ការសួរចម្លើយនៃចំណុចប្រទាក់ intersubunit នៃឆានែលប្រូតុង Hv1 បើកចំហជាមួយការស៊ើបអង្កេតដែលភ្ជាប់ជាមួយ allosterically

សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើល Nature.com.កំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានការគាំទ្រមានកំណត់សម្រាប់ CSS.សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានធ្វើបច្ចុប្បន្នភាព (ឬបិទរបៀបភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer) ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ ដើម្បីធានាថា បន្តការគាំទ្រ យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។ ឆានែលប្រូតុងដែលបិទដោយវ៉ុល Hv1 គឺជាស្មុគ្រស្មាញ dimeric ដែលមានដែនចាប់សញ្ញាវ៉ុលពីរ (VSDs) ដែលនីមួយៗមានផ្លូវជ្រាបចូលប្រូតុងដែលបិទជិត។ ភាពស្រអាប់ត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយដែន cytoplasmic coiled-coil ។ ការផ្លាស់ប្តូរពីស្ថានភាពបិទទៅ ស្ថានភាពបើកចំហនៅក្នុង VSDs ទាំងពីរត្រូវបានគេស្គាល់ថាកើតឡើងដោយសហការ។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ គេដឹងតិចតួចអំពីយន្តការមូលដ្ឋាន។ ចំណុចប្រទាក់ Intersubunit ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងដំណើរការ allosteric ។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ចំណុចប្រទាក់បែបនេះមិនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងឆានែល Hv1 បើកចំហទេ។ នៅទីនេះយើងបង្ហាញថានិស្សន្ទវត្ថុ 2-guanidinothiazole ទប់ស្កាត់ Hv1 VSDs ពីរក្នុងលក្ខណៈសហការ ហើយប្រើសមាសធាតុមួយក្នុងចំណោមសមាសធាតុទាំងនេះជាការស៊ើបអង្កេតសម្រាប់ការភ្ជាប់ allosteric រវាងអនុរងបើកចំហ។ យើងបានរកឃើញថាកោសិកាខាងក្រៅ ចុងបញ្ចប់នៃបំណែក transmembrane ដំបូងនៃ VSD បង្កើតជាចំណុចប្រទាក់ intersubunit ដែលសម្របសម្រួលការភ្ជាប់គ្នារវាងកន្លែងចង ចំណែកឯដែន coiled-coil មិនត្រូវបានចូលរួមដោយផ្ទាល់នៅក្នុងដំណើរការនេះទេ។ យើងក៏បានរកឃើញភស្តុតាងរឹងមាំដែលថាតម្រងជ្រើសរើសប្រូតុងរបស់ឆានែលគ្រប់គ្រងកិច្ចសហប្រតិបត្តិការនៃការទប់ស្កាត់ . ឆានែលប្រូតុងដែលបិទដោយវ៉ុលដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុងសារពាង្គកាយជាច្រើនប្រភេទ ចាប់ពី ផ្លេនតុន ដល់មនុស្ស1. នៅក្នុងកោសិកាភាគច្រើន បណ្តាញទាំងនេះសម្រុះសម្រួលការបញ្ចេញប្រូតុងចេញពីភ្នាសប្រូតុង និងគ្រប់គ្រងសកម្មភាពរបស់ NADPH oxidase ។ ឆានែលប្រូតុងដែលបិទដោយវ៉ុលដែលគេស្គាល់តែមួយគត់នៅក្នុងមនុស្ស គឺ Hv1 ដែលជាផលិតផលនៃហ្សែន HVCN1 2,3.Hv1 (ហៅកាត់ថា VSOP) ត្រូវបានបង្ហាញថាដើរតួនាទីក្នុងការរីកសាយកោសិកា B4 ការផលិតប្រភេទអុកស៊ីសែនដែលមានប្រតិកម្មដោយប្រព័ន្ធការពារខាងក្នុង 5,6,7,8 កោសិកាមេជីវិតឈ្មោល។ ចលនា៩ និងបទប្បញ្ញត្តិ pH នៃសារធាតុរាវផ្ទៃផ្លូវដង្ហើម ១០. ឆានែលនេះត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងច្រើនហួសប្រមាណនៅក្នុងប្រភេទមហារីកដូចជា B-cell malignancies4,11 និងមហារីកសុដន់និងពោះវៀនធំ12,13.សកម្មភាព Hv1 ច្រើនពេកត្រូវបានគេរកឃើញដើម្បីបង្កើនសក្តានុពលមេតាទិកនៃកោសិកាមហារីក 11, 12 ។នៅក្នុងខួរក្បាល Hv1 ត្រូវបានបង្ហាញ ដោយ microglia ហើយសកម្មភាពរបស់វាត្រូវបានបង្ហាញថាធ្វើឱ្យខូចខាតខួរក្បាលកាន់តែធ្ងន់ធ្ងរនៅក្នុងគំរូនៃជំងឺដាច់សរសៃឈាមខួរក្បាល ischemic ។ ប្រូតេអ៊ីន Hv1 មានដែនវាស់វ៉ុល (VSD) ដែលមានផ្នែកបញ្ជូនមេប្រាយចំនួន 4 ដែលហៅថា S1 ដល់ S414។ VSD ប្រហាក់ប្រហែលនឹងដែនដែលត្រូវគ្នានៃបណ្តាញ Na+, K+ និង Ca2+ ដែលមានតង់ស្យុង និងផូស្វ័រដែលងាយនឹងវ៉ុល ដូចជា CiVSP ពី Ciona gutis15.នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនផ្សេងទៀតទាំងនេះ C-terminus នៃ S4 ត្រូវបានភ្ជាប់ទៅម៉ូឌុល effector ដែន pore ឬ enzyme ។ក្នុង Hv1, S4 ត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹង coiled-coil domain (CCD) ដែលមានទីតាំងនៅផ្នែកខាង cytoplasmic នៃភ្នាស . ឆានែលគឺជាស្មុគ្រស្មាញ dimeric ដែលមាន VSDs ពីរ ដែលនីមួយៗមានច្រកផ្លូវឆ្លងកាត់ប្រូតុងដែល gated 16,17,18. អនុរង Hv1 ទាំងពីរនេះត្រូវបានគេរកឃើញដើម្បីបើកដោយសហការគ្នា19,20,21,22 ដោយបង្ហាញថាការភ្ជាប់ allosteric និងអន្តរកម្មរវាងអនុរងដំណើរការ។ តួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងដំណើរការច្រកទ្វារ។ ចំណុចប្រទាក់រវាងអនុក្រុមនៅក្នុងដែននៃរបុំខ្សែគឺត្រូវបានកំណត់យ៉ាងល្អ ពីព្រោះរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់នៃដែនដាច់ស្រយាលទាំងពីរមាន 22,23។ ម្យ៉ាងវិញទៀត ចំណុចប្រទាក់រវាង VSDs នៅក្នុងភ្នាសគឺមិនមាន យល់ច្បាស់។ រចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់នៃប្រូតេអ៊ីន chimeric Hv1-CiVSP មិនផ្តល់ព័ត៌មានអំពីចំណុចប្រទាក់នេះទេ ដោយសារអង្គការ trimeric នៃស្មុគ្រស្មាញឆានែលគ្រីស្តាល់អាចបណ្តាលមកពីការជំនួស Hv1 CCD ដើមដោយខ្សែរ៉ូត leucine GCN424 ។ ការសិក្សាថ្មីៗនេះនៃអង្គការរងនៃឆានែល Hv1 បានសន្និដ្ឋានថា helices S4 ពីរបានផ្លាស់ប្តូរចូលទៅក្នុង CCD ដោយគ្មានការរំខានយ៉ាងខ្លាំងនៃរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំដែលបណ្តាលឱ្យមាន helices វែងដែលចាប់ផ្តើមពីភ្នាសនិងគម្រោងចូលទៅក្នុង cytoplasm ។ ដោយផ្អែកលើការវិភាគ cysteine ​​​​crosslinking ។ ការសិក្សានេះស្នើរថា Hv1 VSDs ទាក់ទងគ្នាទៅវិញទៅមកតាមផ្នែក S4។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ការសិក្សាផ្សេងទៀតបានស្នើឡើងនូវចំណុចប្រទាក់ជំនួសរវាង VSDs ។ ចំណុចប្រទាក់ទាំងនេះរួមមានផ្នែក S1 17, 21, 26 និងផ្នែកខាងក្រៅនៃផ្នែក S2 21. ហេតុផលដែលអាចកើតមានសម្រាប់ការប៉ះទង្គិច លទ្ធផលនៃការសិក្សាទាំងនេះគឺថាការភ្ជាប់គ្នារវាង VSDs ត្រូវបានពិនិត្យទាក់ទងទៅនឹងដំណើរការច្រកទ្វារ ដែលអាស្រ័យលើរដ្ឋបិទ និងបើកចំហ ហើយចំណុចប្រទាក់រវាង VSDs អាចប្រែប្រួលក្នុងការផ្លាស់ប្តូររដ្ឋផ្សេងៗគ្នាក្នុងការអនុលោម។ នៅទីនេះ យើងបានរកឃើញថា 2-guanidinothiazole រារាំងបណ្តាញ Hv1 ដោយការផ្សារភ្ជាប់យ៉ាងស៊ីសង្វាក់គ្នាទៅនឹង VSDs បើកចំហពីរ ហើយបានប្រើសមាសធាតុមួយគឺ 2-guanidinobenzothiazole (GBTA) ដើម្បីស៊ើបអង្កេតអន្តរកម្មរវាងអនុរងនៅក្នុងស្ថានភាពបើកចំហ។ ចំណុចប្រទាក់។ យើងបានរកឃើញថាខ្សែកោងចង GBTA អាចត្រូវបានពិពណ៌នាយ៉ាងល្អដោយគំរូបរិមាណដែលការចងរបស់ inhibitor ទៅនឹងអនុunit មួយបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងនៃទំនាក់ទំនងចងនៃ subunit ដែលនៅជាប់គ្នា។ យើងក៏បានរកឃើញថា residue D112, selectivity filters for the ប៉ុស្តិ៍លេខ 27, 28 និងផ្នែកនៃកន្លែងចងដេរីវេទីវ័រ guanidine 29 គ្រប់គ្រង GBTA binding cooperativity.យើងបង្ហាញថាការចងសហករណ៍ត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុង Hv1 dimer ដែល CCD បំបែកចេញពីផ្នែក S4 ដែលបង្ហាញថាចំណុចប្រទាក់អន្តរក្រុមនៅក្នុង CCD មិនដោយផ្ទាល់ទេ។ សម្របសម្រួលការភ្ជាប់ allosteric រវាងកន្លែងភ្ជាប់ GBTA ។ បំណែក S1 ស្ថិតនៅក្នុងស្ថានភាពបើកចំហ។ ថ្នាំទប់ស្កាត់ម៉ូលេគុលតូចនៃ Hv1 មានប្រយោជន៍ជាថ្នាំប្រឆាំងមហារីក និងភ្នាក់ងារការពារប្រព័ន្ធប្រសាទ។ ទោះបីជាយ៉ាងណាក៏ដោយ រហូតមកដល់បច្ចុប្បន្ន សមាសធាតុមួយចំនួនអាចរារាំងឆានែល 30,31,32,33។ក្នុងនោះមាន 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, សមាសធាតុ [1] នៅក្នុងរូបភព។ .1a) និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វាត្រូវបានរកឃើញដើម្បីទប់ស្កាត់ការជ្រាបចូលនៃប្រូតុង VSD29,32 តាមរយៈឆានែល។ ការចងនៃសមាសធាតុបែបនេះត្រូវបានគេគិតថាកើតឡើងដោយឯករាជ្យនៅក្នុងអនុរងដែលបើកចំហពីរ។2-guanidinobenzothiazole (GBTA, សមាសធាតុ [2] ក្នុងរូបភាពទី 1a) គឺ បានបង្ហាញពីមុនថារារាំង Hv1 ស្ទើរតែមានប្រសិទ្ធភាពដូច 2GBI នៅពេលធ្វើតេស្តនៅកំហាប់ 200 μM (រូបភាពទី 1b)។ យើងបានពិនិត្យនិស្សន្ទវត្ថុ thiazole ផ្សេងទៀត ហើយបានរកឃើញថា ពួកវាខ្លះរារាំងឆានែលដែលមានសក្តានុពលស្រដៀងគ្នា ឬធំជាង GBTA (រូបភាពទី 1 និងបន្ថែម។ អត្ថបទ)។ យើងបានកំណត់ខ្សែកោងឆ្លើយតបការផ្តោតអារម្មណ៍នៃនិស្សន្ទវត្ថុ thiazole ចំនួនបួន (GBTA និងសមាសធាតុ [3], [6] និង [11], រូប 1c) ហើយបានរកឃើញថាពួកវាមានចោតជាង 2GBI ។ មេគុណភ្នំ (h) នៃនិស្សន្ទវត្ថុ thiazole មានចាប់ពី 1.109 ± 0.040 ដល់ 1.306 ± 0.033 (រូបភព។ 1c និងរូបបន្ថែម 1).ផ្ទុយទៅវិញ មេគុណ Hill សម្រាប់ 2GBI គឺ 0.975 ± 0.024 29, រូប 2a និងរូបបន្ថែម 1)។ មេគុណ Hill ខាងលើ 1 បង្ហាញពីកិច្ចសហប្រតិបត្តិការចង។ ដោយសារតែអនុរង Hv1 នីមួយៗមានរបស់វាផ្ទាល់។ កន្លែងចង, 29,32 យើងបានហេតុផលថាការចងនៃដេរីវេនៃ thiazole ទៅមួយរងអាចបង្កើនការចងនៃម៉ូលេគុល inhibitor ទីពីរទៅនឹង subunit ដែលនៅជាប់គ្នា។ GBTA គឺជាសមាសធាតុសាកល្បងជាមួយនឹងមេគុណភ្នំខ្ពស់បំផុត។ ដូច្នេះហើយយើងបានជ្រើសរើសសមាសធាតុនេះដើម្បី សិក្សាបន្ថែមអំពីយន្តការនៃការរួមបញ្ចូលគ្នា និងបានប្រើ 2GBI ជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមានយោង។ (ក) សមាសធាតុសាកល្បង៖ [1] យោង Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI) ។ 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1,3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(ខ) ការរារាំងសកម្មភាព Hv1 របស់មនុស្សដោយ guanidinothiazoles ដែលបានចង្អុលបង្ហាញ និងសមាសធាតុយោង 2GBI (របារពណ៌ខៀវបៃតង) .Hv1 ចរន្តប្រូតុងត្រូវបានវាស់នៅក្នុងបន្ទះខាងក្នុងខាងក្រៅនៃ oocytes Xenopus ក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹង depolarization ពីសក្តានុពលនៃការកាន់ពី -80 mV ទៅ +120 mV. សារធាតុ inhibitor នីមួយៗត្រូវបានបន្ថែមទៅបន្ទប់ទឹកនៅកំហាប់នៃ 200 μM.pHi = pHo = 6.0 ។ .ទិន្នន័យគឺមធ្យម±SEM (n≥4)។(c) ការរារាំងដែលពឹងផ្អែកលើការផ្តោតអារម្មណ៍របស់មនុស្ស Hv1 ដោយសមាសធាតុ [2], [3], [6] និង [11]។ ចំណុចនីមួយៗតំណាងឱ្យការរារាំងមធ្យម± SD នៃ 3 ទៅ 15 ការវាស់វែង។ បន្ទាត់គឺជា Hill fit ដែលប្រើដើម្បីទទួលបានតម្លៃ Kd ជាក់ស្តែងដែលបានរាយការណ៍នៅក្នុងតារាងបន្ថែម 1.Hill coefficients ត្រូវបានកំណត់ពីសមដែលបានរាយការណ៍នៅក្នុងរូបភាពបន្ថែម 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (មើលវិធីសាស្រ្ត)។ (a,b) សមាសធាតុ 2GBI និង GBTA inhibited dimeric និង monomeric Hv1 ក្នុងលក្ខណៈដែលពឹងផ្អែកលើការផ្តោតអារម្មណ៍។ ចំនុចនីមួយៗតំណាងឱ្យការរារាំងមធ្យម± SD នៃការវាស់វែងពី 3 ទៅ 8 ហើយខ្សែកោងគឺជា Hill fit។ មេគុណ Hill (h) បានបង្ហាញនៅក្នុង អ៊ីស្តូក្រាម​ដែល​បញ្ចូល​ត្រូវ​បាន​កំណត់​ពី​សម​ដែល​បាន​រាយការណ៍​នៅ​ក្នុង​រូប​បន្ថែម 3 និង 4. ការ​ឆ្លើយតប​កំហាប់​នៃ GBTA ដែល​បង្ហាញ​ក្នុង (a) គឺ​ដូច​គ្នា​នឹង​រូប​ទី 1c. មើល​តារាង​បន្ថែម 1 សម្រាប់​តម្លៃ Kd ជាក់ស្តែង។(c) គំរូនៃ ការចងសហករណ៍នៃ GBTA ទៅ dimeric Hv1. បន្ទាត់ខ្មៅរឹងតំណាងឱ្យសមទៅនឹងទិន្នន័យពិសោធន៍ដោយសមីការ (6) ដែលពិពណ៌នាអំពីគំរូចងដែលបង្ហាញក្នុង (d)។ បន្ទាត់ដាច់ៗដែលមានស្លាកអនុ 1 និងអនុ 2 តំណាងឱ្យការផ្សារភ្ជាប់ bimolecular - ខ្សែកោងលំនឹងបំបែកនៃព្រឹត្តិការណ៍ចងទីមួយ និងទីពីរ រៀងគ្នា (អនុ 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; អនុ 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ) .(d) ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃយន្តការដែលបានស្នើឡើងនៃប្លុក Hv1។ ក្នុងករណី GBTA ការភ្ជាប់ទៅផ្នែករងបើកចំហមួយបង្កើនភាពស្និទ្ធស្នាលនៃអនុរងបើកចំហដែលនៅជាប់គ្នា (Kd2 0.05) នៅក្នុងមេគុណ Hill នៃការចង GBTA ទៅឆានែល GGG បើប្រៀបធៀបជាមួយប្រភេទព្រៃ (រូបភាព 5c) ដែលបង្ហាញថា ទោះបីជាតួនាទីរបស់វាក្នុងការរក្សា អនុឯកតាពីររួមគ្នាសំខាន់ ប៉ុន្តែ CCD មិនសម្របសម្រួលដោយផ្ទាល់នូវការផ្គូផ្គង intersubunit allosteric រវាងកន្លែងចង GBTA ទេ។ (a) ដ្យាក្រាមគំនូសតាងនៃ Hv1 dimer ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរ triglycine នៅចុងខាងក្នុងនៃ S4 ដែលត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីរំខានដល់ការភ្ជាប់ intersubunit ដែលសម្របសម្រួលដោយ cytoplasmic coiled-coil domain (ព្រួញពណ៌ខៀវ)។(b) តំណាងគ្រោងការណ៍នៃ Hv1 dimers និង ligation dimers ជាមួយ បំរែបំរួលដែលបានចង្អុលបង្ហាញ ត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីសាកល្បងបំណែក S1 ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការភ្ជាប់គ្នារវាងផ្នែករង (ព្រួញពណ៌ខៀវ)។(c–h) 2GBI (ខៀវ) និង GBTA (ក្រហមងងឹត) រារាំងការស្ថាបនាដែលបានចង្អុលបង្ហាញក្នុងលក្ខណៈអាស្រ័យលើការប្រមូលផ្តុំ។ ចំណុចនីមួយៗតំណាងឱ្យការរារាំងមធ្យម ± SD នៃការវាស់វែងពី 3 ទៅ 10 ។ ខ្សែកោងគឺជា Hill fit ដែលប្រើដើម្បីទទួលបានតម្លៃ Kd ជាក់ស្តែង (សូមមើលតារាងបន្ថែមទី 1)។ មេគុណ Hill ក្នុងអ៊ីស្តូក្រាមអន្តរប៉ូលត្រូវបានកំណត់ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងផ្នែកវិធីសាស្ត្រ (សូមមើលរូបភាពបន្ថែមទី 3 និងទី 4)។តម្លៃយោង h សម្រាប់ Hv1 WT ត្រូវបានបង្ហាញជាបន្ទាត់ដាច់ៗ។ សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងសំខាន់តាមស្ថិតិរវាងការឆ្លងកាត់ mutant និង WT (ទំ 0.05, រូបភាព 5d, i ) ) ម៉្យាងវិញទៀត ការផ្លាស់ប្តូរ D123A បានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនូវមេគុណ Hill នៃ GBTA (p 0.05/14)។ ដោយសារការបន្សាបការគិតថ្លៃនៅទីតាំង 123 នៅលើអនុរងទាំងពីរបានបណ្តាលឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងកិច្ចសហប្រតិបត្តិការចង GBTA ខណៈពេលដែលការបញ្ច្រាសការគិតថ្លៃលើអនុរងទាំងពីរមានផលប៉ះពាល់តិចតួច យើងបានពង្រីកការវិភាគដើម្បីរួមបញ្ចូលតែផ្នែករងមួយជាមួយនឹងឆានែលបញ្ច្រាសនៃការគិតថ្លៃ។ បានបង្កើតឌីមឺរដែលភ្ជាប់ Hv1 ជាមួយនឹងការជំនួស D123R នៅក្នុងផ្នែករងនៃស្ថានីយ C (រូបភាព 5b) និងបានវាស់ស្ទង់ការទប់ស្កាត់ការឆ្លើយតបការផ្តោតអារម្មណ៍ដោយ GBTA និង 2GBI។ យើងបានរកឃើញថាមេគុណ Hill នៃការចង GBTA ទៅនឹងប៉ុស្តិ៍ WT-D123R គឺខ្ពស់ជាងនេះឆ្ងាយណាស់។ នៃប្រភេទ Wild-type Hv1 (p 0.05) ។ យើងក៏បានរកឃើញថានៅក្នុងការអវត្ដមាននៃβME មេគុណ Hill នៃ GBTA ចងទៅនឹង D112E I127C Hv1 dimer គឺខ្ពស់ជាងការវាស់វែងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងវត្តមាននៃភ្នាក់ងារកាត់បន្ថយ (រូបភាពទី 6e និងបន្ថែមរូបភាពទី 4) ដែលបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរ D112E មិនបានលុបចោលនូវការកើនឡើងនៃកិច្ចសហប្រតិបត្តិការចង GBTA ដែលបណ្តាលមកពីការភ្ជាប់ឆ្លងនៃ cysteine ​​​​127។ មេគុណ Hill នៃការចង 2GBI ទៅ D112E, I127C Hv1 dimers ក៏មិនត្រូវបានប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដោយការផ្លាស់ប្តូរ D112E (រូបភាពទី 1).6d និងបន្ថែម។ រូប ៣). រួមគ្នា ការរកឃើញទាំងនេះបង្ហាញថា ការចង GBTA ត្រូវបានពង្រឹងដោយអន្តរកម្មរវាងផ្នែកខាងក្រៅនៃបំណែក S1 នៅក្នុងអនុរង Hv1 ដែលនៅជាប់គ្នា តាមរយៈអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្តាទិចដ៏គួរឱ្យទាក់ទាញ ឬតាមរយៈការបង្កើតចំណង covalent រវាង cysteine ​​ដែលត្រូវបានជំនួសដោយការភ្ជាប់ Allosteric រវាងកន្លែងកើនឡើង និងជាលទ្ធផលនៃកិច្ចសហប្រតិបត្តិការចង។ ខណៈពេលដែលឥទ្ធិពលនៃអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្តាទិចដ៏គួរឱ្យទាក់ទាញលើកិច្ចសហប្រតិបត្តិការអាចត្រូវបានលុបចោលដោយការផ្លាស់ប្តូរ D112E ឥទ្ធិពលនៃចំណង covalent មិនអាចធ្វើបានទេ។ នៅក្នុងការរុករករបស់យើងនូវចន្លោះគីមីដែលមានសម្រាប់ការភ្ជាប់និស្សន្ទវត្ថុ guanidine ទៅនឹងបណ្តាញ Hv1 យើងបានរកឃើញថា 2-guanidinothiazoles ដូចជា GBTA មានការពឹងផ្អែកខ្លាំងជាងការផ្តោតអារម្មណ៍ខ្លាំងជាង 2-guanidinobenzimidazoles (រូបភាព 1c) ។ ការវិភាគមេគុណភ្នំនៃការចង GBTA ទាំងពីរ និងឆានែល monomeric (រូបទី 2a, ខ) និងទៅឆានែល dimeric ដែលក្នុងនោះ subunit មួយត្រូវបានចងជាមុនទៅនឹង inhibitor (រូបភព 4) នាំឱ្យយើងសន្និដ្ឋានថា inhibition នៃ Hv1 ដោយ GBTA សកម្មភាពគឺជាដំណើរការរួមមួយ និង ទីតាំងចងនៃសមាសធាតុនៅក្នុងអនុរងទាំងពីរត្រូវបានផ្គូផ្គងដោយ allosterically ។ របកគំហើញដែល GBTA ភ្ជាប់ទៅឆានែលបើកចំហ ដូចដែលបានបង្ហាញពីមុនសម្រាប់សមាសធាតុពាក់ព័ន្ធ 2GBI32 បង្ហាញថាការភ្ជាប់ allosteric អាចត្រូវបានវាយតម្លៃជាពិសេសនៅក្នុងស្ថានភាពបើកចំហ។ គំរូចងសហករណ៍របស់យើង មានបរិមាណពណ៌នាអំពីការទប់ស្កាត់ HV1 ដោយ GBTA (FIT ។ 2C) និងពន្យល់ពីផលប៉ះពាល់ផ្សេងៗគ្នានៃ 2GBBI និង GBTA លើការពុកផុយរបស់ឆានែលដែលគាំទ្រការបកស្រាយរបស់យើងលើដំណើរការដែលមានកាតព្វកិច្ចរបស់យើង។ មេគុណភ្នំអតិបរមាដែលអាចសម្រេចបានក្នុងប្រូតេអ៊ីន artesteric មួយដែលមានទីតាំងជាប់គ្នាចំនួន 2 (ដូចជា HV1) គឺ 2,1 វ៉ាត់ GBTA ដើម្បីចងខ្សែប្រភេទ HV1 ដោយមានមេគុណចំនួន 1.31 ដែលបានកើនឡើងដល់ 1,88 ក្នុង HV1 I127C.The ថាមពលឥតគិតថ្លៃដែលជាភាពខុសគ្នារវាងតំបន់ទំនេរឥតគិតថ្លៃនៃតំបន់ដែលមានភាពទាក់ទាញទាបបំផុត (សូមមើលវិធីសាស្រ្ត) គឺ 1,3 kcal / mole ក្នុងករណី HV1 ប្រភេទនិងម៉ូលក្នុងសំណុំរឿង HV1 I127C.TE អុកស៊ីសែនទៅអេម៉ូក្លូប៊ីនគឺជាឧទាហរណ៍ដែលល្បីល្បាញនិងសិក្សាដ៏ល្បីល្បាញបំផុតនៃដំណើរការសហការគ្នារបស់មនុស្ស (Tetramer ដែលមានកន្លែងភ្ជាប់ដែលមានរាងពងក្រពើបួន) ដែលជាមេគុណភ្នំចំនួន 4 ចាប់ពី 2,5-3.0 ដែលមានតំលៃចាប់ពី 1,26 ដល់ 3,64 KCal / Mol អាស្រ័យលើលក្ខខណ្ឌពិសោធន៍ 38.Thus ទាក់ទងនឹងភាពស្វាហាប់របស់ GBTA Concistrity Considing របស់ GBTA TIMING ទៅ HV1 មិនខុសគ្នាច្រើនពីការជាប់គូសវតានោះទេនៅពេលដែលចំនួនជាបន្តបន្ទាប់នៃប្រូតេអ៊ីនដែលមានចំនួនខុសគ្នានៅក្នុងប្រព័ន្ធទាំងពីរត្រូវបានពិចារណា។ នៅក្នុងគំរូនៃការរួមបញ្ចូលរបស់យើង, ការចងរបស់ GBTA MOLECULEs មួយបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងនៃភាពជាប់ទាក់ទងនៃអនុភាពដែលនៅជាប់គ្នាដែលកំពុងដំណើរការនៃបរិស្ថានដែលទទួលបានពីព្រឹត្តិការណ៍ដែលមានការលូតលាស់ដំបូង (បណ្តាលឱ្យសម) នាំឱ្យមាន ការផ្លាស់ប្តូរអន្តរកម្មរវាងអតិសុខុមប្រាណការផ្លាស់ប្តូរការផ្លាស់ប្តូរទាំងនេះផ្លាស់ប្តូរទីតាំងភ្ជាប់របស់ពួកគេដែលបណ្តាលឱ្យមានភាពតឹងរឹងដំណើរការនេះ S1 Aspartate របស់ S1 កាលពីមុនត្រូវបានបង្ហាញថាជាផ្នែកមួយនៃ Proton Porton Pormay Porma ការវត្តមានរបស់ Proton និងដើរតួជា Reslection Reses27,28 ។ លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថាតម្រងជ្រើសរើសក្នុងមតិក្រៅប្រព័ន្ធ HV1 ពីរត្រូវបានគួបផ្សំក្នុងរដ្ឋ Open.Figure 7A បង្ហាញពីទីតាំងប្រហាក់ប្រហែលនៃគេហទំព័រ T112, D123, K125 និង I127 នៅលើ ScheMem VSD នៅលើរចនាសម្ព័នគ្រីស្តាល់នៃ HV1-Cod chimera.suggeEdered ទិសដៅសម្រាប់គូស្វាម៉ីភរិយាដែលពាក់ព័ន្ធនឹងចុងបន្ថែមនៃ S1 ត្រូវបានបង្ហាញជាមួយព្រួញខ្មៅ។ (ក) គ្រោងការណ៍របស់ HV1 VSD.BASED នៅលើរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់នៃ HV1-Cuansp Chimera ដែលជាផ្នែកមួយនៃស៊ីឡាំង។ ទីតាំងដែលបានព្យាករណ៍របស់ GBTA បានបង្ហាញថាជាព្រួញពណ៌ប្រផេះ .black បង្ហាញពីការភ្ជាប់ពាក្យដែលជាប់ទាក់ទងគ្នារវាងកន្លែងសំណាក់ S1 ដែលបានស៊ើបអង្កេត។ ក្នុងការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធស្រអាប់ពីរផ្សេងគ្នាដូចដែលបានឃើញពីផ្នែកខាងក្រៅនៃភ្នាសរំអិល ការបំបែកចុងខាងក្រៅនៃអេស 4 របស់អេស 4 (សញ្ញាព្រួញសញ្ញា) បង្កើតបាននូវការរៀបចំដែលបានបង្ហាញនៅលើការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនេះដែលបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង D123 និង I127 ពីមន្ទីរពេទ្យដែលនៅជាប់គ្នា។ (គ) ការតំណាងផ្នែកខាងខាងនយោបាយ នៅក្នុងការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធស្រអាប់ដែលមាននៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់ទំហំ 4G80 ក្នុង P140 ក្នុងសង្គមត្រូវគ្នាទៅនឹងទីតាំង D123 ក្នុង HV1 ។ លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថាអន្តរកម្មអេឡិចត្រូម៉ាញ៉េទិកអេឡិចត្រូនិចរវាងសំណល់ 123 (123D / 123D ឬ 123R / 123R) ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងកម្រិតនៃការបើកចំហរពីការច្រានចោល (123D / 123R) , បង្កើនកិច្ចសហប្រតិបត្តិការ (រូបភាព 5G) ។ វារំពឹងថាការដកហូតនៃការប្រតិភូរបស់ Alanine នឹងនាំឱ្យមានការកើនឡើងនៃការសហប្រតិបតិ្តការនៃការស្រអាប់ 123A / 123 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ (រូបភាពទី 5 អ៊ី) ។ ការបកស្រយគឺថាឥទ្ធិពលអស្ថិរភាពនៃការដាក់សំណៅអ៊ីដ្រូបាសនៅក្នុងបរិយាកាសមានស្ថេរភាពដោយសារការលុបបំបាត់ការសហការរបស់ D123 ដែលបណ្តាលឱ្យមានការកាត់បន្ថយសហករណ៍ដែលកំពុងចង។ ទីតាំង D171 នៃ Ciona Gutis Ci-HV1 (ត្រូវនឹង D123 ក្នុង HV1) ត្រូវបានបង្កើនលើការធ្វើឱ្យសកម្មគាំទ្រដល់សញ្ញាណដែល D123 មានទីតាំងស្ថិតនៅក្នុងបរិយាកាសអ៊ីពែរប្សគមនៅរដ្ឋបើកចំហ។ Gating នៃបណ្តាញអ៊ិនធឺណិត HV1 ត្រូវបានគេដឹងថាកើតឡើងតាមរយៈការផ្លាស់ប្តូរចំនួន 12,20,26,2,41.QIU al al26 បានរកឃើញថានៅពេលដែលមានរូបចម្លាក់វ៉ុលរបស់ CI-HV1 ឆ្លងកាត់ការផ្លាស់ប្តូរដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មប៉ុន្តែនៅតែបិទឆានែលប៉ុន្តែនៅតែបិទឆានែលប៉ុន្តែនៅតែបិទបណ្តាញ។ បន្ទាប់មកដោយការផ្លាស់ប្តូរប្លែកៗដែលបណ្តាលឱ្យប្រូតេសដើម្បីបើកការផ្លាស់ប្តូរទាំងផ្នែករងនៃឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាវ៉ុលត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយការផ្លាស់ប្តូរលើកទី 2 ត្រូវបានគេផ្លាស់ប្តូរដោយការផ្លាស់ប្តូរនៅទីតាំង D171 ។ ការកាត់បន្ថយសញ្ញានៃ fluorescent គឺស្របជាមួយនឹងវត្តមាននៃការធ្វើឱ្យអន្តរាយដល់អេស។ អេស។ អេសរវាងការបកស្រាយប្រតិកម្ម។ ហើយការសម្របសម្រួលគួបផ្សំដែលមាន artosteric រវាងគេហទំព័រភ្ជាប់ GBTA ។ Fujiwara et al25 បានស្នើថាមានចំណុចប្រទាក់កញ្ចក់នៃ Cytoplasmic របស់ Crytoplasmic Commons ដែលមានស្រោមជើងចំនួនពីរ (រូបភាព 7B) ។ ការវិភាគរបស់ VSD និងមុខងារទាំងមូលនៃតំបន់ដែលភ្ជាប់អេសអេសអេសលីកនិងស៊ី។ ស៊ី។ ស៊ី។ ដូច្នេះចំណុចប្រទាក់ S4-S4 ដែលបានរកឃើញទំនងជាឆ្លុះបញ្ចាំងពីការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធអេស។ អេស។ អេស។ រដ្ឋបិទជិតគំនិតមួយស្របស្របនឹងការរកឃើញរបស់ក្រុមហ៊ុនមុន្នី al ។ S1 ផ្លាស់ប្តូរ 39 ក្នុងអំឡុងពេល Gating ។ នៅទីនេះយើងបង្ហាញថានៅក្នុងរដ្ឋ Open ដែលចុងបន្ថែមនៃ S1 Helix ជិតនឹងគាំទ្រការភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងអេឡិចត្រូនិចដោយសមាធិ។ ក្រៅពីគ្នាទៅវិញទៅមកដើម្បីធ្វើអន្តរកម្មដោយផ្ទាល់។ ទោះយ៉ាងណាការបង្វិលអង្កាំ 20 អង្សានៃអេសឌីអេសអេសអេសអេសអេសអេសអេមអេសអេមអេមអេមអេមអេមអេមអេសអេមអេសអេម ជាមួយនឹងការរកឃើញរបស់យើង (រូបភាព 7 ខ, បន្ទះខាងស្តាំ) ។ យើងសូមណែនាំការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនេះសម្រាប់ឆានែលនៅក្នុងរដ្ឋបើកចំហ។ ទោះបីជាអង់ស៊ីមរបស់រដ្ឋាភិបាលត្រូវបានគេគិតថាជារចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់នៃ VSD ដាច់ស្រយាលរបស់វាត្រូវបានចាប់យកនៅក្នុងរដ្ឋស្រអាប់។ ចុងខាងក្រៅនៃអេស 1 ដែលមាននៅជិតគ្នាបានជិតគ្នាហើយការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធរួមគឺប្រហាក់ប្រហែលនឹងការស្នើសុំ សម្រាប់ HV1 (រូបភាព 7 ស៊ី) ហើយ Dimsp Dimers បានបង្ហាញថា VSDs នៃប្រូតេអ៊ីនទាំងនេះមានទំនោរក្នុងការបង្កើតចំណុចប្រទាក់ដែលចុងបន្ថែមនៃការប្រាស្រ័យទាក់ទងគ្នារបស់អេស 1 ។ តួនាទីសំខាន់នៃការធ្វើឱ្យសកម្មរបស់ HV1 ធ្វើឱ្យឆានែលនេះជាគោលដៅថ្នាំដ៏គួរឱ្យទាក់ទាញសម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យការមានកូនរបស់បុរស។ ការរស់រានមានជីវិតចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានជំងឺមហារីកសុដន់ 12 ឬមហារីកពោះវៀនធំ 13 ហើយត្រូវបានគេគិតថាជាថ្នាំម៉ូលេគុលតូចដែលកំពុងធ្វើឱ្យមានការរកឃើញនៅពេលដែលការរកឃើញរបស់ក្រុមហ៊ុន HV1 ដែលរកឃើញ Open HV1 AUTINIT ដែលនាំឱ្យមានការកើនឡើងនូវទំនាក់ទំនងស្នេហាអាចនាំឱ្យមានការអភិវឌ្ឍនៃថ្នាំដែលមានសក្តានុពលជាងនេះដែលផ្តោតលើប៉ុស្តិ៍ HV1 ។ ការផ្លាស់ប្តូរការផ្លាស់ប្តូររបស់គេហទំព័រ HV1 ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើបច្ចេកទេស PRCR ស្តង់ដារ។ C-Terminus នៃ Subonitit មួយត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ទៅនឹង N-Therinus នៃ ABSUNIT ទីពីរតាមរយៈ GGsggsggsggsggsggs ដែលមានអង់ស៊ីមត្រូវបានកំណត់ដោយអង់ស៊ីមរបស់ NHE1 T7 ប្រដាប់ប្រដាប្តូរអះអាង Mmachine (AMISION) ពីជីវឧស្ម័នអេកូតូធី។ . 2- Guanidino-Benzimidazole [1], 2- Guanidino-Benzothiozole [2], (4-Thiazol-2-YL), Guanidine [5 -Methyl-1,3 -thizol-2 YL) uaniidine) [6], ethyl 2-guanidino -3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2- guanidino-4- Thiazole- 5-carboxylate [9] និង (2-Guanidino--3-yiazol-5-yl) បានមកពី Sigma-Aldrich.Famotidine [7] គឺមកពី MP Biomedicals.1- [4 - (4-chlorophenyle) -1,3-Thiazol-2 YL] Guanidine [11] និង 1- [4- dimethyoxyphnyl) -1,3-yl] Guanidine [12] ពីបរិវេណវិទ្យាសាស្ត្រវិទ្យាសាស្ត្រ។ យ៉ាងហោចណាស់មានភាពបរិសុទ្ធ 99 ភាគរយ។ ការផ្អាក 2-Amino-4- (Trifluoromyl) Benzenethiol hydrochloride (1,02 ក្រាម) ក្នុងទឹកអាស៊ីត 7 មីក្រូហិរញ្ញវត្ថុ (2,5 អោន) ត្រូវបានបន្ថែម 2,5 ម។ ម។ ក។ ត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាជាមួយនឹងការរំញោចខ្លាំងក្លាសម្រាប់រយៈពេល 4 ម៉ោង។ 65 អង្សាសេ) អស់រយៈពេលជាច្រើនម៉ោងហើយបន្ទាប់មកបានបង្កើតឡើងវិញពីអេតចាយ / ប្រេងឥន្ធនៈអេធើរដើម្បីផ្តល់ឱ្យរឹងពណ៌ស (500 មីលីក្រាម 48%); MP 221-222 អង្សាសេ (ពន្លឺ 225-226 អង្សាសេ) 45; 1 ម៉ោង NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7.25 (ធំបំផុត S), 7.40 (D, 1) j = 8.1 hz), 7.73 H (D), 7.92 (ឃ , 1 h, j = 8.1 hz) .13c NMR (200 MHz DMSO-D6): δ = 114.2 (D, j = 3.5 hz), 111.7, 124.6 (Q, j, j = 272 ហឺត), 126.1 (q, j, j, 272 hz) = 135.8, 152.1, 175.5.HRMS (ESI): M / Z + H) +: 261.0416, បានរកឃើញ : 261.0419 ។ naphtho [1-amine-2 amine (300 មីលីក្រាម) សំយោគដូចបានរៀបរាប់ពីមុនត្រូវបានកំដៅដល់ 200 អង្សាសេក្នុងអាងងូតទឹកក្នុងបំពង់ទឹកថ្នាំតូចមួយ។ 1.0 ម។ ម។ ភស្តុក។ ត្រូវបានខូចជាបំណែកតូចៗហើយលាងសម្អាតទឹកដើម្បីផ្តល់ឱ្យរឹង amorphous ពណ៌លឿងស្លេក។ (38 មីលីក្រាម 10% 10) MP 246-250 អង្សាសេ; 1 ម៉ោង NMR (500 MHz DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 ម៉ោង j = 8.8 h j = 8.3 hz), 7.77 (D, 1 ម៉ោង , j = 8.6 hz), 7.89 (D, 1 ម៉ោង, J = 8.8 h, j = 8. 8. 8.8 Hz) 8.8.8.8.1.1.1.1.1.1 MHz, DMSO-D6): δ = 119.9, 123.7, 126.6, 126.5, 165.7, 160.7, 160.11N4s C12H11N4 (M + HT) +: 243.0699 , បានរកឃើញ: 243.0704 ។ ចរន្តប្រូតេស្តង់ត្រូវបានវាស់ជាបំណះខាងក្នុងនិងខាងក្រៅនៃការបង្ហាញពីការស្ថាបនាផ្សេងៗគ្នាដោយប្រើ Axopatch 200B ដែលគ្រប់គ្រងដោយកម្មវិធី Molamiles Softwariz 10 មានសមាសធាតុដូចគ្នា: 100 ម។ ម 2- (N-MOMPHOLINO ) អាស៊ីតអេតាណុលហ្វីល (MES) 30 មម Tetraetylammonium (តែ) Mesylety 5 មម ethycol-bis (2 aminoethyl) -N អាស៊ីត N'-tetraacetic (EDTA) ដែលបានកែតម្រូវ PH 6.0 ដែលមានការវាស់វែងអ៊ីដ្រូបាស។ ) និងដើមកំណើត 8.1 (ប្រភពដើម) ។ ដំណោះស្រាយដែលមានការប្រមូលផ្តុំផ្សេងៗនៃ HV1 rotibitor និងក្នុងករណីខ្លះ 10 មមβmeត្រូវបានណែនាំឱ្យចូលទៅក្នុងបន្ទប់ងូតទឹកដោយប្រព័ន្ធសន្ទះបិទភ្ជាប់របស់ VC-6 (Warner Mirl) Transistor Logic) signals.Rapid perfusion experiments were performed using a multi-tube perfusion pencil (AutoMate Sci.) with a 360 μm diameter delivery tip mounted in front of a patch pipette.Channel inhibition was determined by isochronal amperometric measurements at the end of the +120 mv ដកហូតការវាស់វែងរបស់ជីពចរត្រូវបានអនុវត្តដូចបានរៀបរាប់ពីមុនចំនួន 13,209 ។ ប្រើដើម្បីកែសំរួលសម្រាប់ការពុកផុយបច្ចុប្បន្ន 18 ជាមួយនឹងសមីការរបស់ភ្នំ: កន្លែងដែល [i] គឺជាការផ្តោតអារម្មណ៍នៃសារធាតុទះកែវ I និង H គឺ Hill Hill The Hill The Hill Cofferity.to គណនាមេគុណភ្នំ, សមីការ (2) ត្រូវបានរៀបចំឡើងវិញ: