Interrogatio intersubunitae interfacei aperti Hv1 canalis protonii cum specillo allosterice copulato

Gratias tibi ago pro adire Nature.com.The versio navigatri quam uteris limitata subsidia pro CSS. Optima experientia commendamus te ut navigatro renovato uteris (vel convenientiae modum averte in Penitus Rimor). Interea ut cures continua subsidia, situm sine stylis et JavaScript ostendemus. Hv1 voltage-gated proton alveus est complexus dimericus constans duabus ditionibus voltage-sentientibus (VSDs), quarum singulae permeationis pathway gatum protonomium continet. Dimerizatio regitur per domain coil-coilum cytoplasmicum. Transitus a statu clauso ad status apertus in utroque VSDs notus est cooperative occurrere; attamen parum notum est de machinationibus subiacentibus. Interfaces interfationes clavis partes agunt in processibus allostericis; attamen tales interfaces in apertis canalibus Hv1 notae non sunt. Hic demonstramus derivationes 2-guanidinothiazolas intercludere duas Hv1 VSDs modo cooperativo et unum ex his compositis uti specillo allostericae copulationis inter subunitas apertas. Invenimus extracellulares. Finis primi fragmenti transmembrani VSD interfaciem intersubunitam format quae copulationem inter sites ligandi mediat, cum domain coil-coil non directe in hoc processu implicatur. Etiam validum testimonium invenimus colum proton-selectivum moderari cooperationem obstructorem . Voltage-gated canales protonatores magnas partes agunt in variis organismis, a phytoplankton ad homines1. In plerisque cellulis, hi canales proton- cati mediati e membrana protonica effluxant ac activitates NADPH oxidase ordinant. Sola nota voltage-gatata in hominibus canalis protonia. est Hv1, quod productum est HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) in B cellula proliferation 4 partes agere ostensa est, productio speciei oxygenii reactivae per systema immunem systema innatum 5,6,7,8, sperma cell. motility9 and pH constitution of airway superficie fluid10. Hic canalis pluribus expressis in cancris generibus implicatur ut malignitates B-cellulas 4,11 et pectus et carcinomata colorectalia 12, 13. Excessiva Hv1 actio inventa est ad augendam potentiam metastaticam cellularum cancri 11, 12 .In cerebro Hv1 exprimitur. per microglia, et eius actio exacerbare damnum cerebri in exemplaribus ictu ischemico ostensum est. Dapibus Hv1 continet domain voltage-sensitivum (VSD), quod constat ex quatuor segmentis transmembranis S1 ad S414. appellatis, VSD similes ditiones voltage-gatae Na+, K+ et Ca2+ canales et phosphatases voltage-sensibiles, quales CiVSP e Ciona gutis15.In his aliis servo, C-termini S4 adnectitur effectori moduli, dominii porum seu enzyme.In Hv1, S4 coniungitur cum gyro regio (CCD) in parte membranae cytoplasmici sita. . Alveus est complexus dimericus duobus VSDs constans, unumquodque gatum protonae permeationis iter 16,17,18. Hae duae subunitae Hv1 apertae inventae sunt cooperatively 19, 20,21, 22, allostericam coniunctionem et inter-subunitarum commercium ludere suggerentes. munus magni ponderis in processu gandi. Interfacies inter subunitas intra gyros gyros bene definitur quia structurae cristallinae duarum ditionum solitarum in promptu sunt 22, 23. Ex altera manu interfacies inter VSDs intra membranam non est. bene intellecta. Cristalli structurae dapibus chimaerici Hv1-CiVSP informationes de hoc interface non praebet, sicut ordo trimericae complexi canalis cristallitatis provenire potest e subrogatione indigenae Hv1 CCD per fermentum leucini zipper GCN424. Recens studium organisationis canalis Hv1 subunitae conclusit duas helices S4 transitus in CCD sine gravi distractione structurae secundariae, inde in helices longis quae e membrana incipiunt et in cytoplasm. Ex analysi cysteini crosslinking; Hoc studium proponit quod Hv1 VSDs se invicem tangunt per segmentum S4. Sed alia studia alternatim interfacies inter VSDs proposuerunt. Hae interfaces S1 segmenta 17, 21, 26 et extremitates exteriores S2 segmenti 21.A possibilis rationi diversae includunt. eventus horum studiorum est quod allosterica coniunctio inter VSDs examinata est quoad processum propinquum, qui pendet a civitatibus clausis et apertis, et intermedium inter VSDs variari potest varias mutationes status in conformatione. Hic invenimus 2-guanidinothiazolum vetare canales Hv1 per synergistice ligare ad duos apertos VSDs, et unum compositorum, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), ad probandum commercium inter subunitas in aperto statu. interface. Invenimus GBTA curvam ligaturam bene describi posse per exemplar quantitatis in quo ligamen inhibitoris ad unum subunitum proventuum in augmento ligationis affinitatis subunitentis adjacentis. Invenimus etiam residua D112, filtra selectiva pro alveum 27, 28 et partem guanidini situs ligandi derivativae 29 ditionis GBTA cooperationem ligandi. Ostendimus obligationem cooperativam conservatam in Hv1 dimer, ubi CCD a segmento S4 separat, suggerens intersubunitum interfaciem in CCD non directe. allostericam coniunctionem mediatam inter sites GBTA-bingentes. E contra invenimus fragmentum S1 esse partem interfaciei inter subunitas et ordinationem VSDs adjacentium cum fine extracellulari helix S4 ablato a centro helix S4 invenimus permittere. S1 fragmentum in aperto statu. Moleculae parvae inhibitores Hv1 utiles sunt sicut medicamenta anticancra et neuroprotectivorum agentium. Tamen, ut moderno tempore, paucae compositiones inhibere potuerunt canalem 30.31, 32, 33. Inter eas, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, composita [1] in Fig. . 1a) eiusque derivationes VSD29,32 permeationem protonum per canalem permeationem inventae sunt. Binding talium compositionum independenter in duobus subunitis apertis occurrere putatur. 2-guanidinobenzothiazole (GBTA, compositum [2] in Figura 1a) erat antea demonstravimus inhibere Hv1 fere tam efficaciter quam 2GBI cum probata ad collationem 200 μM (Fig. 1b). Alias ​​derivationes thiazoles examinavimus et deprehendimus aliquas earum canalem simili vel maiori potentia quam GBTA inhibuisse (Fig. 1 et Accessiones. text). Curvarum quattuor thiazolarum derivationum (GBTA et compositorum [3], [6] et [11], [1], Fig. 1c, retrahitur, invenimus eas altiores esse quam illae 2GBI.The Hill coefficientium (h) derivationum thiazolium ab 1.109 ± 0,040 ad 1.306 ± 0.033 (fig. 1c et accessiones fig. 1). Contra, collis coefficiens 2GBI erat 0,975 ± 0.024 29, Fig. 2a et accessiones Fig. 1).A Hill supra 1 coefficiens cooperationem ligandi indicat. ligamen situs, 29,32 cogitavimus ligationem thiazoli derivati ​​ad unam subunitam posse augere ligaturam alterius inhibitoris moleculi ad subunit adjacent. GBTA erat probatio composita cum supremo Hill coefficiente. Hanc igitur compositionem elegimus ad porro investigare mechanismum synergia ligandi et adhibita 2GBI ut relativum imperium negativum. (a) Test composita: [1] Relatio Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylico acidum ethyl- niensis, [9] 2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazole-5-carboxylatum, [10. ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethyl acetas, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidinum Excursus proton .Hv1 e tabulae Xenopi oocytae intus mensuratae sunt respondens ad depolarizationem ex potential tenente -80 mV ad +120 mV. Quaelibet inhibitor in thermis ad concentratio 200 μM.pHi = pHo = 6.0 adiecta est. .Data sunt media ± SEM (n≥4).(c) Inhibitionis humanae Hv1 contractio-dependentis per compositiones [2], [3], [6] et [11]. Quaelibet punctus medium inhibitionis ± SD of 3 repraesentat. ad XV mensuras. Linea est collis aptus ad obtinendum valores apparentes Kd relatis in Tabula supplementaria 1.Hill coefficientes determinati sunt ex viciis relatis in Fig. 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (cf. Methodi). Composita 2GBI et GBTA in inhibitione dimerici et monomerici Hv1 in modum concentrationis-dependens. Quaelibet punctum medium inhibitionis ± SD de 3 ad 8 mensurarum medium repraesentat et curva collis fit. Coefficientes collis (h) ostensum est. histogrammata inserta ex viciis nuntiatis in Figuris Supplementariis 3 et 4. Restrictio responsionis GBTA ostensae (a) eadem est ac in Fig. 1c.See Tabulam Accessiones 1 ad valores apparentes Kd.(c) Exemplar ligamen cooperativum GBTA ad Hv1 dimeric. Linea nigra solida aptos repraesentat notitia experimentali per aequationem (6), quae describit exemplum ligaturae in ostenso (d). Lineae elisae intitulatae Sub 1 et Sub 2 consociationem bimolecularem repraesentant. -dissociatio curvarum aequilibrii primae et secundae eventuum ligaturae, respective (Sub 1: OO + B BO*, Kd1 = 290 ± 70 µM; Sub 2: BO* + B B*O*, Kd2 = 29.3± 2.5 μM ) (d) Schematica schematis mechanismi propositae Hv1 block. In casu GBTA, ligamen ad unam subunitam apertam affinitatem subunit apertae adjacentis auget (Kd2 0.05) diminutionem in Hill coefficientem GBTA ligandi canales GGG comparati cum generis bestiis (Fig. 5c), suggerentes, quamvis partes suas in custodiendo. duo subunitates simul momenti, sed CCD non directe medias intersubunitas allostericae coniunctionis inter GBTA situs ligandi. (a) Schematica schematis Hv1 dimer cum mutatione triglycini in fine interiore S4 disposito ad coitum-coil domain cytoplasmicum intersubunitum mediatum (sagittae caeruleae). significatae mutationes, designantur ad probationem S1 fragmenta quae in coitu inter subunitas (sagittae caeruleae).(c-h) 2GBI (cyan) et GBTA (rubrum obscure) inhibent constructa indicata in modo-dependente dependens. Quaelibet punctum significat medium inhibitionis. ± SD of 3 ad 10 mensuras. Curva erat collis aptus ad obtinendas valores apparentes Kd (vide Tabulam Accessiones 1).Hill coefficientes in histogramis interpolatis determinabantur sicut in sectione Methodorum descripta (vide Fig. 3 et 4).Relatio h valores ad Hv1 WT ut lineae allisae monstrantur. Asterisci peraeque significant differentias inter mutant et WT locos (p 0.05, Fig. 5d, i). ). Alia ex parte, mutatio D123A signanter reduxit Collem coefficientem GBTA (p 0.05/14) non occurrit. Cum crimen ad positiones 123 neutralis utriusque subunitis consecuta est in valida mutatione in GBTA cooperationem ligandi, cum crimen in utroque subunitatum convertendo parvum effectum habuit, analysim extendimus ut unam tantum subunitam cum inversione criminis includamus. generatae Hv1-coniunctae dimersae cum D123R substitutione in subunitis C-terminalibus (fig. 5b) et inhibitionis intentionis responsionis a GBTA et 2GBI. Invenimus collem coefficientem GBTA ligandi canales WT-D123R insigniter altiorem fuisse quam illud generis silvestris Hv1 (p 0.05). Invenimus etiam in absentia abaME, collem coefficientem GBTA ligandi ad D112E I127C Hv1 dimer signanter altiorem fuisse quam mensuratum coram agentium reducendis (Fig. 6e et Fig. 4. additamentis), cum mutationem D112E auctum ligandi GBTA cooperativum e cruce-nexionis cysteini provenientem non abolevit 127. Collis coefficiens 2GBI ligaminis ad D112E, I127C Hv1 dimers etiam non signanter afficitur mutationis D112E (Figura 1).6d et supplementaria. Fig. 3). Simul sumptae, hae inventiones suggerunt obligatorium GBTA auctum esse per commercium inter extremitates extremitatum S1 fragmentorum in vicinis Hv1 subunitis per attractivas interationes electrostaticas, vel per formationem ligamentorum covalentium inter cysteines allostericos coniunctio inter sitas auctas et proventus ad cooperationem ligandam. Dum effectus attractivorum interationes electrostaticae in cooperativitatem per mutationem D112E aboleri possunt, effectus vinculorum covalentium non possunt. In nostra exploratione spatii chemici available ad derivationes guanidines ad canales Hv1 ligandas, invenimus 2-guanidinothiazoles sicut GBTA altiorem depensionem habere quam 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). et canales monomericos (Fig. 2a, b) et ad canalem dimericum, in quo unus subunitus praestrictus erat inhibitoris (fig. 4), nos adduxit ut concluderemus inhibitionem Hv1 by GBTA Actionem esse processum synergisticum, ac ligamen situs compositorum in duobus subunitis allosterice copulatur. Inventio quam GBTA ligat ad canalem apertum, ut antea ostensum est pro 2GBI32 compositis relatis, suggerit allostericam coniunctionem specifice aestimari in aperto statu. Exemplar ligandi cooperativum nostrum poterat quantitatem describere inhibitionis HV1 per GBTA (Fig. 2C) et explicare diversis effectus 2GBI et GBTA in labe de alveo cauda excursus post membranam repolarization, quod sustinet nos interpretatione post membranam, quae subsidiis nostris interpretatione ad binding processus. Quod maximum Hill coefficiente quod potest esse in an allerster in dapibus cum duobus binding situs (ut HV1) est 2.we metiri GBTA ad alligare HV1 fera-type cum coefficientem 1,31, qui auctus est 1.88 in HV1 I127C.The Synergistic Free Energy, Differentia inter binding liberi vires infimi et summa affinitate situs (videatur modi), erat 1.3 kcal / talpa in casu de HV1-Type et 2.7 KC1 / talpa in HV1 I127C.The Binding De oxygeni ad hemoglobin est maxime celebre et bene-studuit exemplum de collaborative processus process38.for humanum Hemoglobin (a Tetramer cum quattuor Allosterically coupled binding situs), in montem coefficientem a 1.26 ad 3.64 KCAL / Mol, fretus experimentalem condiciones condiciones, in terms of global energetics, in cooperativity of GBTA binding to HV1 non secundum substantiam differt ab eo de Dapibus subunits in hemoglobin cum diversis numeris subunits in duas systems sunt considerari. In Synergy Model, binding of GBTA moleculis ad unam subunit results in incremento in obligatione affinitate affinitate de adjacent subunit.we envision a processus in quo a reargement de binding environment ex prima binding eventus (induci adveniens mutationes in interactiones inter subunits.in responsio ad haec mutationes, adjacent subunits mutare binding situs, unde in Arctter GBTS.During hoc processum, S1 aspartate d112 est reor a renes ad AD ASTRORS.D112 Previously ostensum est pars HV1 Proton permeeation via et agere ut selectivity Filter27,28. Our results show that selectivity filters in the two Hv1 subunits are allosterically coupled in the open state.Figure 7a shows the approximate location of the GBTA binding site and the location of residues D112, D123, K125 and I127 on a schematic of the Hv1 VSD based In cristallum structuram HV1-Civsp chimera.suggested directiones ad Allosteric coitu in extracellular finem S1 ostensum est cum nigra sagittis. (A) schematic de HV1 Vsd.based in cristallum structuram de HV1-Civsp chimaera, Helical segmentis sunt ostensum est cylindrical.in hoc configuratione, in interiorem finem S4 segmentis mergeris cum CCD (non ostensum est. Praedicta loca tenetur GBTA sunt ostensum est griseo ovals.black sagittas indicant meatus involved in Allosers.The iungere inter binding sites in duas adjacent subunits.the positions de investigari S1 residua sunt notata est HV1 subunits disposita Duobus diversis cinteram configurationes, ut ab extracellular parte membrana plane.on sinistram panel, ad Dimer interface formatur per S4 Helix.Rotation Duo Vsds XX gradus clockwise circa axem perpendicularis ad membranam planum, cum Separationem exterminium fines duorum S4 hicrices (dashdas), producit dispositionem ostensum est in right.in hoc configuratione, residua D123 et I127 ex adjacent subunits non licet ad propinquus et Civsp VSD In dimidio configuratione in 4GLXXX Crystal structure.Position p140 in Civsp correspondet positionem D123 in HV1. Our results show that the repulsive electrostatic interaction between residue 123 (123D/123D or 123R/123R) is associated with a "normal" level of GBTA-binding cooperativity in the open state and shifts the interaction from repulsion to Attracted (123D/123R) , Auxit cooperante (Fig. 5g) .it expectat quod remotionem ex repulio commercium cum Alanine substitutio esset etiam ducere ad augeri cooperativity.however.However, decrescit in cooperativity 123a / 123a dimidio dictum est (Fig. 5E) 123a est (Fig. 5E) 123a Explicandum est quod destabilizing effectus de ponendo hydrophobic residuam in hydrophilic environment ut prae stabilientem effectus debitum ad eliminanda interactiones inter D123 residua, inde in altiore reductione in binding cooperativity.mony et al.39 nuper nuntiavit solvendo, et in al.39 nuper nuntiavit in Position D171 de Ciona Gutis Ci-HV1 (correspondentes ad D123 in Human HV1) est auctus ad activation, supporting notionem quod D123 sita in hydrophilic in aperto statu. Gating HV1 channels notum fieri per multa transitus19,20,26,39,40,401.Qiu et al26 inveni quod super membrana depolarization, in voltage sensorem CI-HV1 activated et tamen clausa Sequitur distincta transitus quod causas protons aperta conduction in utroque subunits Path.The conformational mutatio voltage sensorem erat monitored per voltage-fibulis fluorat, et inventum secundum transitus selective perturbatur per mutationem in loco D171. In perturbatione fluorescent signum est consistent coram electrostatic interactiones inter D171 residua de adjacent subunits ad aliquid per reactionem coordinatas de conformational change.This interpretatio est cum nostris inveniens quod D123 residua electrostatically interacts in aperto statu et mediatlosteric coitu inter GBT binding sites. Fujiwara et al25 propositus quod ad Dimer interface de cytoplasmic coiled-coil domain se extendit in membranam ad continere duas S4 hicrices (Fig. 7b, left panel est secundum cysteine ​​crucis-iunctionibus analysis est secundum cysteine ​​crucis-huic interesubun in oratione fundatur in cysteine ​​et hoc intersubun in cysters in cysteine, ut interdit in cysteine ​​crucem-iunctionis analys Et totius VSD et eget analysis de regione connectens S4 Helix et ccd.in absentia a transmembrane PH gradientis, HV1 channels requirere aliquantum membrana depolarization aperire, et cysteine ​​crosslinking occurs sub conditionibus in alveo est, quod predominantly occurs sub conditionibus, ubi alveo est predominantly occurs sub conditionibus in alveo, quod est predominantly occurs sub conditionibus, ubi alveo est predominantly occurs sub conditionibus, et cysteine ​​occurs sub conditionibus, et cysteine ​​occurs sub conditionibus, et cysteine ​​est in conditionibus, ubi est praefinenter clausit. Ideo deprehenditur S4-S4 interface verisimiliter reflects off-publica subunit configuration.Ather studiis invenimus testimonio ad involvement of S1 et S2 in interactiones interactiones in Galing17,26 Suggessing quod channels ut adoptare diversis subunit configurationes in aperto Closed civitatibus, ideam consistent cum Inventiones Mony et al. S1 movet XXXIX per gating. Hic nos ostendere, in aperto statu, extracellular fines S1 Helix sunt satis ad suscipere recta electrostatic interactiones, quae mediatus in extenso S4 S4 interactiones, S1 hicrices sunt nimis apart from each other to interact directly.However, a 20° clockwise rotation of the two VSD subunits around an axis perpendicular to the membrane plane, combined with the separation of the outer ends of the two S4 helices, yielded an S1-S1 configuration consistent In Inventiones (Fig. 7b, ius panel) .We suadeo hoc configuratione in alveo in aperto statu. Licet civitatis Civsp enzyme ut Monomer, crystallum structuram et solitaria VSD captum in Dimer state.The externa fines S1 hiclices in hoc propositus est simile Nam HV1 (Fig. 7c) .in in Civsp Demer, quod closest residuum a adjacent subunit prolice CXL (Fig. 7c), P140 in HV1.The similitudine subunit configuratione inter Hv1 Et Civsp dimers insinuat quod Vsds harum proteins habere intrinsecam tendentia formare interface ubi extracellular fines S1 interact. Et Essential Partes of HV1 in sperma cell activation facit hoc alveo est attractive medicamento scopum ad imperium of masculinum fertility.furmore, activation de HV1 in MicrogLia est ostensum est ad COMMENDIUM ESCHEMICUS Stroke.Enhanced HV1 operatio est inventa est in inventa est cum inferioribus Salvos in aegris cum pectus XII aut coloreectal cancer XIII et cogitavi ut conferre ad B-cell malignancies XI .Theutics.the inventionis agentibus vel anticancer therapeutics.the inventionis quod Guanidinothiazole derivationes potest inducere quod Guanidinothiazole derivationes potest inducere in inventionem in Guanidinotinothia Derivatibus in Aperi HV1 subunit, ducens ad auctam affinitatem, ut ad progressionem de potentior medicinae targeting HV1 channels. Site-dirigi mutagenesis de Human HV1 factum per vexillum PCR Techniques.in in Hv1ncivSp officinas, residua 1-96 et 228-273 HV1 sunt reponi residua 1-113 et 240-576 of Civsp18.in HV1, coniunctum Dimer, Et C-Termini unius subunit est coniunctum ad N-terminus secundi subunit per Ggsggsgsggsggsggg Linker.The PGEMHE Plasmids quibus variis constructibus linearized et Nhe1 aut SPH1) et RNA synthesis cum T7 mmachine mmachine transcription Kit (Ambion) .1-3 diebus ante electrophysiological mensuras, CRNA erat infusum in Xenopus Oocytes (L NL per cellulam, 0.3-1.5 ex Xenopus Laevis (Nasco) adeptus from Ecocyte Bioscience.Following RNA injection, cells were maintained in ND96 medium containing 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml gentamicin, pH 7.2 18°C . II-Guanidino, Benzimidazole [I], II-Guanidino, Benzothiazole [II], (IV-methyl, 1,3-Thiazol, II-YL) Guanidine [V], (V-Guanidine, IV -3, (V, Bromo-IV -Methyl, 1,3 -Thiazol, II-YL) Guanidine) [VI], ethyl II-Guanidino-V, Methyl, 1,3-Thiazole-IV-carboxylate [VIII], ethyl II-Guanidino-4- Methyl, 1,3, thiazole- V-carboxylate [IX] et (II-Guanidino-IV-methyl, 1,3-thiazol, V-yl) ethyl acetate [X] et ex Sigma, Aldrich.famotidine [VII] ex mp biomedicals.1- - (IV-chlorophenyl) -1,3-thiazol-II-yl] Guanidine [XI] et 1. [4- (3,4-Dimethoxyphen) -1,3- Thiazol, II -1,3-, YL] Guanidine [XII] fuit from Matrix Scientific.These compounds are of the highest purity commercially available.They were dissolved in dry DMSO to generate a 100 mM stock solution, which was then diluted in the recording solution at the desired final concentration.Compounds 3 and 4 were synthesized below with saltem XCIX% puritatem. Ad suspensionem II, amino-4- (trifluoromethyl) benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) in XXV ml aqueous hydrochloric acidum (n) additae solidum Diaudiamide (CCCLXXX mg, 4,5 mmol) et inde heterogenea Refluxed cum strenuus turbantes in IV hours.The reactionem mixtisque est refrigeratum ad locus temperatus et neutralized a gradual etiam ex 10N potassium hydroxide.The albus et inhaerere percolantur, laverunt cum frigus aqua (III × L ml), siccat in clibano ( LXV ° F) pro aliquot horas et recrystallized ex ethyl acetate / PETROLEUM Ather dare a album solidum (D mg, XLVIII%); MP 221-222 ° (Lux 225-226 ° C) XLV; 1h NMR (D MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7,25 (ipsum late s, IV h) 7,1 HZ), 7.73 (s, I h), 7.92 (d , I h, J = 8.1 HZ) .13C NMR (CC MHZ, DMSO-D6): Δ = 114.2 (D, J = 3.5 HZ), 12,7 (Q, 117.5, = 272 Hz), 126.1 (q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.HRMS (ESI): m/z calculated value.For C9H8F3N4S (M + H)+: 261.0416, found : 261,0419. Naphthonis [1,2-D] Thiazol-II-Amine (CCC mg, 1.5 mmol), synthesized ut antea descriptus, erat calefacta ad CC ° C in oleum (magnam) cyanamide et 1.0 ml conc.to in calidum compositum additum hydrochloric acidum cursim et mixtisque fuit tenentur in oleum balneum circiter II minutes, in quo tempus maxime de aqua evaporated.the reactionem mixtisque est igitur materia solidified est ad locus temperatus et inde solidified material fractum in frusta et lavit aqua providere pallide flavis amorphous solidum. (XXXVIII mg, X%) MP 246-250 ° C, 1H NMR (D MHz, DMSO, D6, D2O): Δ [PPM] = 7.59 (T, I h, J = 8,2 HZ) 7.66 (T, I = H, J = 7.66) 7.77 , J = 8.6 HZ), 7.89 (D, I h, J = 8.6 HZ), 8,02 (D, I H, J = 8,2 HZ (8.35) .13c MHZ, DMSO, D6): Δ = 119.9, 122,7, 123.4, 123,6, 126,5, 127,1, 128.7, 132.1, 140,7, 169.1.7 (ESI, 140,7: 169.1.7 (ESI), M / Z + H) +: 243,0699 , Inveni: 243,0704. Proton excursus fuerunt metiri in internum et externum inaequaliter ex Oocytes expressing diversis constructs usura an axopatch 200B ampli, axon axon digidata 1440a (Molecular solutions in eodem compositione, C mm 2- (N-Morpholino ) Ethanesulfonic acidum (mes), XXX mm tetraethylammonium (tea) Mesylate, V mm tea chloride, V mm ethylene glycol-bis (II-aminoethyl) -n, n, n, n'-tetraacetic acidum (EGTA), adaequare PH 6.0 cum tea hydroxide.All mensuras sunt praestitimus ad XXII ± II ° C.The Pipette habet aditus resistentiam 1.5-4 mΩ.current vestigia sunt percolantur ad I khz, ghz et in V khz et analyzed in CMPPFIT10.2 (Molecular machinas ) Et Origin8.1 (Origulamb). Solutions quibus variis concentrations HV1 inhibitor et in quibusdam casibus X mm βMe introducta in balneum per gravitatis per multiplicem pertinent ad VC-VI perfusio valvae ratio (Warner TTL (transistor- Transistor Logic) signals.Rapid perfusion experiments were performed using a multi-tube perfusion pencil (AutoMate Sci.) with a 360 μm diameter delivery tip mounted in front of a patch pipette.Channel inhibition was determined by isochronal amperometric measurements at the end of the MV Depolarizing Pulse.gv mensuras superiores sunt sicut antea description18,20.tail excursus fuerunt memoriae ad -40 MV post depolarization gradus ad diversas voltages ex -20 MV ad CCXX MV nisi aliud stated.the referat pulsus praecedenti, nisi aliud stated.the referat pulsus praecedenti priori, nisi aliter stated.the reference est præcedens preceding præcedens legum used to correct for current decay 18 .The GV graph fits the Boltzmann equation: The apparent dissociation constants (Kd) for different combinations of channels and inhibitors (Supplementary Table 1) were determined by fitting the concentration dependence of inhibition (mean %inhib values) Cum ad montem aequatio, ubi [i] est concentratio de inhibitor ego et H est collem coefilvy.to computare collem coefficientem, aequationem (II) quod Verum: