Ачык Hv1 протондук каналынын бирдик аралык интерфейсин аллостериялык туташтырылган зонд менен сурамжылоо

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан серепчинин версиясы CSS үчүн чектелген колдоого ээ. Мыкты тажрыйба үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorer'де шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, камсыз кылуу үчүн колдоо үзгүлтүксүз болсо, биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз. Hv1 чыңалуу менен жабылган протон каналы эки чыңалуу сезүүчү доменден (VSD) турган димердик комплекс болуп саналат, алардын ар бири протон өтүү жолу менен жабылат. эки VSD ачык абалы биргелешип пайда белгилүү; бирок, негизги механизмдер жөнүндө аз эле белгилүү. Intersubunit интерфейстери аллостерикалык процесстерде негизги ролду ойнойт; бирок, мындай интерфейстер ачык Hv1 каналдарында аныкталган эмес. Бул жерде биз 2-гуанидинотиазол туундулары эки Hv1 VSDди биргелешип бөгөттөп, бул кошулмалардын бирин ачык суббирдиктердин ортосундагы аллостерикалык бириктирүү үчүн зонд катары колдонорун көрсөтүп жатабыз. VSDдин биринчи трансмембраналык фрагментинин аягы байланыштыруучу участоктордун ортосундагы байланышты ортомчу бөлүм аралык интерфейсти түзөт, ал эми спиралданган катушкалуу домен бул процесске түздөн-түз катышпайт. Биз ошондой эле каналдын протон-селективдик чыпкасы блокаторду байланыштыруучу кызматташтыкты көзөмөлдөй турганына күчтүү далилдерди таптык. . Voltage-дарбазалуу протон каналдары фитопланктон адамдарга чейин ар кандай организмдердин маанилүү ролду ойнойт1.Көпчүлүк клеткаларда бул каналдар протон мембранасынан протондун агып чыгышына ортомчулук кылат жана NADPH оксидазасынын активдүүлүгүн жөнгө салат. HVCN1 генинин продуктусу болгон Hv12,3.Hv1 (ака VSOP) В-клетканын пролиферациясында4, тубаса иммундук система тарабынан реактивдүү кычкылтек түрлөрүн өндүрүүдө5,6,7,8, сперматозоид клеткасында роль ойной турганы көрсөтүлгөн кыймылдуулугу9 жана аба бетиндеги суюктуктун рН жөнгө салынышы10. Бул канал, мисалы, B-клетканын malignancies4,11 жана эмчек жана колоректалдык рактары12,13.Ашыкча Hv1 иш рак клеткаларынын 11, 12 .Мээде метастатикалык дараметин жогорулатуу үчүн табылган рак түрлөрүн бир нече Overexpressed тартылган, Hv1 билдирди. microglia тарабынан жана анын ишмердүүлүгү ишемиялык инсульт моделдеринде мээнин зыянын күчөтөт. Hv1 протеининде чыңалуу сезгич домен (VSD) бар, ал S1ден S414кө чейин деп аталган төрт трансмембраналык сегменттен турат. VSD чыңалуу менен жабылган Na+, K+ жана Ca2+ каналдарынын жана CiVSP сыяктуу чыңалууга сезгич фосфатазалардын тиешелүү домендерин элестетет. Ciona gutis15.Бул башка белоктордо S4тин C-терминусу эффектордук модулга, тешикче доменге же энзимге туташтырылган. Hv1де S4 мембрананын цитоплазмалык тарабында жайгашкан орогуч-спираль домени (CCD) менен байланышкан. .Канал эки VSDден турган димердик комплекс болуп саналат, алардын ар бири дарбазалуу протон өтүү жолу бар16,17,18.Бул эки Hv1 суббирдиги биргелешип ачылганы аныкталды19,20,21,22, аллостерикалык кошулуу жана суббирликтер аралык өз ара аракеттенүү ойнойт деген ойдо. дарбаза процессинде маанилүү ролду ойнойт. оролгон катушка доменинин ичиндеги суббирдиктердин ортосундагы интерфейс жакшы аныкталган, анткени эки обочолонгон домендердин кристалл структуралары жеткиликтүү22,23. Башка жагынан алганда, мембрананын ичиндеги VSDлердин ортосундагы интерфейс эмес. жакшы түшүнүктүү. Hv1-CiVSP химердик протеиндин кристаллдык түзүлүшү бул интерфейс жөнүндө маалымат бербейт, анткени кристаллдашкан канал комплексинин тримердик уюштурулушу жергиликтүү Hv1 CCDди ачыткы лейцин сыдырма GCN424 менен алмаштыруудан келип чыгышы мүмкүн. Hv1 каналынын суббирдигинин жакында жүргүзүлгөн изилдөөсү эки S4 спиралынын экинчилик структурасын катуу бузбастан ПЗСга өтөт, натыйжада мембранадан башталып, цитоплазмага түшкөн узун спиралдар пайда болот деген тыянакка келди. Цистеиндин кайчылаш анализинин негизинде, бул изилдөө Hv1 VSD'лери S4 сегменти боюнча бири-бири менен байланышууну сунуштайт. Бирок, башка изилдөөлөр VSDдердин ортосундагы альтернативалуу интерфейстерди сунуш кылышкан. Бул интерфейстерге S1 сегменттери 17, 21, 26 жана S2 сегментинин 21. Сырткы учтары кирет. бул изилдөөлөрдүн натыйжалары VSDлердин ортосундагы аллостерикалык туташуу жабык жана ачык абалдарга көз каранды болгон гатинг процессине карата каралып, VSD ортосундагы интерфейс конформациядагы ар кандай абалдын өзгөрүшүнө жараша өзгөрүшү мүмкүн. Бул жерде биз 2-гуанидинотиазолдун Hv1 каналдарын эки ачык VSDге синергетикалык түрдө туташтыруу менен бөгөттөп, ачык абалда суббирдиктердин ортосундагы өз ара аракеттенүүнү изилдөө үчүн кошулмалардын бирин, 2-гуанидинобэнзотиазолду (ГБТА) колдонгонун таптык. Interface.Биз GBTA байланыш ийри сызыгын бир ингибитордун бир подбирдикке байланышы чектеш суббирдиктин байланыштуу жакындыгынын жогорулашына алып келген сандык модель менен жакшы сүрөттөлүшү мүмкүн экенин таптык. Ошондой эле D112 калдыктары, селективдүүлүк чыпкалары канал 27, 28 жана guanidine туунду милдеттүү сайттын бир бөлүгү 29 контролдоо GBTA милдеттүү cooperativity.We кооперативдик байланыштыруу CCD S4 сегментинен бөлүнөт Hv1 dimer, сакталат экенин көрсөтүп, CCD менен intersubunit Interface түздөн-түз эмес, сунуш кылат. ГБТА-байланыштуу жерлердин ортосундагы аллостерикалык туташууга ортомчулук кылат. Ал эми, биз S1 фрагменти суббирдиктердин ортосундагы интерфейстин бир бөлүгү экенин байкайбыз жана S4 спиралынын клеткадан тышкаркы учу димердин борборунан алыс жайгашкан жанаша VSDлердин түзүлүшүн сунуштайбыз. S1 фрагменти ачык абалда болушу керек. Hv1 кичинекей молекуласынын ингибиторлору ракка каршы дарылар жана нейропротектордук агенттер катары пайдалуу. Бирок, бүгүнкү күнгө чейин, бир нече кошулмалар 30,31,32,33 каналды бөгөттөй алган.Алардын арасында 2-гуанидинобензимидазол (2GBI, кошулма [1] сүрөттө 1а) жана анын туундулары протондордун VSD29,32 канал аркылуу өтүшүнө бөгөт коет. Мындай кошулмалардын байланышы эки ачык суббирдикте өз алдынча болот деп эсептелет. мурда 200 μM концентрациясында сыналганда Hv1ди дээрлик 2GBI сыяктуу эффективдүү тоскоол кылганы көрсөтүлгөн (1б-сүрөт). Биз тиазолдун башка туундуларын изилдеп көрдүк жана алардын айрымдары каналды GBTAга караганда окшош же чоңураак күч менен бөгөттөгөнүн таптык (1-сүрөт жана кошумча). текст).Биз төрт тиазол туундуларынын концентрацияга жооп ийри сызыктарын аныктадык (ГБТА жана кошулмалар [3], [6] жана [11], 1c-сүрөт) жана алар 2GBI.The Hill коэффициенттеринен (h) тикирээк экенин аныктадык. тиазолдун туундуларынын саны 1,109 ± 0,040тан 1,306 ± 0,033кө чейин өзгөрдү (сүрөт. 1c жана Кошумча 1-сүрөт). Ал эми 2GBI үчүн Hill коэффициенти 0,975 ± 0,024 29 болгон, 2а-сүрөт жана Кошумча 1-сүрөт. 1ден жогору Хилл коэффиценти милдеттүү кызматташтыкты көрсөтөт. Анткени ар бир Hv1 суб-бирдиги өзүнүн ингибиторуна ээ. байланыш сайты,29,32 биз тиазолдун туундусунун бир суббирдикке туташуусу экинчи ингибитор молекуласынын чектеш суббирдик менен байланышын күчөтүшү мүмкүн деп ойлодук. ГБТА эң жогорку Хилл коэффициентине ээ болгон сыноо кошулмасы болгон. Ошондуктан, биз бул кошулманы тандап алдык. андан ары милдеттүү синергия механизмин изилдөө жана шилтеме терс башкаруу катары 2GBI колдонулат. (a) Сыноочу кошулмалар: [1] Шилтеме Hv1 ингибитору 2-гуанидино-бензимидазол (2GBI).[2] 2-гуанидино-бензотиазол (ГБТА), [3] (5-трифторметил-1,3-бензотиазол-2-ил) гуанидин, [4] нафто[1,2-д][1, 3] Тиазол-2-ил -гуанидин, [5](4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин, [6](5-бромо-4-метил-1,3-тиазол- 2-ил) гуанидин, [7] фамотидин, [8] 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбон кислотасы этил эфири, [9] 2-гуанидино-4-метил Этил-1,3-тиазол-5-карбоксилат, [10 ](2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)этил ацетат, [11]1-[4-(4-Хлорофенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин.(b) Көрсөтүлгөн гуанидинотиазолдор жана 2GBI эталондук кошулмасы (көк-жашыл тилкелер) менен адамдын Hv1 активдүүлүгүн бөгөт коюу .Hv1 протондук агымдары -80 мВдан +120 мВга чейин кармап туруу потенциалынан деполяризацияга жооп катары Xenopus ооциттеринин ички сырткы плактарында ченелген. Ар бир ингибитор ваннага 200 μM.pHi = pHo = 6.0 концентрациясында кошулган .Маалыматтар орточо ± SEM (n≥4) болуп саналат.(c) Кошулмалар [2], [3], [6] жана [11] менен адамдын Hv1 концентрациясына көз каранды бөгөт коюу. 15 өлчөө чейин. Бул сызык 1-кошумча таблицада келтирилген көрүнүктүү Kd маанилерин алуу үчүн колдонулган Хилл туурасы болуп саналат. Хилл коэффициенттери 1-кошумча сүрөттө келтирилген туура келүүлөрдөн аныкталган: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (методдорду караңыз). (a,b) 2GBI жана GBTA бирикмелери концентрацияга көз каранды түрдө димердик жана мономердик Hv1ди ингибирлеген. Ар бир чекит 3-8 өлчөөлөрдүн орточо ингибирлөө ± SDди билдирет жана ийри сызык Hill fit.The Hill коэффициенттери (h) менен көрсөтүлгөн киргизилген гистограммалар Кошумча 3 жана 4-сүрөттөрдөгү туура келүүлөрдүн негизинде аныкталган. (a) көрсөтүлгөн GBTA концентрациясынын реакциясы 1c-сүрөттөгүдөй. GBTAнын димерикалык Hv1ге кооперативдик байланышы. Катуу кара сызык теңдеме (6) боюнча эксперименталдык маалыматтарга туура келүүнү билдирет, ал (d) көрсөтүлгөн байланыш моделин сүрөттөйт. Sub 1 жана Sub 2 деп белгиленген сызык сызыктар бимолекулярдык ассоциацияны билдирет. - тиешелүүлүгүнө жараша биринчи жана экинчи байланыш окуяларынын диссоциациясынын тең салмактуулук ийри сызыгы (1-кичи: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(г) Hv1 блогунун сунуш кылынган механизминин схемалык схемасы. ГБТА болгон учурда бир ачык суббирдикке кошулуу жанаша турган ачык суббирдиктин жакындыгын жогорулатат (Kd2 Hv1 каналдары алардын N- жана C-терминал цитоплазмалык домендерин Ciona Intestinalis чыңалуу сезгич phosphatase CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34.We тиешелүү бөлүктөрү менен алмаштыруу аркылуу monomerized болот. аларды димердик каналдын (жапайы типтеги) бөгөт коюусу менен салыштырдык (сүрөт 2a, b). Биз эки кошулмалардын ортосундагы байланыштыруучу кызматташтыктын айырмасы мономердик Hv1де жок кылынганын таптык, бул GBTAнын бир суббирдикке байланышы көбөйөт деген түшүндүрмөнү колдойт. башка суббирдиктин ингибиторго жакындыгы. Биз GBTAнын бир Hv1 суббирдигине байланышы туташуучу жердин кайра түзүлүшүнө алып келиши мүмкүн (фит35 индукциясы) деп ойлодук, бул чектеш суббирдиктин бош байланышуучу жеринин кайра түзүлүшүнө алып келип, байланыштын күчөшүнө алып келет. жакындык. ГБТАнын каналга кооперативдик байланышын сандык жактан сүрөттөп берүү үчүн, биз бир моделди колдондук, анда же суб-бирдик да Kd1 диссоциациялануу константасы менен бимолекулярдык реакциядан кийин биринчи ингибитор молекуласын байланыштыра алат (сүрөт 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*). Байланыш каналдын Кd2 диссоциациялануу константасы менен уникалдуу бимолекулярдык реакциядан кийин калган бош суббирдиктер ингибитор менен байланышкан абалды кабыл алат, мында Kd2 0.05, сүрөт 5d, i ) ). Башка жагынан алганда, D123A мутациясы GBTAнын Хилл коэффициентин олуттуу кыскартты (p 0,05/14). Эки бөлүмчөдөгү 123-позициядагы зарядды нейтралдаштыруу GBTAнын милдеттүү кооперациясынын күчтүү өзгөрүшүнө алып келди, ал эми заряддын эки бөлүмчөсүндө тескери таасири анча чоң эмес болгондуктан, биз анализди заряддын инверсия каналы менен бир гана суббирдикти камтууга кеңейттик. C-терминал суббирдигинде D123R алмаштыруу менен Hv1-байланышкан димерлерди түзүштү (5б-сүрөт) жана GBTA жана 2GBI тарабынан концентрацияга жооп кайтарууну өлчөштү. Биз ГБТАнын WT-D123R каналдары менен байланышуусунун Hill коэффициенти андан бир топ жогору экенин аныктадык. жапайы типтеги Hv1 (p