikatan, 29,32 kami beralasan bahwa pengikatan turunan tiazol ke satu subunit dapat meningkatkan pengikatan molekul inhibitor kedua ke subunit yang berdekatan. GBTA adalah senyawa uji dengan koefisien Hill tertinggi. Oleh karena itu, kami memilih senyawa ini untuk mempelajari lebih lanjut mekanisme sinergi pengikatan dan menggunakan 2GBI sebagai acuan kontrol negatif. (a) Senyawa uji: [1] Referensi Inhibitor Hv1 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidin, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol- 2-il)guanidin, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-asam karboksilat etil ester, [9] 2-guanidino-4-metil Etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil asetat, [11]1-[4-(4 -Klorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Penghambatan aktivitas Hv1 manusia oleh guanidinothiazole yang ditunjukkan dan senyawa referensi 2GBI (batang biru-hijau) .Arus proton Hv1 diukur dalam plak oosit Xenopus dari dalam ke luar sebagai respons terhadap depolarisasi dari potensial penahan -80 mV hingga +120 mV. Setiap inhibitor ditambahkan ke dalam bak pada konsentrasi 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Data adalah rata-rata±SEM (n≥4).(c) Penghambatan Hv1 manusia yang bergantung pada konsentrasi oleh senyawa [2], [3], [6] dan [11].Setiap poin mewakili rata-rata penghambatan ± SD dari 3 hingga 15 pengukuran. Garis tersebut adalah kecocokan Bukit yang digunakan untuk memperoleh nilai Kd nyata yang dilaporkan pada Tabel Tambahan 1. Koefisien bukit ditentukan dari kecocokan yang dilaporkan pada Gambar Tambahan 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 jam(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (lihat Metode). (a,b) Senyawa 2GBI dan GBTA menghambat Hv1 dimerik dan monomerik dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Setiap titik mewakili rata-rata penghambatan ± SD dari 3 hingga 8 pengukuran dan kurvanya adalah Hill fit. Koefisien Hill (h) ditunjukkan pada histogram inset ditentukan dari kecocokan yang dilaporkan pada Gambar Tambahan 3 dan 4. Respon konsentrasi GBTA yang ditunjukkan pada (a) sama dengan pada Gambar. 1c. Lihat Tabel Tambahan 1 untuk nilai Kd yang terlihat. (c) Pemodelan dari pengikatan kooperatif GBTA ke dimerik Hv1. Garis hitam pekat mewakili kesesuaian dengan data eksperimen dengan persamaan (6), yang menggambarkan model pengikatan yang ditunjukkan pada (d). Garis putus-putus berlabel Sub 1 dan Sub 2 mewakili asosiasi bimolekuler -kurva kesetimbangan disosiasi peristiwa pengikatan pertama dan kedua (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diagram skematik mekanisme yang diusulkan dari blok Hv1. Dalam kasus GBTA, pengikatan pada satu subunit terbuka meningkatkan afinitas subunit terbuka yang berdekatan (Kd2 0,05, Gambar. 5d,i) ). Di sisi lain, mutasi D123A secara signifikan mengurangi koefisien Hill GBTA (p 0,05/14). Karena menetralkan muatan pada posisi 123 pada kedua subunit menghasilkan perubahan yang kuat dalam kooperatifitas pengikatan GBTA, sementara membalikkan muatan pada kedua subunit hanya mempunyai pengaruh yang kecil, kami memperluas analisis untuk mencakup hanya satu subunit dengan saluran inversi muatan. Kami menghasilkan dimer terkait Hv1 dengan substitusi D123R di subunit terminal-C (Gbr. 5b) dan mengukur penghambatan respons konsentrasi oleh GBTA dan 2GBI. Kami menemukan bahwa koefisien Hill dari pengikatan GBTA ke saluran WT-D123R secara signifikan lebih tinggi dari itu dari Hv1 tipe liar (p 0,05). Kami juga menemukan bahwa dengan tidak adanya βME, koefisien Hill dari GBTA yang berikatan dengan dimer D112E I127C Hv1 secara signifikan lebih tinggi daripada yang diukur dengan adanya zat pereduksi (Gambar 6e dan Gambar Tambahan 4), menyiratkan bahwa Mutasi D112E tidak menghapuskan peningkatan kooperatifitas pengikatan GBTA yang dihasilkan dari ikatan silang sistein 127. Koefisien Hill dari pengikatan 2GBI dengan dimer D112E, I127C Hv1 juga tidak terpengaruh secara signifikan oleh mutasi D112E (Gambar 1).6d dan Tambahan Gambar 3). Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa pengikatan GBTA ditingkatkan oleh interaksi antara ujung luar fragmen S1 dalam subunit Hv1 yang berdekatan melalui interaksi elektrostatik yang menarik atau melalui pembentukan ikatan kovalen antara sistein tersubstitusi. Kopling alosterik antar situs meningkat dan menghasilkan kooperatifitas pengikatan. Meskipun pengaruh interaksi elektrostatis tarik menarik pada kooperatifitas dapat dihilangkan dengan mutasi D112E, pengaruh ikatan kovalen tidak dapat dihilangkan. Dalam eksplorasi kami tentang ruang kimia yang tersedia untuk mengikat turunan guanidin ke saluran Hv1, kami menemukan bahwa 2-guanidinothiazoles seperti GBTA memiliki ketergantungan konsentrasi yang lebih curam daripada 2-guanidinobenzimidazoles (Gbr. 1c). Analisis koefisien Hill dari pengikatan GBTA pada kedua dimerik dan saluran monomer (Gbr. 2a,b) dan ke saluran dimerik di mana satu subunit telah terikat sebelumnya dengan inhibitor (Gbr. 4) membuat kami menyimpulkan bahwa penghambatan Hv1 oleh GBTA Tindakan tersebut merupakan proses sinergis, dan situs pengikatan senyawa dalam dua subunit digabungkan secara alosterik. Penemuan bahwa GBTA berikatan dengan saluran terbuka, seperti yang ditunjukkan sebelumnya untuk senyawa terkait 2GBI32, menunjukkan bahwa penggandengan alosterik dapat dinilai secara spesifik dalam keadaan terbuka. Model pengikatan kooperatif kami mampu menggambarkan secara kuantitatif penghambatan Hv1 oleh GBTA (Gbr. 2c) dan menjelaskan efek berbeda dari 2GBI dan GBTA pada peluruhan arus saluran ekor setelah repolarisasi membran, yang mendukung interpretasi kami terhadap proses pengikatan. Koefisien bukit maksimum yang dapat dicapai dalam protein alosterik dengan dua situs pengikatan (seperti HV1) adalah 2. Kami mengukur GBTA untuk mengikat tipe liar HV1 dengan koefisien 1,31, yang meningkat menjadi 1,88 pada HV1 I127C. Energi bebas sinergis, perbedaan antara energi bebas pengikatan dari situs afinitas terendah dan tertinggi (lihat metode), adalah 1,3 kkal/mol dalam kasus tipe liar HV1 dan 2,7 kkal/mol dalam kasus HV1 I127C. Oksigen ke hemoglobin adalah contoh paling terkenal dan dipelajari dengan baik dari proses kolaboratif38. Untuk hemoglobin manusia (tetramer dengan empat situs pengikatan yang digabungkan secara alosterik), koefisien bukit berkisar antara 2,5-3,0, dengan nilai-nilai berkisar antara 1,26 hingga 3.64 Kcal/mol, tergantung pada kondisi eksperimental38. Dengan demikian, dalam hal energetika global, kooperatifitas pengikatan GBTA dengan HV1 tidak secara substansial berbeda dari yang mengikat O2 dengan hemoglobin ketika jumlah subunit protein yang berbeda dalam kedua sistem dipertimbangkan. Dalam model sinergi kami, pengikatan molekul GBTA ke satu subunit menghasilkan peningkatan afinitas pengikatan dari subunit yang berdekatan. Kami membayangkan proses di mana penataan ulang lingkungan pengikatan yang dihasilkan dari peristiwa pengikatan pertama (Fit yang diinduksi) mengarah ke mengarah ke mengarah ke mengarah ke mengarah ke Perubahan interaksi antara subunit. Dalam respons terhadap perubahan ini, subunit yang berdekatan mengubah situs pengikatan mereka, menghasilkan pengikatan GBTA yang lebih ketat. Selama proses ini, S1 aspartat D112 bertanggung jawab untuk penataan ulang situs pengikatan yang terkait dengan peningkatan afinitas pengikatan. D112 sebelumnya terbukti menjadi bagian dari jalur permeasi proton HV1 dan bertindak sebagai selektivitas filter27,28. Hasil kami menunjukkan bahwa filter selektivitas di dua subunit HV1 secara allosterically digabungkan dalam keadaan terbuka. Gambar 7A menunjukkan perkiraan lokasi situs pengikatan GBTA dan lokasi residu D112, D123, K125 dan I127 pada skematik berbasis HV1 VSD HV1 VSD HV1 VSD pada struktur kristal chimera HV1-CIVSP. Arah yang diserap untuk kopling alosterik yang melibatkan ujung ekstraseluler S1 ditunjukkan dengan panah hitam. (A) Skema HV1 VSD. Berdasarkan struktur kristal chimera HV1-CIVSP, segmen heliks terbukti silinder. Dalam konfigurasi ini, ujung dalam segmen S4 bergabung dengan CCD (tidak ditampilkan). Lokasi yang diprediksi GBTA terikat ditampilkan sebagai oval abu -abu. Panah hitam menunjukkan jalur yang terlibat dalam kopling alosterik antara situs pengikatan di dua subunit yang berdekatan. Posisi residu S1 yang diselidiki ditandai dengan bola berwarna. (B) Ilustrasi skematik dari subunit HV1 yang diatur diatur. Dalam dua konfigurasi dimer yang berbeda seperti yang terlihat dari sisi ekstraseluler bidang membran. Di panel kiri, antarmuka dimer dibentuk oleh heliks S4. Pemisahan ujung luar dari dua heliks S4 (panah putus -putus), menghasilkan pengaturan yang ditunjukkan di sebelah kanan. Dalam konfigurasi ini, residu D123 dan I127 dari subunit yang berdekatan diizinkan untuk bersatu. (c) Representasi skematik dari CIVSP VSD VSD Dalam konfigurasi dimer yang ditemukan dalam struktur kristal 4G80. Posisi P140 di CIVSP sesuai dengan posisi D123 dalam HV1. Hasil kami menunjukkan bahwa interaksi elektrostatik menjijikkan antara residu 123 (123D/123D atau 123R/123R) dikaitkan dengan tingkat "normal" dari kooperatifitas pengikat GBTA dalam keadaan terbuka dan menggeser interaksi dari tolakan ke yang tertarik (123D/123R) , peningkatan kerja sama (Gbr. 5G). Diharapkan bahwa penghapusan interaksi menjijikkan dengan substitusi alanin juga akan menyebabkan peningkatan kooperativitas. Namun, penurunan kooperatifitas dimer 123a/123a diamati (Gbr. 5e). Satu mungkin. Penjelasannya adalah bahwa efek destabilisasi dari menempatkan residu hidrofobik dalam lingkungan hidrofilik dapat lebih besar daripada efek stabilisasi karena penghapusan interaksi menjijikkan antara residu D123, yang mengakibatkan pengurangan keseluruhan dalam mengikat kooperatifitas. Posisi D171 dari Ciona gutis CI-HV1 (sesuai dengan D123 pada HV1 manusia) meningkat pada aktivasi, mendukung gagasan bahwa D123 terletak di lingkungan hidrofilik dalam keadaan terbuka. Gating saluran HV1 diketahui terjadi melalui beberapa transisi19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 menemukan bahwa pada depolarisasi membran, sensor tegangan CI-HV1 mengalami perubahan konformasi yang membuat saluran diaktifkan tetapi masih tertutup , diikuti oleh transisi berbeda yang menyebabkan proton membuka konduksi di kedua jalur subunit. Perubahan konformasi dari sensor tegangan dipantau oleh fluoresensi penjepit tegangan, dan ditemukan bahwa transisi kedua secara selektif terganggu oleh mutasi pada posisi D171. Gangguan sinyal fluoresen konsisten dengan adanya interaksi elektrostatik antara residu D171 dari subunit yang berdekatan di beberapa titik di sepanjang koordinat reaksi dari perubahan konformasi. Interpretasi ini konsisten dengan temuan kami bahwa residu D123 berinteraksi secara elektrostatik berinteraksi dalam keadaan terbuka secara terbuka dalam keadaan terbuka secara elektrostatik berinteraksi dalam keadaan terbuka D123 secara elektrostatik dan memediasi kopling alosterik antara situs pengikatan GBTA. Fujiwara et al25 mengusulkan bahwa antarmuka dimer dari domain koil sitoplasma meluas ke membran untuk mengandung dua heliks S4 (Gbr. 7b, panel kiri). Sebuah model interaksi intersubunit ini didasarkan pada sistein analisis cross-linking analisis cross-link. Seluruh VSD dan analisis fungsional daerah yang menghubungkan heliks S4 dan CCD. Dalam tidak adanya gradien pH transmembran, saluran HV1 membutuhkan depolarisasi membran yang cukup besar untuk dibuka, dan pengikatan silang sistein terjadi dalam kondisi di mana saluran sebagian besar ditutup. Oleh karena itu, antarmuka S4-S4 yang terdeteksi kemungkinan mencerminkan konfigurasi subunit off-state. Studi lain telah menemukan bukti untuk keterlibatan S1 dan S2 dalam interaksi intersubunit selama gating17,21,26 yang menunjukkan bahwa saluran dapat mengadopsi konfigurasi subunit yang berbeda di terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan terbuka dan open dan open dan open keadaan tertutup, sebuah ide yang konsisten dengan temuan Mony et al. S1 bergerak 39 selama gating. Di sini, kami menunjukkan bahwa, dalam keadaan terbuka, ujung ekstraseluler heliks S1 cukup dekat untuk mendukung interaksi elektrostatik langsung yang memediasi kopling alosterik antara subunit. Dalam konfigurasi dimer dengan interaksi S4-S4 yang diperluas, heliks S1 terlalu jauh jauh Terlepas dari satu sama lain untuk berinteraksi secara langsung. Namun, rotasi 20 ° searah jarum jam dari dua subunit VSD di sekitar sumbu tegak lurus terhadap bidang membran, dikombinasikan dengan pemisahan ujung luar dari dua heliks S4, menghasilkan konfigurasi S1-S1 yang konsisten konsisten Dengan temuan kami (Gbr. 7b, panel kanan). Kami merekomendasikan konfigurasi ini untuk saluran dalam keadaan terbuka. Meskipun enzim CIVSP dianggap berfungsi sebagai monomer, struktur kristal VSD terisolasi ditangkap dalam keadaan dimer. Ujung luar heliks S1 dalam dimer ini secara spasial berdekatan, dan konfigurasi keseluruhan mirip dengan yang diusulkan yang diusulkan yang diusulkan Untuk HV1 (Gbr. 7C). Dalam dimer civsp, residu terdekat dari subunit yang berdekatan adalah prolin pada posisi 140 (Gbr. 7C). Yang menarik, p140 dalam civsp sesuai dengan posisi D123 dalam HV1. Kesamaan dalam konfigurasi subunit antara HV1 dan dimer civsp menunjukkan bahwa VSD protein ini memiliki kecenderungan intrinsik untuk membentuk antarmuka di mana ujung ekstraseluler S1 berinteraksi. Peran penting HV1 dalam aktivasi sel sperma menjadikan saluran ini target obat yang menarik untuk mengendalikan kesuburan pria. Furthermore, aktivasi HV1 dalam mikroglia telah terbukti memperburuk pemulihan dari stroke iskemik. Aktivitas HV1 yang ditingkatkan ditemukan terkait dengan yang lebih rendah Kelangsungan hidup pada pasien dengan payudara 12 atau kanker kolorektal 13 dan diperkirakan berkontribusi pada keganasan sel-B 11. Oleh karena itu, obat molekul kecil yang menargetkan HV1 dapat digunakan sebagai agen neuroprotektif atau terapi antikanker. Subunit HV1 terbuka, yang mengarah pada peningkatan afinitas pengikatan, dapat menyebabkan pengembangan obat yang lebih kuat yang menargetkan saluran HV1. Site-directed mutagenesis of human Hv1 was performed using standard PCR techniques.In the Hv1NCCiVSP construct, residues 1-96 and 228-273 of Hv1 were replaced by residues 1-113 and 240-576 of CiVSP18.In the Hv1-linked dimer, C-terminus dari satu subunit terkait dengan N-terminus subunit kedua melalui linker ggsggsggsggsgg. T7 MMessage Kit Transkripsi Mmachine (Ambion) .1-3 hari sebelum pengukuran elektrofisiologis, cRNA disuntikkan ke oosit Xenopus (50 nL per sel, 0,3-1,5 μg/μL). Tahap V dan VI oosit dari Xenopus laevis (NASCO) diperoleh V dan VI oosit dari Xenopus laevis (NASCO) diperoleh V dan VI oosit dari Xenopus laevis (NASCO) diperoleh. Dari bioscience ecocyte. Mengikuti injeksi RNA, sel dipertahankan dalam medium ND96 yang mengandung 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CACL, 1 mM Mgcl, 10 mM HEPES, 5 mM piruvat, 100 μg/ml gentamin, pH 7,2 18 ° C, 100 μg/mL gentamin, pH 7,2 18 ° C C, 100 μg/mL gentamin, pH 7,2 18 ° C, 100 μg/mL/ml, pH 7,2 18 ° C C CAC . 2-guanidino-benzimidazole [1], 2-guanidino-benzothiazole [2], (4-metil-1,3-thiazol-2-yl) guanidine [5], (5-Bromo-4-metil-1,3 -Tiazol-2-yl) guanidine) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-thiazole-4-karboksilat [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-thiazole- 5-karboksilat [9] dan (2-guanidino-4-metil-1,3-thiazol-5-yl) etil asetat [10] berasal dari sigma-aldrich.famotidine [7] berasal dari biomedis MP.1- [4 -(4-chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine [11] dan 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3- tiazol-2-yl] guanidine [12] dari matriks ilmiah. Senyawa ini memiliki kemurnian tertinggi yang tersedia secara komersial. setidaknya 99% kemurnian. Untuk suspensi benzenethiol hidroklorida 2-amino-4- (trifluoromethyl) (1,02 g, 4,5 mmol) dalam 25 mL asam hidroklorat berair (2,5 N) ditambahkan padat dicyandiamide (380 mg, 4,5 mmol), dan campuran campuran yang ditimbulkan oleh penggerak yang ditimbulkan oleh hiasan campuran yang digerakkan oleh hiasan campuran hiasan yang digerakkan oleh hiasan yang ditahan oleh gesekan yang ditimbulkan. direfluks dengan pengadukan kuat selama 4 jam. Campuran reaksi didinginkan hingga suhu kamar dan dinetralkan dengan penambahan bertahap dari 10n kalium hidroksida. Endapan putih yang terbentuk disaring, dicuci dengan air dingin (3 × 50 mL), dikeringkan dalam oven ( 65 ° C) selama beberapa jam, dan kemudian direkristalisasi dari etil asetat/minyak bumi eter untuk memberikan padatan putih (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (cahaya 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7.25 (sangat luas S, 4 H), 7.40 (d, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (S, 1 H), 7.92 (d , 1 h, j = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114.2 (D, J = 3,5 Hz), 117.5 (D, J = 3,5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126.1 (q, j = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): M/Z Nilai yang Dihitung. Untuk C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, ditemukan : 261.0419. Naphtho[1,2-d]thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), synthesized as previously described, was heated to 200 °C in an oil bath in a small test tube.300 mg (large excess) cyanamide and 1,0 ml konsel ke senyawa panas ditambahkan asam klorida dengan cepat dan campuran disimpan dalam penangas minyak selama sekitar 2 menit, selama waktu itu sebagian besar air menguap. Campuran reaksi kemudian didinginkan hingga suhu kamar dan bahan yang dipadatkan yang dihasilkan. dipecah menjadi potongan-potongan kecil dan dicuci dengan air untuk menyediakan padatan amorf kuning pucat (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, j = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 H, j = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 H , J = 8.6 Hz), 7.89 (D, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (D, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (D, 1 H, J = 8.3 Hz) .13C NMR (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z Nilai yang dihitung. Untuk C12H11N4S (M + H) +: 243.069 , ditemukan: 243.0704. Arus proton diukur dalam tambalan internal dan eksternal oosit yang mengekspresikan konstruksi yang berbeda menggunakan penguat 200b Axopatch yang dikendalikan oleh Axon digidata 1440a (perangkat molekuler) dengan perangkat lunak PCLAMP10. ) Asam etanesulfonat (MES), 30 mM tetraethylammonium (teh) mesylate, 5 mM teh klorida, 5 mM etilen glikol-bis (2-aminoetil) -N, N, N ', asam n'-tetraasetat (EGTA), disesuaikan dengan pH 6.0 dengan teh hidroksida. Semua pengukuran dilakukan pada 22 ± 2 ° C. Pipet memiliki resistensi akses 1,5-4 MΩ. Jejak arus disaring pada 1 kHz, sampel pada 5 kHz dan dianalisis dengan klemfit10.2 (perangkat molekuler (molekulnya ) dan Origin.1 (OriginLab). Solusi yang mengandung berbagai konsentrasi inhibitor HV1 dan dalam beberapa kasus 10 mM βMe dimasukkan ke dalam rendaman dengan gravitasi melalui manifold yang terhubung ke sistem katup perfusi VC-6 (Warner Instr.), Yang dilewatkan melalui perangkat lunak PCLAMP TTL (transistor- Logika Transistor) Sinyal. Eksperimen perfusi rapid dilakukan dengan menggunakan pensil perfusi multi-tabung (Automate Sci.) Dengan ujung pengiriman berdiameter 360 μm yang dipasang di depan pipet. Pengukuran Depolarisasi Pulse.GV +120 mV dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya18,20. Arus TAIL dicatat pada -40 mV setelah langkah depolarisasi pada tegangan yang berbeda dari -20 mV ke +120 mV kecuali dinyatakan sebaliknya. Pulsa referensi sebelumnya pulsa uji adalah Digunakan untuk mengoreksi peluruhan saat ini 18. Grafik GV sesuai dengan persamaan Boltzmann: konstanta disosiasi yang jelas (KD) untuk kombinasi saluran dan inhibitor yang berbeda (Tambahan Tabel 1) ditentukan dengan memasang ketergantungan konsentrasi penghambatan (nilai rata -rata %inhib)) Dengan persamaan bukit: di mana [i] adalah konsentrasi inhibitor I dan H adalah koefisien bukit. Untuk menghitung koefisien bukit, persamaan (2) diatur ulang sebagai: