ການສອບຖາມຂອງອິນເຕີເຟດ intersubunit ຂອງຊ່ອງ proton Hv1 ທີ່ເປີດດ້ວຍການສືບສວນທີ່ປະສົມປະສານ allosterically

ຂໍຂອບໃຈສຳລັບການເຂົ້າເບິ່ງ Nature.com. ເວີຊັນຂອງບຣາວເຊີທີ່ທ່ານກຳລັງໃຊ້ຢູ່ມີການຮອງຮັບ CSS. ສໍາລັບປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດໂໝດເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer). ໃນລະຫວ່າງນີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນ ສືບຕໍ່ສະຫນັບສະຫນູນ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊທ໌ໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript. ຊ່ອງ proton-gated ແຮງດັນ Hv1 ແມ່ນ dimeric complex ປະກອບດ້ວຍສອງໂດເມນທີ່ຮັບຮູ້ແຮງດັນ (VSDs), ແຕ່ລະອັນມີເສັ້ນທາງການ permeation proton gated.Dimerization ແມ່ນຖືກຄວບຄຸມໂດຍ cytoplasmic coiled-coil domain. ການຫັນປ່ຽນຈາກສະຖານະປິດເປັນ ລັດເປີດຢູ່ໃນທັງສອງ VSDs ແມ່ນເປັນທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຈະເກີດຂື້ນໂດຍການຮ່ວມມື; ຢ່າງ ໃດ ກໍ ຕາມ, ຫນ້ອຍ ແມ່ນ ເປັນ ທີ່ ຮູ້ ຈັກ ກ່ຽວ ກັບ ກົນ ໄກ ທີ່ ຕິດ ພັນ. ແນວໃດກໍ່ຕາມ, ການໂຕ້ຕອບດັ່ງກ່າວບໍ່ໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້ໃນຊ່ອງ Hv1 ເປີດ. ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ 2-guanidinothiazole derivatives ສະກັດກັ້ນສອງ Hv1 VSDs ໃນລັກສະນະຮ່ວມມືແລະນໍາໃຊ້ຫນຶ່ງໃນສານປະກອບເຫຼົ່ານີ້ເປັນ probe ສໍາລັບການ coupling allosteric ລະຫວ່າງ subunits ເປີດ. ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າ extracellular. ການສິ້ນສຸດຂອງຊິ້ນສ່ວນ transmembrane ທໍາອິດຂອງ VSD ປະກອບເປັນການໂຕ້ຕອບ intersubunit ທີ່ໄກ່ເກ່ຍການເຊື່ອມລະຫວ່າງສະຖານທີ່ຜູກມັດ, ໃນຂະນະທີ່ໂດເມນ coiled-coil ບໍ່ໄດ້ມີສ່ວນຮ່ວມໂດຍກົງໃນຂະບວນການນີ້. ພວກເຮົາຍັງພົບເຫັນຫຼັກຖານທີ່ເຂັ້ມແຂງວ່າຕົວກອງທີ່ເລືອກ proton ຂອງຊ່ອງທາງຄວບຄຸມຄວາມຮ່ວມມືຂອງ blocker-binding. . ຊ່ອງສັນຍານ proton ທີ່ມີແຮງດັນໄຟຟ້າມີບົດບາດສໍາຄັນໃນຫຼາຍໆສິ່ງມີຊີວິດ, ຈາກ phytoplankton ໄປສູ່ມະນຸດ1. ໃນຈຸລັງສ່ວນໃຫຍ່, ຊ່ອງທາງເຫຼົ່ານີ້ຊ່ວຍໄກ່ເກ່ຍ proton efflux ອອກຈາກເຍື່ອ proton ແລະຄວບຄຸມກິດຈະກໍາຂອງ NADPH oxidase. ຊ່ອງ proton ທີ່ມີແຮງດັນທີ່ຮູ້ຈັກພຽງແຕ່ໃນມະນຸດ. ແມ່ນ Hv1, ເຊິ່ງເປັນຜະລິດຕະພັນຂອງ HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີບົດບາດໃນການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນ B4, ການຜະລິດຂອງຊະນິດອົກຊີເຈນທີ່ reactive ໂດຍລະບົບພູມຕ້ານທານ innate5,6,7,8, ຈຸລັງເຊື້ອອະສຸຈິ. motility9 ແລະກົດລະບຽບ pH ຂອງນ້ໍາຫນ້າທາງເດີນຫາຍໃຈ10. ຊ່ອງທາງນີ້ແມ່ນມີສ່ວນຮ່ວມໃນຫຼາຍ overexpressed ໃນປະເພດມະເຮັງເຊັ່ນ: B-cell malignancies4,11 ແລະມະເຮັງເຕົ້ານົມແລະ colorectal12,13.ການກິດຈະກໍາ Hv1 ຫຼາຍເກີນໄປໄດ້ຖືກພົບເຫັນເພື່ອເພີ່ມທ່າແຮງ metastatic ຂອງຈຸລັງມະເຮັງ 11, 12 .ໃນສະຫມອງ, Hv1 ສະແດງອອກ. ໂດຍ microglia, ແລະກິດຈະກໍາຂອງມັນໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມເສຍຫາຍຂອງສະຫມອງທີ່ຮ້າຍແຮງກວ່າເກົ່າໃນຮູບແບບຂອງເສັ້ນເລືອດຕັນໃນ ischemic. ໂປຣຕີນ Hv1 ປະກອບດ້ວຍໂດເມນທີ່ຮັບຮູ້ແຮງດັນ (VSD), ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍສີ່ພາກສ່ວນ transmembrane ເອີ້ນວ່າ S1 ຫາ S414.The VSD ຄ້າຍຄືກັບໂດເມນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງຊ່ອງ Na+, K+ ແລະ Ca2+ ທີ່ມີແຮງດັນ ແລະ phosphatases ທີ່ລະອຽດອ່ອນແຮງດັນ, ເຊັ່ນ CiVSP ຈາກ Ciona gutis15.ໃນໂປຣຕີນອື່ນໆເຫຼົ່ານີ້, C-terminus ຂອງ S4 ແມ່ນຕິດກັບໂມດູນ effector, pore domain ຫຼື enzyme.In Hv1, S4 ແມ່ນເຊື່ອມຕໍ່ກັບ coiled-coil domain (CCD) ທີ່ຕັ້ງຢູ່ດ້ານ cytoplasmic ຂອງເຍື່ອ. .ຊ່ອງແມ່ນ dimeric complex ປະກອບດ້ວຍສອງ VSDs, ແຕ່ລະອັນມີ gated proton permeation pathway16,17,18.ສອງ Hv1 subunits ເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າເປີດ cooperatively19,20,21,22, ແນະນໍາວ່າການ coupling allosteric ແລະ inter-subunit ປະຕິສໍາພັນ. ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນຂະບວນການ gating. ການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ subunits ພາຍໃນໂດເມນ coiled coil ແມ່ນຖືກກໍານົດໄວ້ດີເພາະວ່າໂຄງສ້າງໄປເຊຍກັນຂອງສອງໂດເມນທີ່ໂດດດ່ຽວແມ່ນມີຢູ່ 22,23. ໃນອີກດ້ານຫນຶ່ງ, ການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ VSDs ພາຍໃນເຍື່ອແມ່ນບໍ່. ເຂົ້າໃຈໄດ້ດີ.ໂຄງສ້າງໄປເຊຍກັນຂອງ Hv1-CiVSP chimeric ໂປຣຕີນບໍ່ໄດ້ໃຫ້ຂໍ້ມູນກ່ຽວກັບການໂຕ້ຕອບນີ້, ຍ້ອນວ່າອົງການຈັດຕັ້ງ trimeric ຂອງສະລັບສັບຊ້ອນຊ່ອງທາງ crystallized ອາດຈະເປັນຜົນມາຈາກການທົດແທນຂອງ native Hv1 CCD ໂດຍເຊື້ອລາ leucine zipper GCN424. ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຂອງອົງການຈັດຕັ້ງ subunit ຂອງຊ່ອງ Hv1 ໄດ້ສະຫຼຸບວ່າສອງ helices S4 ຫັນເຂົ້າໄປໃນ CCD ໂດຍບໍ່ມີການ disruption ຢ່າງຮຸນແຮງຂອງໂຄງສ້າງຮອງ, ຜົນອອກມາໃນ helices ຍາວທີ່ເລີ່ມຕົ້ນຈາກເຍື່ອແລະໂຄງການເຂົ້າໄປໃນ cytoplasm. ອີງໃສ່ການວິເຄາະ cysteine ​​​​crosslinking, ການສຶກສານີ້ສະເຫນີວ່າ Hv1 VSDs ຕິດຕໍ່ກັນຕາມສ່ວນ S4. ແນວໃດກໍ່ຕາມ, ການສຶກສາອື່ນໆໄດ້ສະເຫນີການໂຕ້ຕອບທາງເລືອກລະຫວ່າງ VSDs. ການໂຕ້ຕອບເຫຼົ່ານີ້ປະກອບມີ S1 segments 17, 21, 26 ແລະປາຍນອກຂອງ S2 segment 21.A ເຫດຜົນທີ່ເປັນໄປໄດ້ສໍາລັບການຂັດແຍ້ງ. ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນວ່າການເຊື່ອມໂລຫະປະສົມລະຫວ່າງ VSDs ໄດ້ຖືກກວດສອບທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຂະບວນການປະຕູຮົ້ວ, ເຊິ່ງຂຶ້ນກັບລັດປິດແລະເປີດ, ແລະການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ VSDs ອາດຈະແຕກຕ່າງກັນໃນການປ່ຽນແປງຂອງລັດທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນການສອດຄ່ອງ. ທີ່ນີ້, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າ 2-guanidinothiazole ຍັບຍັ້ງຊ່ອງທາງ Hv1 ໂດຍການຜູກມັດຮ່ວມກັນກັບສອງ VSDs ເປີດ, ແລະນໍາໃຊ້ຫນຶ່ງໃນສານປະກອບ, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), ເພື່ອສືບສວນການຕິດຕໍ່ພົວພັນລະຫວ່າງ subunits ໃນລັດເປີດ. interface. ພວກເຮົາພົບວ່າເສັ້ນໂຄ້ງການຜູກມັດ GBTA ສາມາດຖືກອະທິບາຍໄດ້ດີໂດຍແບບຈໍາລອງປະລິມານທີ່ການຜູກມັດຂອງ inhibitor ກັບຫນຶ່ງ subunit ສົ່ງຜົນໃຫ້ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງການຜູກມັດຂອງ subunit ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ. ພວກເຮົາຍັງພົບວ່າ residues D112, selectivity filters ສໍາລັບການ. ຊ່ອງທາງ 27, 28 ແລະສ່ວນຫນຶ່ງຂອງການຜູກມັດຂອງ guanidine derivative site 29 ຄວບຄຸມ GBTA binding cooperativity. ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຜູກມັດການຮ່ວມມືແມ່ນຮັກສາຢູ່ໃນ Hv1 dimer, ບ່ອນທີ່ CCD ແຍກອອກຈາກສ່ວນ S4, ແນະນໍາວ່າການໂຕ້ຕອບ intersubunit ໃນ CCD ບໍ່ໄດ້ໂດຍກົງ. ການເຊື່ອມໂລຫະປະສົມລະຫວ່າງ GBTA-binding sites. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ພວກເຮົາພົບວ່າ fragment S1 ແມ່ນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ subunits ແລະສະເຫນີການຈັດລຽງຂອງ VSDs ທີ່ຢູ່ຕິດກັນກັບ extracellular end ຂອງ helix S4 ຫ່າງຈາກສູນກາງຂອງ dimer ໄດ້ເພື່ອອະນຸຍາດໃຫ້. ຊິ້ນ S1 ຢູ່ໃນສະຖານະເປີດ. ຕົວຍັບຍັ້ງໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍຂອງ Hv1 ມີປະໂຫຍດເປັນຢາຕ້ານມະເຮັງແລະສານປ້ອງກັນ neuroprotective. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ມາຮອດປັດຈຸບັນ, ທາດປະສົມຈໍານວນຫນ້ອຍສາມາດຍັບຍັ້ງຊ່ອງທາງ 30,31,32,33. ໃນບັນດາພວກມັນ, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, ທາດປະສົມ [1] ໃນຮູບ. . ກ່ອນຫນ້ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຍັບຍັ້ງ Hv1 ເກືອບປະສິດທິຜົນເທົ່າກັບ 2GBI ເມື່ອທົດສອບຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ 200 μM (ຮູບ 1b). ພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງອະນຸພັນ thiazole ອື່ນໆແລະພົບວ່າບາງສ່ວນຂອງພວກມັນຍັບຍັ້ງຊ່ອງທາງທີ່ມີທ່າແຮງທີ່ຄ້າຍຄືກັນຫຼືຫຼາຍກວ່າ GBTA (ຮູບ 1 ແລະເສີມ. ຂໍ້ຄວາມ).ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດເສັ້ນໂຄ້ງການຕອບສະໜອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງສີ່ອະນຸພັນ thiazole (GBTA ແລະທາດປະສົມ [3], [6] ແລະ [11], ຮູບ 1c) ແລະພົບວ່າພວກມັນສູງຊັນກວ່າຕົວຄູນຂອງ 2GBI. The Hill coefficients (h) ຂອງອະນຸພັນ thiazole ຕັ້ງແຕ່ 1.109 ± 0.040 ຫາ 1.306 ± 0.033 (ຮູບ. 1c ແລະຮູບການເສີມ 1).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ຄ່າສໍາປະສິດພູສໍາລັບ 2GBI ແມ່ນ 0.975 ± 0.024 29, ຮູບ 2a ແລະຮູບພາບເສີມ. 1).A Hill coefficient ຂ້າງເທິງ 1 ຊີ້ໃຫ້ເຫັນການຮ່ວມມືທີ່ຜູກມັດ. ເນື່ອງຈາກວ່າແຕ່ລະຫນ່ວຍຍ່ອຍ Hv1 ມີຕົວຍັບຍັ້ງຂອງຕົນເອງ. ສະຖານທີ່ຜູກມັດ, 29,32 ພວກເຮົາໃຫ້ເຫດຜົນວ່າການຜູກມັດຂອງອະນຸພັນ thiazole ກັບຫນຶ່ງ subunit ສາມາດເສີມຂະຫຍາຍການຜູກມັດຂອງໂມເລກຸນ inhibitor ທີສອງກັບ subunit ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ. GBTA ແມ່ນສານປະສົມທົດສອບທີ່ມີຄ່າສໍາປະສິດພູສູງທີ່ສຸດ. ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາເລືອກສານປະສົມນີ້ເພື່ອ. ການສຶກສາຕື່ມອີກກ່ຽວກັບກົນໄກການຜູກມັດແລະນໍາໃຊ້ 2GBI ເປັນການຄວບຄຸມທາງລົບທີ່ອ້າງອີງ. (a) ທາດປະສົມໃນການທົດສອບ: [1] ສານອ້າງອິງ Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10. ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) ການຍັບຍັ້ງການເຄື່ອນໄຫວ Hv1 ຂອງມະນຸດໂດຍ guanidinothiazoles ທີ່ລະບຸໄວ້ ແລະສານປະກອບອ້າງອີງ 2GBI (ແຖບສີຂຽວສີຟ້າ) .Hv1 ປະຈຸບັນ proton ໄດ້ຖືກວັດແທກຢູ່ໃນ plaques ພາຍໃນພາຍນອກຂອງ oocytes Xenopus ໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ depolarization ຈາກທ່າແຮງການຖືຂອງ -80 mV ຫາ +120 mV.Each inhibitor ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນອາບນ້ໍາທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ 200 μM.pHi = pHo = 6.0. .ຂໍ້ມູນແມ່ນຄ່າສະເລ່ຍ±SEM (n≥4).(c) ການຍັບຍັ້ງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂຶ້ນກັບ Hv1 ຂອງມະນຸດໂດຍສານປະກອບ [2], [3], [6] ແລະ [11].ແຕ່ລະຈຸດສະແດງເຖິງການຍັບຍັ້ງສະເລ່ຍ ± SD ຂອງ 3. ເຖິງ 15 ການວັດແທກ. ເສັ້ນແມ່ນ Hill fit ໃຊ້ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຄ່າ Kd ປາກົດຂື້ນທີ່ລາຍງານໃນຕາຕະລາງເສີມ 1.Hill coefficients ໄດ້ຖືກກໍານົດຈາກ fits ລາຍງານໃນຮູບເພີ່ມເຕີມ 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (ເບິ່ງວິທີການ). (a,b) ທາດປະສົມ 2GBI ແລະ GBTA inhibited dimeric ແລະ monomeric Hv1 ໃນລັກສະນະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂຶ້ນກັບ. ແຕ່ລະຈຸດສະແດງເຖິງການຍັບຍັ້ງສະເລ່ຍ ± SD ຂອງການວັດແທກ 3 ຫາ 8 ແລະເສັ້ນໂຄ້ງແມ່ນ Hill fit. The Hill coefficients (h) ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນ inset histograms ໄດ້ຖືກກໍານົດຈາກຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ລາຍງານໃນຮູບປະກອບ 3 ແລະ 4. ການຕອບສະຫນອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ GBTA ທີ່ສະແດງຢູ່ໃນ (a) ແມ່ນຄືກັນກັບໃນຮູບ 1c. ເບິ່ງຕາຕະລາງເສີມ 1 ສໍາລັບຄ່າ Kd ທີ່ປາກົດຂື້ນ.(c) ການສ້າງແບບຈໍາລອງຂອງ ການຜູກມັດຂອງການຮ່ວມມືຂອງ GBTA ກັບ dimeric Hv1. ເສັ້ນສີດຳແຂງສະແດງເຖິງຄວາມເໝາະສົມກັບຂໍ້ມູນການທົດລອງໂດຍສົມຜົນ (6), ເຊິ່ງອະທິບາຍຮູບແບບການຜູກມັດທີ່ສະແດງໃນ (d).ເສັ້ນ dashed ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ Sub 1 ແລະ Sub 2 ເປັນຕົວແທນຂອງສະມາຄົມ bimolecular. -dissociation equilibrium curves ຂອງເຫດການຜູກມັດຄັ້ງທໍາອິດ ແລະທີສອງ, ຕາມລໍາດັບ (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM. ).(d) ແຜນວາດແຜນວາດຂອງກົນໄກທີ່ສະເໜີຂອງບລ໋ອກ Hv1. ໃນກໍລະນີ GBTA, ການຜູກມັດກັບໜຶ່ງໜ່ວຍຍ່ອຍເປີດຈະເພີ່ມຄວາມສຳພັນຂອງໜ່ວຍຍ່ອຍທີ່ເປີດຢູ່ຕິດກັນ (Kd2 0.05, ຮູບ 5d, i ) ). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການກາຍພັນ D123A ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງຄ່າສໍາປະສິດ Hill ຂອງ GBTA (p 0.05/14). ເນື່ອງຈາກການເຮັດໃຫ້ຄ່າບໍລິການເປັນກາງຢູ່ຕຳແໜ່ງ 123 ຂອງທັງສອງໜ່ວຍຍ່ອຍໄດ້ສົ່ງຜົນໃຫ້ມີການປ່ຽນແປງທີ່ເຂັ້ມແຂງໃນການຮ່ວມມືຜູກມັດ GBTA, ໃນຂະນະທີ່ການປະຕິເສດຄ່າບໍລິການຂອງທັງສອງໜ່ວຍຍ່ອຍມີຜົນກະທົບເລັກນ້ອຍ, ພວກເຮົາຈຶ່ງໄດ້ຂະຫຍາຍການວິເຄາະໃຫ້ລວມເອົາພຽງແຕ່ໜຶ່ງໜ່ວຍຍ່ອຍກັບຊ່ອງທາງການປີ້ນຄ່າຂອງຄ່າບໍລິການເທົ່ານັ້ນ. ໄດ້ສ້າງ dimers ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ Hv1 ດ້ວຍການທົດແທນ D123R ໃນຫນ່ວຍຍ່ອຍ C-terminal (ຮູບ 5b) ແລະວັດແທກການຍັບຍັ້ງການຕອບສະຫນອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນໂດຍ GBTA ແລະ 2GBI. ພວກເຮົາພົບວ່າຄ່າສໍາປະສິດ Hill ຂອງ GBTA ທີ່ຜູກມັດກັບຊ່ອງ WT-D123R ແມ່ນສູງກວ່ານັ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ຂອງ wild-type Hv1 (p 0.05). ພວກເຮົາຍັງພົບວ່າໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ βME, ຄ່າສໍາປະສິດ Hill ຂອງ GBTA ຜູກມັດກັບ D112E I127C Hv1 dimer ແມ່ນສູງກວ່າທີ່ວັດແທກຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງຕົວແທນການຫຼຸດຜ່ອນ (ຮູບ 6e ແລະເພີ່ມເຕີມ Fig. 4), ຫມາຍຄວາມວ່າການກາຍພັນຂອງ D112E. ບໍ່ໄດ້ຍົກເລີກການເພີ່ມຂື້ນຂອງຄວາມຮ່ວມມືທີ່ຜູກມັດ GBTA ທີ່ເປັນຜົນມາຈາກການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມຂອງ cysteine ​​​​127. The Hill coefficient 2GBI binding to D112E, I127C Hv1 dimers ຍັງບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍການກາຍພັນຂອງ D112E (ຮູບ 1).6d ແລະເສີມ. ຮູບ 3). ປະຕິບັດຮ່ວມກັນ, ການຄົ້ນພົບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການຜູກມັດ GBTA ໄດ້ຖືກປັບປຸງໂດຍການພົວພັນລະຫວ່າງປາຍນອກຂອງຊິ້ນ S1 ໃນຫນ່ວຍຍ່ອຍ Hv1 ທີ່ຕິດກັນໂດຍຜ່ານປະຕິສໍາພັນ electrostatic ທີ່ຫນ້າສົນໃຈຫຼືຜ່ານການສ້າງຕັ້ງຂອງພັນທະບັດ covalent ລະຫວ່າງ cysteine ​​ທົດແທນ Allosteric coupling ລະຫວ່າງສະຖານທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນແລະສົ່ງຜົນໃຫ້ມີການຮ່ວມມືຜູກມັດ. ໃນຂະນະທີ່ຜົນກະທົບຂອງການໂຕ້ຕອບ electrostatic ທີ່ຫນ້າສົນໃຈກ່ຽວກັບການຮ່ວມມືສາມາດຖືກຍົກເລີກໂດຍການກາຍພັນ D112E, ຜົນກະທົບຂອງພັນທະບັດ covalent ບໍ່ສາມາດ. ໃນການສໍາຫຼວດຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບພື້ນທີ່ທາງເຄມີທີ່ມີຢູ່ສໍາລັບການຜູກມັດ guanidine derivatives ກັບຊ່ອງທາງ Hv1, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າ 2-guanidinothiazoles ເຊັ່ນ GBTA ມີການເພິ່ງພາອາໄສຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ steeper ກວ່າ 2-guanidinobenzimidazoles (ຮູບ 1c). ການວິເຄາະຄ່າສໍາປະສິດພູຂອງ GBTA ການຜູກມັດທັງສອງ dimeric. ແລະຊ່ອງ monomeric (ຮູບ 2a, b) ແລະຊ່ອງ dimeric ທີ່ຫນຶ່ງ subunit ໄດ້ pre-bound ກັບ inhibitor (ຮູບ 4) ໄດ້ນໍາພາພວກເຮົາສະຫຼຸບວ່າການຍັບຍັ້ງຂອງ Hv1 ໂດຍ GBTA ການປະຕິບັດແມ່ນຂະບວນການ synergistic, ແລະ. ສະຖານທີ່ຜູກມັດຂອງທາດປະສົມໃນສອງຫນ່ວຍຍ່ອຍແມ່ນເປັນຄູ່ກັນຢ່າງສົມກຽດ. ການຄົ້ນພົບວ່າ GBTA ຜູກມັດກັບຊ່ອງທາງເປີດ, ດັ່ງທີ່ສະແດງກ່ອນຫນ້ານີ້ສໍາລັບສານປະສົມທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ 2GBI32, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການເຊື່ອມໂລຫະປະສົມສາມາດຖືກປະເມີນໂດຍສະເພາະໃນສະພາບເປີດ. ຮູບແບບການຜູກມັດການຮ່ວມມືຂອງພວກເຮົາ ສາມາດອະທິບາຍຄວາມຈິງຂອງ HV1 ໂດຍ GBTA (ຮູບ 2c) ແລະອະທິບາຍເຖິງຜົນກະທົບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງກະເປົາ Tirbrents, ເຊິ່ງສະຫນັບສະຫນູນການຕີລາຄາຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບຂະບວນການຜູກມັດ. ຕົວຄູນພູສູງສຸດທີ່ສາມາດບັນລຸໄດ້ໃນໂປແກຼມທີ່ມີຄຸນສົມບັດ (ເຊັ່ນ: HV1) ສະພາບພະລັງງານເສລີພາບທີ່ບໍ່ເສຍຄ່າ, ຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງສະຖານທີ່ຟຣີທີ່ມີຄວາມເປັນຈິງທີ່ຕໍ່າທີ່ສຸດແລະເປັນ 1,7 kcal / mole / mole ໃນກໍລະນີຂອງ HV1 i127c.The ຂອງອົກຊີເຈນທີ່ເປັນຕົວຢ່າງທີ່ມີຊື່ສຽງແລະມີຄວາມສຸກທີ່ສຸດຂອງສະຖານທີ່ຮ່ວມມືຂອງມະນຸດ), KCAL / MOL, ຂື້ນກັບເງື່ອນໄຂການທົດລອງ 38.THUS, ໃນແງ່ຂອງການຮ່ວມມືຂອງ O2 ທີ່ມີທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນໃນສອງລະບົບຖືກພິຈາລະນາ. ໃນຮູບແບບ syntergy ຂອງພວກເຮົາ, ການຜູກມັດຂອງໂມເລກຸນ GBTA ປະມວນຜົນໃນການເພີ່ມຂື້ນຂອງສິ່ງແວດລ້ອມທີ່ຢູ່ໃນເຫດການທີ່ມີຜົນຜູກມັດທໍາອິດທີ່ອອກມາຈາກເຫດການຜູກມັດທໍາອິດທີ່ເຮັດໃຫ້ ການປ່ຽນແປງຂອງການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ subunits.in ການຕອບໂຕ້ຂອງການປ່ຽນແປງເຫຼົ່ານີ້, S1 ກ່ອນຫນ້ານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເປັນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງ Permeation Permeation HV1 Proton ແລະປະຕິບັດເປັນຕົວກອງທີ່ເລືອກໄດ້ 26,28. ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຕົວກອງເລືອກເອົາໃນສອງ Subunits ແມ່ນຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນສະຖານທີ່ຂອງ GBTA ແລະ D123, K125, K125 ແລະ I127 ໃນ schematic ຂອງ HV1 VSD ໂຄງປະກອບການໄປເຊຍກັນຂອງ HV1-Civsp CHIMELA.SUBGSTEDS Do ທິດທາງສໍາລັບການສົມທົບກັນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ S1 ຂອງ S1 ແມ່ນສະແດງດ້ວຍລູກສອນສີດໍາ. (a) schematic ຂອງ HV1 VSD.Based ໃນໂຄງສ້າງ Crystal ຂອງ HV1-Civsp Setgments.in ໃນຕອນທ້າຍຂອງ S4 ລວມເຂົ້າກັບ CCD (ບໍ່ໄດ້ສະແດງ). ສະຖານທີ່ທີ່ຄາດຄະເນຂອງ GBTA ທີ່ຖືກຄາດຄະເນແມ່ນສະແດງເປັນລູກສອນສີຂີ້ເຖົ່າ. ໃນສອງການຕັ້ງຄ່າ Dimer ທີ່ແຕກຕ່າງກັນດັ່ງທີ່ເຫັນຈາກດ້ານຂ້າງຂອງເຍື່ອຫຸ້ມຂອງເຍື່ອ. ການແຍກຕົວຂອງຜູ້ທີ່ມີສອງຂ້າງຂອງສອງຂອງ Hellices (Dashed ລູກສອນ), ຜະລິດການຈັດແຈງທີ່ສະແດງຢູ່ເບື້ອງຂວາມື. ໃນການຕັ້ງຄ່າ Dimer ທີ່ພົບໃນ 4G80 ໂຄງສ້າງ Crystal.position P140 ໃນ CivSP ເທົ່າກັບຕໍາແຫນ່ງ D123 ໃນ HV1. ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການໂຕ້ຕອບແບບ Electrostatic ທີ່ຫນ້າສົນໃຈ 123 (123D) ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບ "ປົກກະຕິ" , ການຮ່ວມມືທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບ 5g). ມັນຄາດວ່າຈະກໍາຈັດການໂຕ້ຕອບທີ່ຫນ້າລັງກຽດ. ຄໍາອະທິບາຍແມ່ນວ່າຜົນກະທົບທີ່ເສີຍຫາຍໃນສະພາບແວດລ້ອມ hydrophobic ໃນການລົບລ້າງຜົນກະທົບທີ່ບໍ່ສະຖຽນລະພາບລະຫວ່າງ D123 ຕໍາແຫນ່ງ D171 ຂອງ Ciona gutis ci-hv1 (ທີ່ສອດຄ້ອງກັບ D123 ການເປັນສ່ວນໃຫຍ່ຂອງຊ່ອງທາງ HV1 ແມ່ນເປັນທີ່ຮູ້ຈັກຜ່ານການປ່ຽນແປງຫຼາຍຄັ້ງ ,,20,1,1,1,q9,1,1,q9,q9,1,1,1,1,q9,q9,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,4,q1.12,q1.12,1,1,1,1,1,1,4,q1.11i. , ຕາມດ້ວຍການຫັນປ່ຽນທີ່ແຕກຕ່າງກັນເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມເປັນສ່ວນຕົວໃນການປ່ຽນແປງຂອງ Sucunage-clamped ໂດຍການຫັນປ່ຽນຄັ້ງທີສອງ ຄວາມລຶກລັບຂອງສັນຍານ fluorescent ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການປະສານງານຂອງ SPEPTIONSTICATION ຂອງ D171 ແລະໄກ່ເກ່ຍການສໍາປະທານລະຫວ່າງສະຖານທີ່ຜູກມັດ GBTA. Fujiwara et al25 ສະເຫນີວ່າການໂຕ້ຕອບ Dimer ຂອງໂດເມນ cytoplasmic ຂະຫຍາຍເຂົ້າໄປໃນເຍື່ອຫຸ້ມສະຫມອງອັກເສບ cyplasmic (FIG .A ການວິເຄາະຂອງ S4 ທັງຫມົດທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ S4 Helix ແລະ CCD. ບໍ່ມີການປ່ຽນແປງຂອງ membrane, ແລະ CCONSINE CrossLinking ເກີດຂື້ນພາຍໃຕ້ສະພາບການທີ່ຈະປິດສ່ວນໃຫຍ່. ສະນັ້ນ, ການໂຕ້ຕອບ S4 ທີ່ຖືກກວດພົບວ່າອາດຈະສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນການເຊື່ອມໂຍງຂອງ S1 ແລະ S2 ໃນ Gating1,21,26 ສະຖານະການປິດ, ຄວາມຄິດທີ່ສອດຄ່ອງກັບການຄົ້ນພົບຂອງ Mony et al. S1 ຍ້າຍ 39 ໃນລະຫວ່າງກິລາ. ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ, ໃນລັດທີ່ເປີດ, ສິ້ນສຸດຂອງ S1 Helix ແມ່ນສະຫນັບສະຫນູນການເຊື່ອມໂຍງກັບ SUMS-S4 ໂດຍກົງ, S1 Helices ໄກເກີນໄປ ນອກຈາກເຊິ່ງກັນແລະກັນເພື່ອພົວພັນໂດຍກົງ. ດ້ວຍການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາ (ຮູບ 7 ຂ. ກະດານຂວາມື). ພວກເຮົາແນະນໍາການຕັ້ງຄ່ານີ້ສໍາລັບຊ່ອງທາງໃນລັດ Open. ເຖິງແມ່ນວ່າການເຮັດວຽກທີ່ມີຄວາມຫມາຍເປັນ manomer, ການຕັ້ງຄ່າທາງເທີງຂອງ S1 ແມ່ນໃກ້ຄຽງກັນຢ່າງໃກ້ຊິດ, ແລະການຕັ້ງຄ່າໂດຍລວມແມ່ນຄ້າຍຄືກັບທີ່ສະເຫນີ ສໍາລັບ HV1 (ຮູບ 7c). ແລະ Dimers CivSP ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ vsds ຂອງທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ມີແນວໂນ້ມທີ່ມີຄວາມຄືບຫນ້າໃນການໂຕ້ຕອບທີ່ສຸດທີ່ S1 ຂອງ S1 ພົວພັນກັນ. ບົດບາດທີ່ສໍາຄັນຂອງ HV1 ໃນການເປີດໃຊ້ງານເຊື້ອອະສຸຈິເຮັດໃຫ້ຊ່ອງທາງຂອງ HV1 ໃນ Microglia ໄດ້ຖືກນໍາມາພົບວ່າມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງ ການຢູ່ລອດໃນຄົນເຈັບທີ່ມີເຕົ້ານົມ 12 ຫຼືໂຣກມະເຮັງລໍາໄສ້ໃຫຍ່ທີ່ສາມາດນໍາໃຊ້ເປັນຜູ້ປົກຄອງ B-moleceptics. ເປີດ Subunit Apen, ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມເປັນນິດອຸດຫນູນ, ອາດຈະເຮັດໃຫ້ການພັດທະນາຢາທີ່ມີສັກສິດກວ່າການກໍານົດເປົ້າຫມາຍ HV1. PRIGESTENSION MUSTAGENSIS ຂອງມະນຸດ HV1 ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ເຕັກນິກ PCR ມາດຕະຖານ. c-terminus ຂອງ subunit ຫນຶ່ງແມ່ນເຊື່ອມຕໍ່ກັບ N-Terminus ຂອງ submgsggsggsggsggsggsgsggsgg linksgsggsggsggsg. T7 MMESSAGE MMASSAGE MMASTERION KITIFTRAIL .1-3 ມື້ກ່ອນການວັດແທກໄຟຟ້າ, CRNA / μL / iL). ຈາກການສັກຢາ ecockyte biolyte .following rna ການສັກຢາ rigating, cull nacl, ຂະຫນາດ 1 ມມ, ຂະຫນາດ 1 ມມ, 1 mm kccol, utti / ml gentamicin, pH 7.2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazole [1], 2-guanidino-€zoliazole [2,3-tuanhothiazole [1,3-yl) (5-bromo-4 -mothyl-1,3 -Thiazol-2-yl) Guanidine) guanidine) [6], ethyl 2-methyl-5-muzyl-methyl-1.3-thiahyl-achtobyl-1,3-toblylino -1-,3-tanbylin-1.3-danuallino-4- methyl-1,3-tiaz-tizyl-1,3-tiazole- 5-bobbylate [9] ແລະ (2-methyl-methyl-1,3-ylayl-5-yl) ແມ່ນມາຈາກ Sigma-aDrich.famotidine [7] ແມ່ນມາຈາກ Biomedicals MP .- [4 - (4-chlorophenyl) -1,3-tiaz-yl] guanidine [11] ແລະ 1-,3- ຈາກ Matrix ວິທະຍາສາດວິທະຍາສາດ. ຢ່າງຫນ້ອຍ 99%. ການໂຈະການໂຈະອາຍຸ 2 ປີ -RO-4- (TRIFLUOROORMETHYL) ໄດ້ຖືກ refluxed ດ້ວຍການປະດັບປະດາຢ່າງແຂງແຮງເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ. 65 ° C) ເປັນເວລາຫລາຍຊົ່ວໂມງ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ recrystallized ຈາກ indrol ecetate / Petroleum ether ເພື່ອໃຫ້ເປັນສີຂາວ (500 ມລກ, 48%); MP 221-222 ° C (ແສງສະຫວ່າງ 225-226 ° C) 4522; 1h nmr (500 MHz, DMSO-D6): , 1 h, j = 8.1) .13c (200 mhz, D6) = 272 HZ), 126.1 (q, j = 272) = 31.6, 155.4, 155.4, 158.4, 158.4, 158.4, 158.4. : 261.0419. Naphtho [1,2-D] Thiazol-2-ingine (300 ມມ, 1.5 mmol) 1.0 ml conc.to ການປະສົມຮ້ອນໄດ້ຖືກເພີ່ມອາຊິດ hydrochloric ໄດ້ຖືກເກັບໄວ້ຢ່າງໄວວາແລະໃນເວລາທີ່ສ່ວນໃຫຍ່ຂອງການປະສົມນ້ໍາໄດ້ເຢັນລົງກັບອຸນຫະພູມໃນຫ້ອງແລະຜົນໄດ້ຮັບ ໄດ້ຖືກແຍກອອກເປັນຊິ້ນສ່ວນນ້ອຍໆແລະລ້າງດ້ວຍນ້ໍາເພື່ອສະຫນອງຄວາມແຂງແກ່ນສີເຫຼືອງຈືດໆ. (38 ມລກ, ຂະຫນາດ 38 ມລກ, 10%) MP 246-250 ° C; 1h nmr (500 mhz, DMSO-D6, D2O): D2M] = =2 h), j = hz, 1 h, j = hz) ,,77), 1 h, 1 h, 1 h , j = 8.6 hz), 7.89 (D, 1 h, j = hz) ,,35), 1 h, 1 h, j = hz) .13c nmr (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122.7, 123.5, 128.7, 128.7, 128.7, 128.7, 128.7, 168.7. , ພົບ: 243.0704. ໂປແກຼມ Proton Contrents ໄດ້ຖືກວັດແທກຢູ່ໃນບ່ອນທີ່ມີການກໍ່ສ້າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນໂດຍໃຊ້ໂປແກຼມ PcLamp 2-letcirllular. ) ອາຊິດ Ethanesulfonic pH 6.0 ກັບການວັດແທກນ້ໍາຊາ hydroxide.all ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ອຸປະກອນທີ່ມີຄວາມຕ້ານທານ 1.5-4 °.current ) ແລະຕົ້ນກໍາເນີດ .1 (ຕົ້ນກໍາເນີດ). ວິທີແກ້ໄຂບັນຈຸຂໍ້ສະທ້ອນຕ່າງໆຂອງ Inhiboritor ແລະໃນບາງກໍລະນີໄດ້ຖືກນໍາເຂົ້າໄປໃນຫ້ອງນ້ໍາທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບລະບົບ VC-6 PRIVENCE LEGHIONTORE LONFS.RRRORD SERITIONS.RAPID ການທົດລອງທີ່ມີຄວາມຫມາຍນ້ໍາມັນສູນກາງ ການວັດແທກກໍາມະການທີ່ໄດ້ຮັບການບັນທຶກໄວ້ໃນກະແສໄຟຟ້າທີ່ແຕກຕ່າງກັນມາກ່ອນ .1.20 ໃຊ້ເພື່ອແກ້ໄຂສໍາລັບຊຸດດັບປະຈຸບັນ 18. GV Graph ກັບສົມຜົນພູ: ບ່ອນທີ່ [i] ແມ່ນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ inhibitor i ແລະ h ແມ່ນພູທີ່ມີຢູ່.