アロステリック結合プローブを使用した、開いた Hv1 プロトン チャネルのサブユニット間界面の調査

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サブ 2: BO* + B ⇄ B*O*、Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM (d) Hv1 ブロックの提案されたメカニズムの概略図。GBTA の場合、1 つのオープン サブユニットに結合すると、隣接するオープン サブユニットの親和性が増加します (Kd2 0.05）減少していることを発見し（図5c）、その役割にもかかわらず、GBTA結合の協力性を維持することを示唆しています。 2 つのサブユニットが一緒になることは重要ですが、CCD は GBTA 結合部位間のサブユニット間アロステリック結合を直接媒介しません。 (a) 細胞質コイルドコイルドメイン (青い矢印) によって媒介されるサブユニット間結合を破壊するように設計された、S4 の内端にトリグリシン変異を持つ Hv1 二量体の概略図。(b) Hv1 二量体およびライゲーション二量体の概略図。サブユニット間のカップリングに関与する S1 フラグメント (青い矢印) をテストするように設計された、示された変異。(c-h) 2GBI (シアン) および GBTA (暗赤色) は、濃度依存的に示された構築物を阻害します。各点は平均阻害を表します。 3 ～ 10 回の測定値の ± SD。 曲線は、見かけの Kd 値を取得するために使用されるヒル フィットでした (補足表 1 を参照)。補間されたヒストグラムのヒル係数は、「方法」セクションで説明されているように決定されました (補足図 3 および 4 を参照)。 Hv1 WT は破線で示されています。アスタリスクは、変異体継代と WT 継代の間の統計的に有意な差を示します (p 0.05、図5d、i）。 ）。 一方、変異D123AはGBTAのヒル係数を大幅に減少させました（p 0.05/14)。 両方のサブユニットの 123 位の電荷を中和すると GBTA 結合の協同性が大きく変化しましたが、両方のサブユニットの電荷を逆転させる効果はわずかであったため、電荷の反転チャネルを持つ 1 つのサブユニットのみを含めるように分析を拡張しました。 C末端サブユニットにD123R置換を有するHv1関連二量体を生成し（図5b）、GBTAおよび2GBIによる濃度応答阻害を測定しました。WT-D123RチャネルへのGBTA結合のヒル係数がそれよりも有意に高いことがわかりました。野生型Hv1のヒル係数（p 0.05)。 また、βMEの非存在下では、D112E I127C Hv1二量体に結合するGBTAのヒル係数が、還元剤の存在下で測定されたものよりも大幅に高いこともわかりました（図6eおよび補足図4）。これは、D112E変異が存在することを示唆しています。システイン 127 の架橋に起因する GBTA 結合協同性の増加は廃止されませんでした。D112E、I127C Hv1 二量体に結合する 2GBI のヒル係数も、D112E 変異によって有意な影響を受けませんでした (図 1)。6d および補足図3）。 総合すると、これらの発見は、GBTA 結合が、誘引静電相互作用を介した、または置換されたシステイン間の共有結合の形成を介した、隣接する Hv1 サブユニットの S1 フラグメントの外端間の相互作用によって強化されることを示唆しています。部位間のアロステリック結合が増加し、結合協同性が生じます。協同性に対する静電的な引力相互作用の影響は、変異 D112E によって無効化できますが、共有結合の影響は無効化できません。 グアニジン誘導体を Hv1 チャネルに結合させるために利用できる化学空間を探索したところ、GBTA のような 2-グアニジノチアゾールは 2-グアニジノベンズイミダゾールよりも急峻な濃度依存性を持つことがわかりました (図 1c)。 両方の二量体に結合する GBTA のヒル係数分析単量体チャネル（図 2a、b）、および 1 つのサブユニットが阻害剤にあらかじめ結合している二量体チャネル（図 4）から、GBTA による Hv1 の阻害は相乗的なプロセスであるとの結論に至りました。 2 つのサブユニット内の化合物の結合部位はアロステリックに結合しています。関連化合物 2GBI32 で以前に示されたように、GBTA が開いたチャネルに結合するという発見は、アロステリック結合が開いた状態で特異的に評価できることを示唆しています。私たちの協力的な結合モデルGBTAによるHV1の阻害を定量的に記述し（図2C）、膜再分極後のチャネル尾電流の減衰に対する2GBIおよびGBTAのさまざまな効果を説明することができました。これは、結合プロセスの解釈をサポートしています。 2つの結合部位（HV1など）を持つアロステリックタンパク質で達成できる最大丘係数は2です。HV1I127Cで1.88に増加した係数1.31でHV1野生型を結合するGBTAを測定します。相乗的自由エネルギー、最低および最高のアフィニティサイトの結合自由エネルギーの違い（方法を参照）は、HV1野生型の場合は1.3 kcal/mole、HV1 I127Cの場合は2.7 kcal/moleでした。ヘモグロビンへの酸素のものは、共同プロセスの最も有名でよく研究された例です38.ヒトヘモグロビン（4つのアロステリックに結合した結合部位を持つテトラマー）の場合、丘の係数は2.5-3.0の範囲で、値は1.26から3.644444の範囲です。 KCAL/mol、実験条件に応じて38. Thus、グローバルエネルギーの観点から、HV1へのGBTA結合の協同性は、2つのシステムのタンパク質サブユニットの異なる数を考慮した場合、HV1へのGBTA結合の協同性がヘモグロビンへのO2結合の協同性とは実質的に異なっていません。 私たちの相乗モデルでは、GBTA分子の1つのサブユニットへの結合により、隣接するサブユニットの結合親和性が増加します。サブユニット間の相互作用の変化。これらの変化に対する応答で、隣接するサブユニットは結合部位を変更し、GBTAの結合をより厳しくします。以前は、HV1プロトン透過経路の一部であり、選択性Filter27,28として作用することが示されていました。 我々の結果は、2つのHV1サブユニットの選択性フィルターがオープン状態でアロステリックに結合されていることを示しています。図7aは、GBTA結合部位の近似位置と、HV1 VSDベースの概略図の残基D112、D123、K125、I127の位置を示しています。 S1の細胞外端を含むアロステリック結合のためのHV1-CIVSPキメラの結晶構造。黒い矢印で示されています。 （A）HV1-CIVSPキメラの結晶構造に基づくHV1 VSDの概略図は、らせんセグメントがCCDと合流するこの構成では、HV1-CIVSPキメラの結晶構造に基づいています。結合したGBTAの予測された位置は灰色の卵形として表示されます。ブラック矢印は、2つの隣接するサブユニットの結合部位間のアロステリック結合に関与する経路を示しています。膜平面の細胞外側から見られる2つの異なる二量体構成で。左パネルでは、ダイマーインターフェイスは、S4ヘリックスによって形成されます。2つのVSDのrotは、膜面に対して垂直軸の周りに20度20度回転します。 2つのS4ヘリックス（破線の矢印）の外側の端の分離は、右に表示される配置を生成します。この構成では、隣接するサブユニットからの残基D123およびI127が互いに近づくことができます。 4G80クリスタル構造で見つかったダイマー構成。CIVSPのポジションP140は、HV1の位置D123に対応しています。 我々の結果は、残基123（123D/123Dまたは123R/123R）間の反発的な静電相互作用が、開かれた状態のGBTA結合協同性の「正常」レベルに関連しており、反発から引き付けられた（123D/123R）に相互作用をシフトすることを示しています（123D/123R） 、協力の増加（図5G）。アラニン置換との反発的相互作用の除去も協力性の増加につながると予想されます。説明は、親水性環境に疎水性残基を配置することの不安定化効果が、D123残基間の反発的相互作用の排除により安定化効果を上回り、結合協同性の全体的な減少をもたらす可能性があるということです。 Ciona Gutis CI-HV1（ヒトHV1のD123に対応）の位置D171は、活性化時に増加し、D123はオープン状態の親水性環境に位置するという概念を支持します。 HV1チャネルのゲーティングは、複数の遷移によって発生することが知られています19,20,26,39,40,40,41.QIU et al26は、膜脱分極時にCI-HV1の電圧センサーが、チャネルを活性化しているがまだ閉じた立体構造変化を受けることを発見しました。それに続いて、両方のサブユニットパスでプロトンを開く原因となる明確な遷移が続きます。電圧センサーの立体構造変化は、電圧クランプ蛍光によって監視され、2番目の遷移が位置D171での変異によって選択的に乱れていることがわかりました。蛍光シグナルの摂動は、立体構造変化の反応座標に沿ったある時点での隣接サブユニットのD171残基間の静電相互作用の存在と一致しています。また、GBTA結合部位間のアロステリックカップリングを媒介します。 藤原ら25は、細胞質コイルドコイルドメインの二量体界面が膜に伸びて2つのS4ヘリックスを含むことを提案しました（図7B、左パネル）。 S4ヘリックスとCCDを接続する領域のVSD全体と機能分析。膜貫通pH勾配がないため、HV1チャネルはかなりの膜脱分極を開く必要があり、チャネルが主に閉じている状態でシステイン架橋が発生します。したがって、検出されたS4-S4インターフェイスは、おそらくオフ状態のサブユニット構成を反映している可能性があります。他の研究では、ゲーティング中のサブユニット間相互作用におけるS1とS2の関与の証拠を発見しました17,21,26は、チャネルがオープンで異なるサブユニット構成を採用する可能性があることを示唆しています。閉鎖された状態、モニーらの調査結果と一致するアイデア。 S1はゲーティング中に39を移動します。 ここでは、開いた状態では、S1ヘリックスの細胞外端が、サブユニット間のアロステリックな結合を媒介する直接的な静電相互作用をサポートするのに十分なほど近くにあることを示しています。しかし、直接相互作用するために互いに違っていますが、膜面に垂直な軸の周りの2つのVSDサブユニットの時計回りの回転は、2つのS4ヘリックスの外側端の分離と組み合わされて、S1-S1構成が一貫して生成されました。調査結果（図7B、右パネル）があります。オープン状態のチャネルのこの構成をお勧めします。 civsp酵素はモノマーとして機能すると考えられていますが、その分離されたVSDの結晶構造は二量体状態で捕獲されます。 hv1（図7c）の場合、civspダイマーでは、隣接するサブユニットからの最も近い残基は位置140でプロリンでした（図7c）。そして、CivsPダイマーは、これらのタンパク質のVSDが、S1の細胞外端が相互作用する界面を形成する内因性の傾向があることを示唆しています。 精子細胞の活性化におけるHV1の本質的な役割により、このチャネルは男性の肥沃度の制御のための魅力的な薬物ターゲットになります。Furthermore。乳房12または結腸直腸癌13患者の生存とB細胞悪性腫瘍に寄与すると考えられている11。したがって、HV1を標的とする小分子薬は、神経保護剤または抗がん治療薬として使用できます。結合親和性の増加につながるHV1サブユニットを開くと、HV1チャネルを標的とするより強力な薬物の開発につながる可能性があります。 ヒトHV1の部位指向変異誘発は、標準のPCR技術を使用して実行されました。HV1NCCIVSPコンストラクトで、HV1の残基1-96および228-273は、HV1リンクダイマーのCIVSP18.の残基1-113および240-576に置き換えられました。 1つのサブユニットのC末端は、GGSGGSGGSGSGGSGGリンカーを介した2番目のサブユニットのN末端にリンクされています。さまざまなコンストラクトを含むPGEMHEプラスミドは、NHE1またはSPH1制限酵素（新しいイングランドバイオラブ）とRNA合成と線形化されました。 T7 Mmessage Mmachine Transcription Kit（Ambion）。電気生理学的測定の1〜3日前に、CRNAをアフェスノパス卵母細胞（細胞あたり50 nL、0.3-1.5μg/μL）に注入しました。生態細胞生物科学から、RNA注射に焦点を当て、96 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM Cacl、1 mM MgCl、10 mM HEPES、5 mMピルビン酸、100μg/mLゲンタマイシン、pH 7.2 18°Cを含むND96培地で細胞を維持しました。 。 2-グアニジーノ - ベンジミダゾール[1]、2-グアニジーノ - ベンゾチアゾール[2]、（4-メチル-1,3-チアゾール-2-イル）グアニジン[5]、（5-ブロモ-4-メチル-1,3 -thiazol-2-ill）グアニジン）[6]、エチル2-グアニジノ-5-メチル-1,3-チアゾール-4-カルボン酸[8]、エチル2-グアニジノ-4-メチル-1,3-チアゾール- 5-カルボン酸[9]および（2-グアニジーノ-4-メチル-1,3-チアゾール-5-イル）酢酸エチル[10]は、Sigma-Aldrich.Famotidine [7]はMP Biomedicals.1- [4 [4]からのものでした。 - （4-クロロフェニル）-1,3-チアゾール-2-イル]グアニジン[11]および1- [4-（3,4-ジメトキシフェニル）-1,3-チアゾール-2-イル]グアニジン[12]はマトリックス科学から。これらの化合物は最も高い純度が市販されています。これらは乾燥DMSOに溶解して100 mmのストック溶液を生成しました。これは、希望の最終濃度3および4の記録溶液で希釈され、以下で合成されました。少なくとも99％の純度。 2-アミノ-4-（トリフルオロメチル）塩酸塩（1.02 g、4.5mmol）の懸濁液（2.5 n）を固体ジシアンディアミド（380 mg、4.5mmol）を添加し、結果として卵巣腫瘍性混合物を添加しました。反応混合物を室温に冷却し、10N水酸化カリウムの徐々に添加して中和しました。形成された白色沈殿物をろ過し、冷水（3×50 ml）で洗浄し、オーブンで乾燥させました（ 65°C）数時間、酢酸エチル/石油エーテルから再結晶して白い固体（500 mg、48％）を与えます。 MP 221–222°C（光225–226°C）45; 1H NMR（500 MHz、DMSO-D6）：Δ[ppm] = 7.25（非常に広いs、4時間）、7.40（d、1時間、j = 8.1 Hz）、7.73（s、1時間）、7.92（d 、1 h、j = 8.1 Hz）.13c nmr（200 mhz、dmso-d6）：Δ= 114.2（d、j = 3.5 Hz）、117.5（d、j = 3.5 Hz）、121.7、124.6（Q、j = 272 Hz）、126.1（Q、j = 272 Hz）= 31.6 Hz）、134.8、152.1、158.4、175.55.hrms（ESI）：M/z計算値。C9H8F3N4S（M + H） +：261.0416、 ：261.0419。 前述のように合成されたナフソ[1,2-d]チアゾール-2-アミン（300 mg、1.5 mmol）は、小さな試験管の油浴で200°Cに加熱されました。 1.0 ml conc. hot化合物に塩酸を急速に添加し、混合物を約2分間油浴に保持し、その間にほとんどの水が蒸発しました。その後、反応混合物を室温に冷却し、結果として生成される固化材料を固めました。小さな部分に壊れ、水で洗浄して淡黄色のアモルファス固体を提供しました。（38 mg、10％）MP 246-250°C。 1H NMR（500 MHz、DMSO-D6、D2O）：Δ[ppm] = 7.59（t、1 H、j = 8.2 Hz）、7.66（t、1 H、j = 8.3 Hz）、7.77（d、1 h 、j = 8.6 Hz）、7.89（d、1 H、j = 8.6 Hz）、8.02（d、1時間、j = 8.2 Hz）、8.35（d、1時間、j = 8.3 Hz）.13c nmr（150 MHZ、DMSO-D6）：Δ= 119.9、122.7、123.4、123.6、126.5、127.1、128.7、132.1、140.7、169.1.HRMS（ESI）：M/Z計算値。 、見つかった：243.0704。 プロトン電流は、PCLAMP10ソフトウェアと細胞外溶液を備えた軸索Digidata 1440A（分子装置）によって制御されるAxopatch 200Bアンプを使用して、異なる構造を発現する卵母細胞の内部および外部パッチで測定されました。 ）エタンスルホン酸（MES）、30 mMテトラエチルアンモニウム（茶）メシル酸、5 mM紅茶塩化物、5 mMエチレングリコールビス（2-アミノエチル）-N、n、n '、n'テトラ酢酸（EGTA）、すべての水酸化物を使用したpH 6.0。すべての測定値は22±2°Cで実行されました。ピペットのアクセス抵抗は1.5〜4MΩです。電流トレースは1 kHzでフィルタリングされ、5 kHzでサンプリングされ、ClampFit10.2（分子デバイスで分析されました。 ）およびOrigin8.1（originlab）。 さまざまな濃度のHV1阻害剤を含む溶液は、VC-6灌流バルブシステム（Warner Instr。）に接続されたマニホールドを介して、重力により10mMβMeに浴に導入されました。トランジスタロジック）シグナル。ラピッド灌流実験は、パッチピペットの前に取り付けられた直径360μmの送達チップを使用して、マルチチューブ灌流ペンシル（自動科学）を使用して実行されました。 +120 mV脱分極パルス。GV測定は、以前に説明されているように実行されました18,20.テール電流は、特に明記しない限り、-20 mVから+120 mVの異なる電圧で脱分極ステップ後に-40 mVで記録されました。電流減衰の修正に使用。GVグラフはボルツマン方程式に適合します：チャネルと阻害剤のさまざまな組み合わせの見かけの解離定数（KD）は、阻害の濃度依存性（平均％阻害値）を適合させることによって決定されました。丘の方程式：ここで、[i]は阻害剤IとHの濃度です。Hは丘の係数です。丘係数を計算するには、式（2）が次のように再配置されます。