Interrogazione dell'interfaccia intersubunità del canale protonico aperto Hv1 con una sonda accoppiata allostericamente

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Qui dimostriamo che i derivati ​​del 2-guanidinotiazolo bloccano due VSD Hv1 in modo cooperativo e utilizzano uno di questi composti come sonda per l'accoppiamento allosterico tra subunità aperte. Abbiamo scoperto che i canali extracellulari l'estremità del primo frammento transmembrana del VSD forma un'interfaccia intersubunità che media l'accoppiamento tra i siti di legame, mentre il dominio della bobina a spirale non è direttamente coinvolto in questo processo. Abbiamo anche trovato prove evidenti che il filtro selettivo protonico del canale controlla la cooperatività di legame del bloccante . I canali protonici voltaggio-dipendenti svolgono ruoli importanti in una varietà di organismi, dal fitoplancton agli esseri umani.1. Nella maggior parte delle cellule, questi canali mediano l'efflusso di protoni dalla membrana protonica e regolano l'attività della NADPH ossidasi. è Hv1, che è il prodotto del gene HVCN12,3. È stato dimostrato che Hv1 (noto anche come VSOP) svolge un ruolo nella proliferazione delle cellule B4, nella produzione di specie reattive dell'ossigeno da parte del sistema immunitario innato5,6,7,8, nello sperma motilità9 e regolazione del pH del fluido superficiale delle vie aeree10. Questo canale è coinvolto in diversi tipi di cancro, come i tumori maligni delle cellule B4,11 e i tumori della mammella e del colon-retto12,13. È stato riscontrato che un'attività eccessiva dell'Hv1 aumenta il potenziale metastatico delle cellule tumorali11, 12. Nel cervello, l'Hv1 è espresso dalla microglia, e la sua attività ha dimostrato di esacerbare il danno cerebrale in modelli di ictus ischemico. La proteina Hv1 contiene un dominio di rilevamento del voltaggio (VSD), che consiste di quattro segmenti transmembrana chiamati da S1 a S414. Il VSD assomiglia ai domini corrispondenti dei canali Na+, K+ e Ca2+ voltaggio-dipendenti e delle fosfatasi sensibili al voltaggio, come CiVSP da Ciona gutis15. In queste altre proteine, il C-terminale di S4 è attaccato a un modulo effettore, il dominio dei pori o enzima. In Hv1, S4 è collegato al dominio coiled-coil (CCD) situato sul lato citoplasmatico della membrana .Il canale è un complesso dimerico costituito da due VSD, ciascuno contenente un percorso di permeazione protonica recintata16,17,18. È stato scoperto che queste due subunità Hv1 si aprono in modo cooperativo19,20,21,22, suggerendo che l'accoppiamento allosterico e le interazioni inter-subunità giocano un ruolo importante nel processo di gating. L'interfaccia tra le subunità all'interno del dominio della bobina a spirale è ben definita perché le strutture cristalline dei due domini isolati sono disponibili22,23. D'altra parte, l'interfaccia tra i VSD all'interno della membrana non è ben compreso. La struttura cristallina della proteina chimerica Hv1-CiVSP non fornisce informazioni su questa interfaccia, poiché l'organizzazione trimerica del complesso del canale cristallizzato può derivare dalla sostituzione del CCD Hv1 nativo con la cerniera leucina del lievito GCN424. Un recente studio sull'organizzazione della subunità del canale Hv1 ha concluso che due eliche S4 transitano nel CCD senza grave interruzione della struttura secondaria, risultando in lunghe eliche che partono dalla membrana e si proiettano nel citoplasma. Basandosi sull'analisi della reticolazione della cisteina, questo studio propone che i VSD Hv1 entrino in contatto tra loro lungo il segmento S4. Tuttavia, altri studi hanno proposto interfacce alternative tra i VSD. Queste interfacce includono i segmenti S1 17, 21, 26 e le estremità esterne del segmento S2 21. Una possibile ragione per il conflitto I risultati di questi studi sono che l'accoppiamento allosterico tra VSD è stato esaminato in relazione al processo di gating, che dipende dagli stati chiuso e aperto, e l'interfaccia tra VSD può variare in diversi cambiamenti di stato nella conformazione. Qui, abbiamo scoperto che il 2-guanidinotiazolo inibisce i canali Hv1 legandosi sinergicamente a due VSD aperti e abbiamo utilizzato uno dei composti, il 2-guanidinobenzotiazolo (GBTA), per sondare l'interazione tra le subunità nello stato aperto. interfaccia. Abbiamo scoperto che la curva di legame GBTA può essere ben descritta da un modello quantitativo in cui il legame di un inibitore a una subunità determina un aumento dell'affinità di legame della subunità adiacente. Abbiamo anche scoperto che i residui D112, filtri di selettività per l' i canali 27, 28 e parte del sito di legame del derivato della guanidina 29 controllano la cooperatività del legame GBTA. Mostriamo che il legame cooperativo è mantenuto nel dimero Hv1, dove il CCD si separa dal segmento S4, suggerendo che l'interfaccia intersubunità nel CCD non si collega direttamente mediano l'accoppiamento allosterico tra i siti di legame GBTA. Al contrario, troviamo che il frammento S1 fa parte dell'interfaccia tra le subunità e proponiamo una disposizione di VSD adiacenti con l'estremità extracellulare dell'elica S4 lontana dal centro del dimero per consentire il frammento S1 sia nello stato aperto. Gli inibitori di piccole molecole di Hv1 sono utili come farmaci antitumorali e agenti neuroprotettivi. Tuttavia, ad oggi, pochi composti sono stati in grado di inibire il canale30,31,32,33. Tra questi, il 2-guanidinobenzimidazolo (2GBI, composto [1] in Fig. 1a) e i suoi derivati ​​​​bloccano la permeazione di VSD29,32 dei protoni attraverso il canale. Si ritiene che il legame di tali composti avvenga indipendentemente nelle due subunità aperte. Il 2-guanidinobenzotiazolo (GBTA, composto [2] nella Figura 1a) era precedentemente dimostrato di inibire Hv1 quasi con la stessa efficacia di 2GBI quando testato a una concentrazione di 200 μM (Figura 1b). Abbiamo esaminato altri derivati ​​tiazolici e abbiamo scoperto che alcuni di essi inibivano il canale con potenza simile o maggiore rispetto a GBTA (Fig. 1 e Supplementare testo). Abbiamo determinato le curve di risposta alla concentrazione di quattro derivati ​​tiazolici (GBTA e composti [3], [6] e [11], Fig. 1c) e abbiamo scoperto che erano più ripide di quelle di 2GBI. I coefficienti di Hill (h) dei derivati ​​tiazolici variava da 1,109 ± 0,040 a 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c e Figura 1 supplementare). Al contrario, il coefficiente di Hill per 2GBI era 0,975 ± 0,024 29, Figura 2a e Figura 1 supplementare). Un coefficiente di Hill superiore a 1 indica cooperatività di legame. Poiché ciascuna subunità Hv1 ha il proprio inibitore- sito di legame,29,32 abbiamo pensato che il legame di un derivato tiazolico a una subunità potesse potenziare il legame di una seconda molecola inibitrice alla subunità adiacente. GBTA era il composto di prova con il coefficiente di Hill più alto. Pertanto, abbiamo scelto questo composto per studiare ulteriormente il meccanismo della sinergia legante e utilizzare 2GBI come controllo negativo di riferimento. (a) Composti da testare: [1] Inibitore Hv1 di riferimento 2-guanidino-benzimidazolo (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazolo (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidina, [4] nafto[1,2-d][1, 3] tiazol-2-il -guanidina, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [7] famotidina, [8] estere etilico dell'acido 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazolo-4-carbossilico, [9] 2-guanidino-4-metil etil-1,3-tiazolo-5-carbossilato, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etile acetato, [11]1-[4-(4 -clorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina, [ 12]1-[4-(3,4-dimetossifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina. (b) Inibizione dell'attività Hv1 umana da parte dei guanidinotiazoli indicati e del composto di riferimento 2GBI (barre blu-verdi) .Le correnti protoniche Hv1 sono state misurate in placche rovesciate di ovociti di Xenopus in risposta alla depolarizzazione da un potenziale di mantenimento da -80 mV a +120 mV. Ciascun inibitore è stato aggiunto al bagno a una concentrazione di 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .I dati sono medi±SEM (n≥4). (c) Inibizione dipendente dalla concentrazione dell'Hv1 umano da parte dei composti [2], [3], [6] e [11]. Ogni punto rappresenta l'inibizione media ± DS di 3 a 15 misurazioni. La linea è un adattamento di Hill utilizzato per ottenere i valori Kd apparenti riportati nella Tabella supplementare 1. I coefficienti di Hill sono stati determinati dagli adattamenti riportati nella Figura 1 supplementare: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (vedere Metodi). (a,b) I composti 2GBI e GBTA hanno inibito l'Hv1 dimerico e monomerico in modo dipendente dalla concentrazione. Ogni punto rappresenta l'inibizione media ± SD di 3-8 misurazioni e la curva è un adattamento di Hill. I coefficienti di Hill (h) mostrati in gli istogrammi inseriti sono stati determinati dagli adattamenti riportati nelle Figure 3 e 4 supplementari. La risposta alla concentrazione di GBTA mostrata in (a) è la stessa di quella in Fig. 1c. Vedere la Tabella supplementare 1 per i valori Kd apparenti. (c) Modellazione di il legame cooperativo di GBTA al dimerico Hv1. La linea nera continua rappresenta l'adattamento ai dati sperimentali mediante l'equazione (6), che descrive il modello di legame mostrato in (d). Le linee tratteggiate etichettate Sub 1 e Sub 2 rappresentano l'associazione bimolecolare -curve di equilibrio di dissociazione del primo e del secondo evento di legame, rispettivamente (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diagramma schematico del meccanismo proposto del blocco Hv1. Nel caso di GBTA, il legame con una subunità aperta aumenta l'affinità della subunità aperta adiacente (Kd2 0,05) del coefficiente di Hill del legame GBTA ai canali GGG rispetto al tipo selvaggio (Fig. 5c), suggerendo che, nonostante il suo ruolo nel mantenere il due subunità insieme sono importanti, ma il CCD non media direttamente l'accoppiamento allosterico intersubunità tra i siti di legame GBTA. (a) Diagramma schematico del dimero Hv1 con una mutazione della triglicina all'estremità interna di S4 progettata per interrompere l'accoppiamento intersubunità mediato dal dominio coiled-coil citoplasmatico (frecce blu). (b) Rappresentazione schematica dei dimeri Hv1 e dei dimeri di ligazione con mutazioni indicate, progettate per testare i frammenti S1 coinvolti nell'accoppiamento tra subunità (frecce blu). (c – h) 2GBI (ciano) e GBTA (rosso scuro) inibiscono i costrutti indicati in modo concentrazione-dipendente. Ogni punto rappresenta l'inibizione media ± DS da 3 a 10 misurazioni. La curva era un adattamento di Hill utilizzato per ottenere valori Kd apparenti (vedere Tabella supplementare 1). I coefficienti di Hill negli istogrammi interpolati sono stati determinati come descritto nella sezione Metodi (vedere Figure 3 e 4 supplementari). Valori h di riferimento per I WT Hv1 sono mostrati come linee tratteggiate. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative tra i passaggi mutanti e WT (p 0,05, Fig. 5d, i) ). D'altra parte, la mutazione D123A ha ridotto significativamente il coefficiente di Hill di GBTA (p 0,05/14). Poiché la neutralizzazione della carica in posizione 123 su entrambe le subunità ha comportato un forte cambiamento nella cooperatività di legame del GBTA, mentre l'inversione della carica su entrambe le subunità ha avuto solo un piccolo effetto, abbiamo esteso l'analisi per includere solo una subunità con il canale di inversione della carica. generato dimeri legati a Hv1 con sostituzione D123R nella subunità C-terminale (Fig. 5b) e misurato l'inibizione concentrazione-risposta da parte di GBTA e 2GBI. Abbiamo scoperto che il coefficiente di Hill del legame GBTA ai canali WT-D123R era significativamente più alto di quello di Hv1 wild-type (p 0,05). Abbiamo anche scoperto che in assenza di βME, il coefficiente di Hill del legame GBTA al dimero D112E I127C Hv1 era significativamente più alto di quello misurato in presenza di agenti riducenti (Fig. 6e e Fig. 4 supplementare), implicando che la mutazione D112E non ha abolito l'aumento della cooperatività del legame GBTA risultante dalla reticolazione della cisteina 127. Anche il coefficiente di Hill del legame 2GBI ai dimeri D112E, I127C Hv1 non è stato influenzato in modo significativo dalla mutazione D112E (Figura 1).6d e Supplementare Figura 3). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che il legame GBTA è potenziato dall'interazione tra le estremità esterne dei frammenti S1 nelle subunità Hv1 adiacenti attraverso interazioni elettrostatiche attraenti o attraverso la formazione di legami covalenti tra cisteine ​​sostituite. L'accoppiamento allosterico tra i siti aumenta e determina una cooperatività di legame. Mentre l’effetto delle interazioni elettrostatiche attrattive sulla cooperatività può essere abolito dalla mutazione D112E, l’effetto dei legami covalenti no. Nella nostra esplorazione dello spazio chimico disponibile per legare i derivati ​​della guanidina ai canali Hv1, abbiamo scoperto che i 2-guanidinotiazoli come GBTA hanno una dipendenza dalla concentrazione più ripida rispetto ai 2-guanidinobenzimidazoli (Fig. 1c). L'analisi del coefficiente di Hill del legame GBTA sia al dimerico e canali monomerici (Fig. 2a,b) e al canale dimerico in cui una subunità era pre-legata all'inibitore (Fig. 4) ci hanno portato a concludere che l'inibizione di Hv1 da parte di GBTA L'azione è un processo sinergico, e i siti di legame dei composti nelle due subunità sono accoppiati allostericamente. La scoperta che GBTA si lega al canale aperto, come precedentemente mostrato per il relativo composto 2GBI32, suggerisce che l'accoppiamento allosterico può essere valutato specificamente nello stato aperto. Il nostro modello di legame cooperativo è stato in grado di descrivere quantitativamente l'inibizione di HV1 da parte di GBTA (Fig. 2c) e spiegare i diversi effetti di 2GBI e GBTA sul decadimento delle correnti di coda del canale dopo la ripolarizzazione della membrana, che supporta la nostra interpretazione del processo di legame. Il coefficiente massimo di collina che può essere raggiunto in una proteina allosterica con due siti di legame (come HV1) è 2. Abbiamo misurato GBTA per legare Hv1 wild-type con un coefficiente di 1,31, che è aumentato a 1,88 in HV1 I127C.THE L'energia libera sinergica, la differenza tra le energie libere di legame dei siti di affinità più bassi e più alti (vedi metodi), era di 1,3 kcal/mole nel caso di Hv1 wild-type e 2,7 kcal/mole nel caso di HV1 i127c. di ossigeno all'emoglobina è l'esempio più famoso e ben studiato del processo collaborativo38. Per l'emoglobina umana (un tetramero con quattro siti di legame accoppiati allostericamente), il coefficiente di collina varia da 2,5-3.0, con valori che vanno da 1,26 a 3,64 kcal/mol, a seconda delle condizioni sperimentali38.Questo, in termini di energia globale, la cooperatività del legame GBTA con HV1 non è sostanzialmente diversa da quella del legame O2 all'emoglobina quando vengono considerati il ​​diverso numero di subunità proteiche nei due sistemi. Nel nostro modello di sinergia, il legame delle molecole GBTA a una subunità provoca un aumento dell'affinità di legame della subunità adiacente. Prevediamo un processo in cui un riarrangiamento dell'ambiente di legame derivante dal primo evento di legame (adattamento indotto) Cambiamenti nelle interazioni tra le subunità. In risposta a questi cambiamenti, le subunità adiacenti cambiano i loro siti di legame, con conseguente legame GBTA più stretto. Durante questo processo, l'Aspartato S1 D112 è responsabile del riarrangiamento del sito di legame associato ad un aumento dell'affinità di legame.d112 In precedenza era stato dimostrato di far parte del percorso di permeazione del protone HV1 e di fungere da filtro di selettività27,28. I nostri risultati mostrano che i filtri di selettività nelle due subunità HV1 sono accoppiati allostericamente nello stato aperto. Figura 7A mostra la posizione approssimativa del sito di legame GBTA e la posizione dei residui D112, D123, K125 e I127 su uno schema HV1 Sulla struttura cristallina della chimera Hv1-Civsp. Le direzioni cosgenti per l'accoppiamento allosterico che coinvolgono l'estremità extracellulare di S1 ​​sono mostrate con frecce nere. (A) Schema di HV1 VSD. Basato sulla struttura cristallina della chimera HV1-Civsp, i segmenti elicoidali sono mostrati cilindrici. In questa configurazione, l'estremità interna del segmento S4 si fonde con il CCD (non mostrato). Le posizioni previste di GBTA legate sono mostrate come ovali grigi. Le frecce nere indicano i percorsi coinvolti nell'accoppiamento allosterico tra siti di legame in due subunità adiacenti. Le posizioni dei residui S1 studiati sono contrassegnate con sfere colorate. (B) Illustrazione schematica delle subunità HV1 disposte In due diverse configurazioni di dimero come si vede dal lato extracellulare del piano di membrana. Sul pannello sinistro, l'interfaccia del dimero è formata dall'elica S4. Rrotazione dei due VSD 20 gradi in senso orario attorno a un asse perpendicolare al piano di membrana, accompagnata da Separazione delle estremità esterne delle due eliche S4 (frecce tratteggiate), produce la disposizione mostrata a destra. In questa configurazione, i residui D123 e I127 da subunità adiacenti possono avvicinarsi. (C) Rappresentazione schematica del VSD CIVSP Nella configurazione del dimero che si trova nella struttura cristallina 4G80. La posizione p140 in Civsp corrisponde alla posizione D123 in HV1. I nostri risultati mostrano che l'interazione elettrostatica repulsiva tra il residuo 123 (123D/123D o 123R/123R) è associata a un livello "normale" di cooperatività legante GBTA nello stato aperto e sposta l'interazione dalla repulsione alla attrazione (123D/123R) , maggiore cooperazione (Fig. 5G). Si prevede che la rimozione dell'interazione repulsiva con la sostituzione di alanina porterebbe anche ad una maggiore cooperatività. Tuttavia, è stata osservata una diminuzione della cooperatività del dimero 123A/123A (Fig. 5E). La spiegazione è che l'effetto destabilizzante del posizionamento dei residui idrofobici in un ambiente idrofilo può superare l'effetto stabilizzante a causa dell'eliminazione delle interazioni repulsive tra i residui D123, con conseguente riduzione complessiva della cooperatività legante La posizione D171 di Ciona gutis CI-HV1 (corrispondente a D123 nell'HV1 umano) è aumentata all'attivazione, sostenendo l'idea che D123 si trova in un ambiente idrofilo nello stato aperto. È noto che il gate dei canali HV1 si verifichi attraverso transizioni multiple19,20,26,39,40,41.qiu et al26 ha scoperto che dopo la depolarizzazione della membrana, il sensore di tensione di CI-HV1 subisce un cambiamento conformativo che lascia il canale attivato ma ancora chiuso , seguita da una transizione distinta che provoca la conduzione aperta di protoni nel percorso di entrambe le subunità. Il cambiamento conformazionale del sensore di tensione è stato monitorato mediante fluorescenza del clamp di tensione e si è scoperto che la seconda transizione è stata selettivamente perturbata dalla mutazione in posizione D171. La perturbazione del segnale fluorescente è coerente con la presenza di interazioni elettrostatiche tra i residui D171 delle subunità adiacenti ad un certo punto lungo le coordinate di reazione del cambiamento conformazionale. Questa interpretazione è coerente con la nostra scoperta che il residuo D123 interagisce elettrostaticamente e media l'accoppiamento allosterico tra i siti di legame GBTA. Fujiwara et al25 ha proposto che l'interfaccia dimero del dominio a bobina a spirale citoplasmatica si estenda nella membrana per contenere due eliche S4 (Fig. 7B, pannello sinistro). Un modello di questa interazione intersubunit si basa sull'analisi del cross-linga di cisteina che copre L'intera analisi VSD e funzionale della regione che collega l'elica S4 e il CCD. In assenza di un gradiente di pH transmembrana, i canali HV1 richiedono una notevole depolarizzazione della membrana per aprire e la reticolazione della cisteina si verifica in condizioni in cui il canale è prevalentemente chiuso. Pertanto, l'interfaccia S4-S4 rilevata probabilmente riflette la configurazione della subunità off-stato. Altri studi hanno trovato prove del coinvolgimento di S1 ​​e S2 nelle interazioni intersubunit durante il gating17,21,26 suggerendo che i canali possono adottare diverse configurazioni di subunità all'aperto e Stati chiusi, un'idea coerente con i risultati di Mony et al. S1 si sposta 39 durante il gate. Qui, mostriamo che, nello stato aperto, le estremità extracellulari dell'elica S1 sono abbastanza vicine da supportare interazioni elettrostatiche dirette che mediano l'accoppiamento allosterico tra le subunità. Nella configurazione del dimero con interazioni S4-S4 estese, le eliche S1 sono troppo lontane Oltre l'uno dall'altro per interagire direttamente. Tuttavia, una rotazione in senso orario di 20 ° delle due subunità VSD attorno a un asse perpendicolare al piano di membrana, combinata con la separazione delle estremità esterne delle due eliche S4, ha prodotto una configurazione S1-S1 coerente con i nostri risultati (Fig. 7B, pannello a destra). Consigliamo questa configurazione per il canale nello stato aperto. Sebbene si ritiene che l'enzima CIVSP funzioni come un monomero, la struttura cristallina del suo VSD isolato viene catturata in uno stato dimero. Le estremità esterne delle eliche S1 in questo dimero sono spazialmente vicine e la configurazione generale è simile a quella proposta Per Hv1 (Fig. 7C). Nel dimero Civsp, il residuo più vicino dalla subunità adiacente era prolina nella posizione 140 (Fig. 7C). Interessantemente, p140 in Civsp corrisponde alla posizione D123 in HV1. La somiglianza nella configurazione della subunità tra HV1 E i dimeri Civsp suggeriscono che i VSD di queste proteine ​​hanno una tendenza intrinseca a formare un'interfaccia in cui interagiscono le estremità extracellulari di S1. Il ruolo essenziale di HV1 nell'attivazione delle cellule dello sperma rende questo canale un bersaglio di farmaci attraente per il controllo della fertilità maschile. È stato dimostrato che l'attivazione di HV1 nella microglia ha peggiorato il recupero dall'ictus ischemico. L'attività di HV1 migliorata è stata associata La sopravvivenza in pazienti con carcinoma mammario 12 o carcinoma del colon-retto 13 e si ritiene che contribuiscano alle neoplasie delle cellule B 11. Pertanto, i farmaci a piccole molecole mirano a HV1 possono essere usati come agenti neuroprotettivi o terapie antitumorane. La subunità aperta HV1, portando ad un aumento dell'affinità di legame, può portare allo sviluppo di farmaci più potenti che mirano ai canali HV1. La mutagenesi diretta al sito di HV1 umano è stata eseguita utilizzando tecniche PCR standard. Nel costrutto Hv1NCCIVSP, i residui 1-96 e 228-273 di HV1 sono stati sostituiti dai residui 1-113 e 240-576 di CiVSP18.N il dimeri legato a Hv1, Il C-terminus di una subunità è collegato al N-terminus della seconda subunità attraverso il linker Ggsggsggsgsggsgg. I plasmidi PGEMHE contenenti i vari costrutti sono stati linearizzati con gli enzimi di restrizione NHE1 o SPH1 Kit di trascrizione mmachine mmessage T7 (Ambion) .1-3 giorni prima delle misurazioni elettrofisiologiche, il CRNA è stato iniettato negli ovociti di Xenopus (50 nl per cellula, 0,3-1,5 μg/μl). Sono stati ottenuti gli ovociti V e VI di Xenopus Laevis (nasco) Dalla bioscienza degli ecociti. Iniezione di RNA che segue, le cellule sono state mantenute in terreno ND96 contenente NACL 96 mM, 2 mM KCl, 1,8 mM Cacl, 1 mM MGCl, 10 mM HEPE, piruvato 5 mM, 100 μg/ml di gentamicina, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazolo [1], 2-guanidino-benzotiazolo [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidina [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -thiazol-2-il) guanidina) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazolo-4-carbossilato [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-tiazolo- 5-carbossilato [9] e (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) acetato di etil [10] provenivano da Sigma-Aldrich.famotidina [7] proveniva da MP Biomedicals.1- [4 [4 -(4-clorofenil) -1,3-thiazol-2-il] guanidina [11] e 1- [4- (3,4-dimetossifenil) -1,3- tiazol-2-il] guanidina [12] da Matrix Scientific. Questi composti sono della massima purezza in commercio. almeno il 99% di purezza. A una sospensione di 2-ammino-4- (trifluorometil) benzenethiolo cloridrato (1,02 g, 4,5 mmol) in 25 ml di acido cloridrico acquoso (2,5 N) è stato aggiunto una dicicaniamide solida (380 mg, 4,5 mmol) e il miscele idrochiorico acquoso e il ripristino eterogene è stato riflusso di agitazione vigorosa per 4 ore. La miscela di reazione è stata raffreddata a temperatura ambiente e neutralizzata mediante aggiunta graduale di idrossido di potassio 10n. Il precipitato bianco formato è stato filtrato, lavato con acqua fredda (3 × 50 ml), essiccata in un forno ( 65 ° C) per diverse ore e quindi ricristallizzato da etil acetato/etere di petrolio per dare un solido bianco (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (luce 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7,25 (molto largo s, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Hz) .13c NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114.2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (d, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (Q, J = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): m/z Valore calcolato. Per C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, trovato : 261.0419. Nafto [1,2-d] tiazol-2-amine (300 mg, 1,5 mmol), sintetizzato come precedentemente descritto, è stato riscaldato a 200 ° C in un bagno di olio in un piccolo tubo di prova.300 mg (grande eccesso) cianomide e 1,0 ml di conc. al composto caldo è stato aggiunto rapidamente l'acido cloridrico e la miscela è stata mantenuta nel bagno d'olio per circa 2 minuti, durante il quale la maggior parte dell'acqua è stata evaporata. La miscela di reazione è stata quindi raffreddata a temperatura ambiente e il materiale solidificato risultante è stato spezzato in piccoli pezzi e lavato con acqua per fornire un solido amorfo giallo pallido. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 H, J = 8,3 Hz) .13c NMR (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): m/z Valore calcolato. Per C12H11n4S (M + H) +: 243.0699 , trovato: 243.0704. Le correnti di protoni sono state misurate in patch interne ed esterne di ovociti che esprimono diversi costrutti usando un amplificatore AxOPatch 200b controllato da un Axon digidata 1440A (dispositivi molecolari) con software PCLAMP10. Soluzioni intracellulari ed extracellulari hanno la stessa composizione: 100 mm 2- (N-Morfolino ) acido etanosulfonico (MES), tetraetilammonio (tè) da 30 mM (tè) mesilato, cloruro di tè 5 mm, acido tetracetico da 5 mm di etilenico (2-aminoetil) -n, n, n ', n''-tetraacetico (EGTA), regolato a pH 6,0 con idrossido di tè. Tutte le misurazioni sono state eseguite a 22 ± 2 ° C. La pipetta ha una resistenza di accesso di 1,5–4 MΩ. Le tracce correnti sono state filtrate a 1 kHz, campionate a 5 kHz e analizzate con Plampfit10.2 (dispositivi molecolari (dispositivi molecolari ) e Origin8.1 (originlab). Soluzioni contenenti varie concentrazioni di inibitore HV1 e in alcuni casi 10 mM βme sono state introdotte nel bagno per gravità attraverso una varietà collegata a un sistema di valvole di perfusione VC-6 (Warner Instr.), Che è stato passato attraverso il software PCLAMP TTL (transistor- Logica transistor) segnali. Esperimenti di perfusione rapida sono stati eseguiti utilizzando una matita per perfusione multi-tubo (automatizzare la Sci.) Con una punta di consegna di 360 μm di diametro montata davanti a una pipetta patch. L'inibizione del canale è stata determinata +120 mV Pulse depolarizzante. Misurazioni di GV sono state eseguite come precedentemente descritto18,20. Le correnti di coda sono state registrate a -40 mV dopo le fasi di depolarizzazione a diverse tensioni da -20 mV a +120 mV se non diversamente indicato. L'impulso di riferimento che precede l'impulso di prova è utilizzato per correggere per l'attuale decadimento 18. Il grafico GV si adatta all'equazione di Boltzmann: le costanti costanti di dissociazione (KD) per diverse combinazioni di canali e inibitori (Tabella 1 supplementare) sono state determinate adattando la dipendenza dalla concentrazione dell'inibizione (valori di inibizione media) Con l'equazione di Hill: dove [i] è la concentrazione di inibitore I e H è il coefficiente di collina. Per calcolare il coefficiente di collina, l'equazione (2) è riorganizzata come: