Badanie interfejsu międzypodjednostkowego otwartego kanału protonowego Hv1 za pomocą sondy sprzężonej allosterycznie

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić dalszego wsparcia, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript. Kanał protonowy bramkowany napięciem Hv1 jest kompleksem dimerycznym składającym się z dwóch domen wykrywających napięcie (VSD), z których każda zawiera bramkowaną ścieżkę przenikania protonów. Dimeryzacja jest kontrolowana przez domenę cewki cytoplazmatycznej. Przejście ze stanu zamkniętego do stanu zamkniętego wiadomo, że stan otwarty w obu VSD występuje wspólnie; jednak niewiele wiadomo na temat podstawowych mechanizmów. Interfejsy między podjednostkami odgrywają kluczową rolę w procesach allosterycznych; jednakże takich interfejsów nie zidentyfikowano w otwartych kanałach Hv1. Tutaj pokazujemy, że pochodne 2-guanidynotiazolu blokują dwa VSD Hv1 w sposób kooperatywny i wykorzystują jeden z tych związków jako sondę do allosterycznego sprzężenia pomiędzy otwartymi podjednostkami. Odkryliśmy, że zewnątrzkomórkowy koniec pierwszego transbłonowego fragmentu VSD tworzy interfejs międzypodjednostkowy, który pośredniczy w sprzęganiu między miejscami wiązania, podczas gdy domena zwiniętej cewki nie jest bezpośrednio zaangażowana w ten proces. Znaleźliśmy również mocne dowody na to, że filtr selektywny wobec protonów kanału kontroluje współpracę wiązania blokera . Kanały protonowe bramkowane napięciem odgrywają ważną rolę w różnych organizmach, od fitoplanktonu po ludzi.1. W większości komórek kanały te pośredniczą w wypływie protonów z błony protonowej i regulują aktywność oksydazy NADPH. Jedyny znany kanał protonowy bramkowany napięciem u ludzi to Hv1, który jest produktem genu HVCN12,3. Wykazano, że Hv1 (inaczej VSOP) odgrywa rolę w proliferacji komórek B4, wytwarzaniu reaktywnych form tlenu przez wrodzony układ odpornościowy5,6,7,8, plemnik regulacja motoryki9 i pH płynu powierzchniowego dróg oddechowych10. Kanał ten uczestniczy w kilku typach nowotworów, które ulegają nadekspresji w przypadku nowotworów z komórek B4,11 oraz raka piersi i jelita grubego12,13. Stwierdzono, że nadmierna aktywność Hv1 zwiększa potencjał przerzutowy komórek nowotworowych 11, 12. W mózgu Hv1 ulega ekspresji przez mikroglej i wykazano, że jego działanie nasila uszkodzenie mózgu w modelach udaru niedokrwiennego. Białko Hv1 zawiera domenę wyczuwającą napięcie (VSD), która składa się z czterech segmentów transbłonowych zwanych S1 do S414. VSD przypomina odpowiednie domeny bramkowanych napięciem kanałów Na+, K+ i Ca2+ oraz fosfataz wrażliwych na napięcie, takich jak CiVSP z firmy Ciona gutis15. W tych innych białkach koniec C S4 jest przyłączony do modułu efektorowego, domeny porów lub enzymu. W Hv1, S4 jest połączone z domeną cewki (CCD) zlokalizowaną po cytoplazmatycznej stronie błony .Kanał jest dimerycznym kompleksem składającym się z dwóch VSD, z których każdy zawiera bramkowaną ścieżkę przenikania protonów16,17,18. Stwierdzono, że te dwie podjednostki Hv1 otwierają się wspólnie19,20,21,22, co sugeruje, że odgrywają tu rolę sprzężenia allosterycznego i interakcje między podjednostkami ważną rolę w procesie bramkowania. Interfejs między podjednostkami w domenie cewki zwiniętej jest dobrze zdefiniowany, ponieważ dostępne są struktury krystaliczne dwóch izolowanych domen22,23. Z drugiej strony interfejs między VSD w membranie nie jest dobrze poznane. Struktura krystaliczna chimerycznego białka Hv1-CiVSP nie dostarcza informacji o tej powierzchni styku, ponieważ trimeryczna organizacja skrystalizowanego kompleksu kanałów może wynikać z zastąpienia natywnego CCD Hv1 przez drożdżowy zamek leucynowy GCN424. Niedawne badania organizacji podjednostek kanału Hv1 wykazały, że dwie helisy S4 przechodzą do CCD bez poważnego zakłócenia struktury drugorzędowej, co skutkuje długimi helisami, które zaczynają się od błony i wystają do cytoplazmy. Na podstawie analizy sieciowania cysteiny, w tym badaniu zaproponowano, że napędy VSD Hv1 stykają się ze sobą wzdłuż segmentu S4. Jednakże w innych badaniach zaproponowano alternatywne interfejsy między napędami VSD. Interfejsy te obejmują segmenty S1 17, 21, 26 i zewnętrzne końce segmentu S2 21. Możliwa przyczyna konfliktu Wyniki tych badań wskazują, że allosteryczne sprzężenie między VSD zostało zbadane w odniesieniu do procesu bramkowania, który zależy od stanu zamkniętego i otwartego, a interfejs między VSD może zmieniać się w zależności od zmian stanu w konformacji. Tutaj odkryliśmy, że 2-guanidynotiazol hamuje kanały Hv1 poprzez synergistyczne wiązanie z dwoma otwartymi VSD i wykorzystaliśmy jeden ze związków, 2-guanidynobenzotiazol (GBTA), do zbadania interakcji między podjednostkami w stanie otwartym. Odkryliśmy, że krzywą wiązania GBTA można dobrze opisać za pomocą modelu ilościowego, w którym wiązanie inhibitora z jedną podjednostką powoduje wzrost powinowactwa wiązania sąsiedniej podjednostki. Stwierdziliśmy również, że reszty D112, filtry selektywności dla kanały 27, 28 i część miejsca wiązania 29 pochodnej guanidyny kontrolują kooperatywność wiązania GBTA. Pokazujemy, że kooperatywne wiązanie jest utrzymywane w dimerze Hv1, gdzie CCD oddziela się od segmentu S4, co sugeruje, że interfejs między podjednostkami w CCD nie działa bezpośrednio pośredniczą w sprzężeniu allosterycznym pomiędzy miejscami wiązania GBTA. Natomiast odkrywamy, że fragment S1 jest częścią interfejsu między podjednostkami i proponujemy ułożenie sąsiednich VSD z zewnątrzkomórkowym końcem helisy S4 oddalonym od środka dimeru, aby umożliwić fragment S1 jest w stanie otwartym. Małocząsteczkowe inhibitory Hv1 są przydatne jako leki przeciwnowotworowe i środki neuroprotekcyjne. Jednakże jak dotąd niewiele związków było w stanie hamować ten kanał30,31,32,33. Wśród nich 2-guanidynobenzimidazol (2GBI, związek [1] na ryc. . 1a) i jego pochodne blokują przenikanie protonów VSD29,32 przez kanał. Uważa się, że wiązanie takich związków zachodzi niezależnie w dwóch otwartych podjednostkach. 2-guanidynobenzotiazol (GBTA, związek [2] na ryc. 1a) wcześniej wykazano, że hamuje Hv1 prawie tak skutecznie jak 2GBI, gdy testowano w stężeniu 200 μM (ryc. 1b). Zbadaliśmy inne pochodne tiazolu i odkryliśmy, że niektóre z nich hamowały kanał z podobną lub większą siłą niż GBTA (ryc. 1 i uzupełnienie tekst). Wyznaczyliśmy krzywe odpowiedzi na stężenie czterech pochodnych tiazolu (GBTA i związków [3], [6] i [11], ryc. 1c) i stwierdziliśmy, że są one bardziej strome niż 2GBI. Współczynniki Hilla (h) pochodnych tiazolu wahała się od 1,109 ± 0,040 do 1,306 ± 0,033 (ryc. 1c i ryc. uzupełniająca 1). Natomiast współczynnik Hilla dla 2GBI wyniósł 0,975 ± 0,024 29, ryc. 2a i ryc. uzupełniający 1). Współczynnik Hilla powyżej 1 wskazuje na wiążącą kooperatywność. Ponieważ każda podjednostka Hv1 ma swój własny inhibitor miejscu wiązania29,32 doszliśmy do wniosku, że wiązanie pochodnej tiazolu z jedną podjednostką może zwiększyć wiązanie cząsteczki drugiego inhibitora z sąsiednią podjednostką. GBTA było badanym związkiem o najwyższym współczynniku Hilla. Dlatego wybraliśmy ten związek do dalej badali mechanizm synergii wiązania i wykorzystali 2GBI jako referencyjną kontrolę negatywną. (a) Badane związki: [1] Referencyjny inhibitor Hv1 2-guanidyno-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidyno-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometylo-1,3-benzotiazol-2-ilo)guanidyna, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidyna, [5](4-metylo-1,3-tiazol-2-ilo)guanidyna, [6](5-bromo-4-metylo-1,3-tiazol-2-ilo)guanidyna, [7] famotydyna, [8] ester etylowy kwasu 2-guanidyno-5-metylo-1,3-tiazolo-4-karboksylowego, [9] 1,3-tiazolo-5-karboksylan 2-guanidyno-4-metylu, [10 octan ](2-guanidyno-4-metylo-1,3-tiazol-5-ilo)etylu, [11]1-[4-(4-Chlorofenylo)-1,3-tiazol-2-ilo]guanidyna, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksyfenylo)-1,3-tiazol-2-ilo]guanidyna.(b) Hamowanie aktywności ludzkiego wirusa Hv1 przez wskazane guanidynotiazole i związek referencyjny 2GBI (niebiesko-zielone słupki) Prądy protonowe .Hv1 mierzono w łysinkach oocytów Xenopus w odpowiedzi na depolaryzację od potencjału trzymania od -80 mV do +120 mV. Każdy inhibitor dodawano do kąpieli w stężeniu 200 µM.pHi = pHo = 6,0 .Dane są średnią ±SEM (n≥4).(c) Zależne od stężenia hamowanie ludzkiego Hv1 przez związki [2], [3], [6] i [11]. Każdy punkt reprezentuje średnie hamowanie ± SD 3 do 15 pomiarów. Linia jest dopasowaniem Hilla zastosowanym do uzyskania pozornych wartości Kd podanych w tabeli uzupełniającej 1. Współczynniki Hilla zostały określone na podstawie dopasowań przedstawionych na ryc. uzupełniającym 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (patrz Metody). (a, b) Związki 2GBI i GBTA hamowały dimeryczny i monomeryczny Hv1 w sposób zależny od stężenia. Każdy punkt reprezentuje średnie hamowanie ± SD z 3 do 8 pomiarów, a krzywa jest dopasowana do Hilla. Współczynniki Hilla (h) pokazane w wstawiane histogramy określono na podstawie napadów przedstawionych na dodatkowych rysunkach 3 i 4. Odpowiedź na stężenie GBTA pokazana na (a) jest taka sama jak na ryc. 1c. Patrz tabela uzupełniająca 1 dla pozornych wartości Kd. (c) Modelowanie wspólne wiązanie GBTA z dimerem Hv1. Czarna linia ciągła przedstawia dopasowanie do danych eksperymentalnych za pomocą równania (6), które opisuje model wiązania pokazany w (d). Linie przerywane oznaczone Sub 1 i Sub 2 przedstawiają asocjację bimolekularną - krzywe równowagi dysocjacji odpowiednio pierwszego i drugiego zdarzenia wiązania (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 µM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 µM ).(d) Schematyczny diagram proponowanego mechanizmu bloku Hv1. W przypadku GBTA związanie z jedną otwartą podjednostką zwiększa powinowactwo sąsiedniej otwartej podjednostki (Kd2 0, 05) spadek współczynnika Hilla wiązania GBTA z kanałami GGG w porównaniu z typem dzikim (ryc. 5c), co sugeruje, że pomimo jego roli w utrzymywaniu dwie podjednostki razem ważne, ale CCD nie pośredniczy bezpośrednio w allosterycznym sprzężeniu międzypodjednostkowym pomiędzy miejscami wiązania GBTA. ( a ) Schematyczny diagram dimeru Hv1 z mutacją triglicyny na wewnętrznym końcu S4, zaprojektowany w celu przerwania sprzęgania między podjednostkami, w którym pośredniczy cytoplazmatyczna domena typu „coiled-coil” (niebieskie strzałki). (b) Schematyczne przedstawienie dimerów Hv1 i dimerów ligacyjnych z wskazane mutacje, zaprojektowane do testowania fragmentów S1 zaangażowanych w sprzęganie między podjednostkami (niebieskie strzałki). (c – h) 2GBI (cyjan) i GBTA (ciemnoczerwony) hamują wskazane konstrukty w sposób zależny od stężenia. Każdy punkt reprezentuje średnie hamowanie ± SD od 3 do 10 pomiarów. Krzywa była dopasowaniem Hilla zastosowanym do uzyskania pozornych wartości Kd (patrz tabela dodatkowa 1). Współczynniki Hilla na interpolowanych histogramach określono w sposób opisany w sekcji Metody (patrz dodatkowe rysunki 3 i 4). Wartości referencyjne h dla Hv1 WT pokazano liniami przerywanymi. Gwiazdki wskazują statystycznie istotne różnice pomiędzy pasażami mutantów i WT (p 0, 05, ryc. 5d, i) ). Z drugiej strony mutacja D123A znacząco zmniejszyła współczynnik Hilla GBTA (p 0,05/14). Ponieważ neutralizacja ładunku w pozycji 123 na obu podjednostkach spowodowała silną zmianę we współpracy wiązania GBTA, podczas gdy odwrócenie ładunku na obu podjednostkach miało jedynie niewielki wpływ, rozszerzyliśmy analizę tak, aby obejmowała tylko jedną podjednostkę z inwersyjnym kanałem ładunku. wygenerowali dimery połączone z Hv1 z podstawieniem D123R w podjednostce C-końcowej (ryc. 5b) i zmierzyli hamowanie reakcji na stężenie przez GBTA i 2GBI. Stwierdziliśmy, że współczynnik Hilla wiązania GBTA z kanałami WT-D123R był znacznie wyższy niż współczynnik Hv1 typu dzikiego (p 0,05). Odkryliśmy również, że przy braku βME współczynnik Hilla wiązania GBTA z dimerem D112E I127C Hv1 był znacznie wyższy niż zmierzony w obecności środków redukujących (ryc. 6e i ryc. Uzupełniająca 4), co sugeruje, że mutacja D112E nie zniósł wzrostu kooperatywności wiązania GBTA wynikającego z sieciowania cysteiny 127. Na współczynnik Hilla wiązania 2GBI z dimerami D112E, I127C Hv1 również nie wpłynęła znacząco mutacja D112E (ryc. 1).6d i uzupełnienie Ryc. 3). Podsumowując, odkrycia te sugerują, że wiązanie GBTA jest wzmocnione przez interakcję między zewnętrznymi końcami fragmentów S1 w sąsiednich podjednostkach Hv1 poprzez atrakcyjne oddziaływania elektrostatyczne lub poprzez tworzenie wiązań kowalencyjnych między podstawionymi cysteinami. Sprzężenie allosteryczne między miejscami wzrasta i skutkuje kooperatywnością wiązania. O ile wpływ atrakcyjnych oddziaływań elektrostatycznych na kooperatywność można znieść przez mutację D112E, o tyle wpływu wiązań kowalencyjnych nie. Podczas naszej eksploracji przestrzeni chemicznej dostępnej do wiązania pochodnych guanidyny z kanałami Hv1 odkryliśmy, że 2-guanidynotiazole, takie jak GBTA, mają bardziej stromą zależność od stężenia niż 2-guanidynobenzimidazole (ryc. 1c). Analiza współczynnika Hilla wiązania GBTA z obydwoma dimerami i kanały monomeryczne (ryc. 2a, b) oraz do kanału dimerycznego, w którym jedna podjednostka była wstępnie związana z inhibitorem (ryc. 4) doprowadziły nas do wniosku, że hamowanie Hv1 przez GBTA. Działanie jest procesem synergistycznym i miejsca wiązania związków w dwóch podjednostkach są sprzężone allosterycznie. Odkrycie, że GBTA wiąże się z kanałem otwartym, jak pokazano wcześniej dla pokrewnego związku 2GBI32, sugeruje, że sprzężenie allosteryczne można specyficznie ocenić w stanie otwartym. Nasz model wiązania kooperatywnego był w stanie ilościowo opisać hamowanie HV1 przez GBTA (ryc. 2C) i wyjaśnić różne skutki 2GBI i GBTA na rozkład prądów ogonowych kanału po repolaryzacji błony, który potwierdza naszą interpretację procesu wiązania. Maksymalny współczynnik wzgórza, który można osiągnąć w białku allosterycznym z dwoma miejscami wiązania (takimi jak HV1), wynosi 2. Zmierzyliśmy GBTA w celu wiązania typu dzikiego HV1 przy współczynniku 1,31, który wzrósł do 1,88 w HV1 I127C. Synergistyczna energia swobodna, różnica między wiązaniem wolnych energii najniższych i najwyższych miejsc powinowactwa (patrz metody), wynosiła 1,3 kcal/kret w przypadku typu dzikiego HV1 i 2,7 kcal/kret w przypadku HV1 I127C. tlenu do hemoglobiny jest najbardziej znanym i dobrze zbadanym przykładem procesu współpracy38. W przypadku ludzkiej hemoglobiny (tetramer z czterema allosterycznie sprzężonymi miejscami wiązania), współczynnik wzgórza waha się od 2,5-3,0, z wartościami od 1,26 do 3,64 KCAL/MOL, w zależności od warunków eksperymentalnych38.To, pod względem globalnej energetyki, kooperatywność wiązania GBTA z HV1 nie różni się zasadniczo od wiązania O2 z hemoglobiną, gdy rozważana jest różna liczba podjednostek białkowych w dwóch układach. W naszym modelu synergii wiązanie cząsteczek GBTA z jedną podjednostką powoduje wzrost powinowactwa wiązania sąsiedniej podjednostki. Przewidujemy proces, w którym prowadzi przegrupowanie środowiska wiązania wynikające z pierwszego zdarzenia wiązania (dopasowanie indukowane) Zmiany w interakcjach między podjednostkami. W odpowiedzi na te zmiany sąsiednie podjednostki zmieniają swoje miejsca wiązania, co powoduje ciaśniejsze wiązanie GBTA. Po tym proces S1 asparaginian D112 jest odpowiedzialny za zmianę miejsca wiązania związanego z zwiększonym powinowactwem wiązania.d112 Wcześniej wykazano, że jest częścią szlaku przenikania protonu HV1 i działa jako filtr selektywności 27,28. Nasze wyniki pokazują, że filtry selektywności w dwóch podjednostkach HV1 są allosterycznie sprzężone w stanie otwartym. Rysunek 7A pokazuje przybliżoną lokalizację wiązania GBTA i lokalizację reszt D112, D123, K125 i I127 na schematyce opartego na HV1 VSD Na strukturze krystalicznej chimery HV1-CIVSP. Sugerowane kierunki sprzężenia allosterycznego obejmujące zewnątrzkomórkowy koniec S1 pokazano z czarnymi strzałkami. (A) Schemat HV1 VSD. na podstawie struktury krystalicznej chimery HV1-CIVSP, segmenty spiralne są cylindryczne. W tej konfiguracji wewnętrzny koniec segmentu S4 łączy się z CCD (nie pokazano). Przewidywane lokalizacje związanego GBTA są pokazane jako szare jajowate. Blackie strzałki wskazują ścieżki zaangażowane w sprzężenie allosteryczne między miejscami wiązania w dwóch sąsiednich podjednostkach. Pozycje badanych resztów S1 są oznaczone kolorowymi sferami. (B) Schematyczna ilustracja HV1 ułożonych podjednostek HV1 ułożonych W dwóch różnych konfiguracjach dimerowych widocznych ze strony zewnątrzkomórkowej płaszczyzny membranowej. Na lewym panelu interfejs dimeru jest tworzony przez helisę S4. Oddzielenie zewnętrznych końców dwóch helis S4 (przerywane strzałki) wytwarza układ pokazany po prawej. W tej konfiguracji reszty D123 i I127 z sąsiednich podjednostek mogą zbliżyć się do siebie. (C) Schematyczne przedstawienie Civsp VSD W konfiguracji dimeru znalezionej w strukturze krystalicznej 4G80 Pozycja P140 w CivSP odpowiada pozycji D123 w HV1. Nasze wyniki pokazują, że odpychająca oddziaływanie elektrostatyczne między pozostałością 123 (123d/123d lub 123R/123R) jest powiązana z „normalnym” poziomem kooperatywności wiązania GBTA w stanie otwartym i przesuwa interakcję z odpychania do przyciągnięcia (123d/123R) , Zwiększona współpraca (ryc. 5G). Oczekuje się, że usunięcie odpychającej interakcji z podstawieniem alaniny doprowadzi również do zwiększonej kooperatywności. Jednak zaobserwowano spadek spółdzielni dimeru 123A/123A (ryc. 5E). Jeden możliwy. Wyjaśnienie polega na tym, że destabilizujący efekt umieszczania reszt hydrofobowych w środowisku hydrofilowym może przeważyć działanie stabilizujące ze względu na eliminację odpychających interakcji między resztami D123, co powoduje ogólne zmniejszenie kooperatywności wiązania. Mander i in. Pozycja D171 CIONA GUTIS CI-HV1 (odpowiadająca D123 w ludzkim HV1) jest zwiększona po aktywacji, co potwierdza pogląd, że D123 znajduje się w środowisku hydrofilowym w stanie otwartym. Wiadomo, że bramkowanie kanałów HV1 występuje w wielu przejściach 19,20,26,39,40,41.41.qiu i in. , a następnie wyraźne przejście, które powoduje, że protony otwierają przewodnictwo w obu podjednostkach. Zmiana konformacyjna czujnika napięcia monitorowano przez fluorescencję napięcia i stwierdzono, że drugie przejście zostało selektywnie zakłócone przez mutację w pozycji D171. Perturbacja sygnału fluorescencyjnego jest zgodna z obecnością interakcji elektrostatycznych między resztami D171 przyległych podjednostek w pewnym momencie wzdłuż współrzędnych reakcji zmiany konformacyjnej. Ta interpretacja jest zgodna z naszym odkryciem, że reszta D123 elektrostatycznie oddziałuje elektrostatycznie oddziałuje i pośredniczy w allosterycznym sprzężeniu między miejscami wiązania GBTA. Fujiwara i in. 25 zaproponowali, że interfejs dimeru domeny cytoplazmatycznej cewki rozciąga się na membranę, aby zawierać dwa helisy S4 (ryc. 7B, lewy panel). Cała analiza VSD i funkcjonalna regionu łącząca helisę S4 i CCD. W braku transbłonowego gradientu pH kanały HV1 wymagają znacznej depolaryzacji błony do otwartości, a sieciowanie cysteiny występuje w warunkach, w których kanał jest głównie zamknięty. Dlatego wykryty interfejs S4-S4 prawdopodobnie odzwierciedla konfigurację podjednostki poza stanem. Inne badania znalazły dowody na zaangażowanie S1 i S2 w interakcjach intersubunit podczas bramkowania 17,21,26, co sugeruje, że kanały mogą przyjąć różne konfiguracje podjednostki w otwartej i otwartej i Zamknięte stany, pomysł zgodny z ustaleniami Mony i in. S1 porusza się 39 podczas bramkowania. Tutaj pokazujemy, że w stanie otwartym końce pozakomórkowe helisy S1 są wystarczająco blisko, aby obsługiwać bezpośrednie interakcje elektrostatyczne, które pośredniczą w połączeniu allosterycznym między podjednostkami. W konfiguracji dimeru z rozszerzonymi interakcjami S4-S4 heuls S1 są zbyt daleko oprócz siebie, aby oddziaływać bezpośrednio. Jednak obrót o 20 ° zgodnie z ruchem wskazówek zegara dwóch podjednostek VSD wokół osi prostopadłowej do płaszczyzny membranowej, w połączeniu z oddzieleniem zewnętrznych końców dwóch helis S4, dał spójność konfiguracji S1-S1 Z naszymi ustaleniami (ryc. 7B, prawy panel). Polecamy tę konfigurację dla kanału w stanie otwartym. Chociaż uważa się, że enzym CivSP działa jako monomer, struktura krystaliczna jego izolowanego VSD jest przechwytywana w stanie dimeru. Zewnętrzne końce helis S1 w tym dimerie są przestrzennie blisko siebie, a ogólna konfiguracja jest podobna do tej proponowanej W przypadku HV1 (ryc. 7C). W dimerie CivSP najbliższa reszta z sąsiedniej podjednostki była proline w pozycji 140 (ryc. 7C). Przeciwnie, P140 w CivSP odpowiada pozycji D123 w HV1. Podobieństwo w konfiguracji podjednostki między HV1 a dimery CivSP sugerują, że VSD z tych białek mają wewnętrzną tendencję do tworzenia interfejsu, w którym oddziałują zewnątrzkomórkowe końce S1. Zasadnicza rola HV1 w aktywacji komórek nasienia sprawia, że ​​ten kanał jest atrakcyjnym celem leku dla kontroli płodności męskiej. Furthermore, wykazano, że aktywacja HV1 w mikrogleju pogarsza odzyskiwanie po udarze niedokrwiennym. Stwierdzono, że aktywność HV1 wzmacniana jest powiązana z niższą Przeżycie u pacjentów z piersi 12 lub rakiem jelita grubego 13 i uważa się, że przyczynia się do nowotworów B-komórki B 11. Dlatego leki o małych cząsteczkach ukierunkowanych na HV1 mogą być stosowane jako środki neuroprotekcyjne lub terapeutyki przeciwnowotworowe. Odkrycie, że pochodne guanidynotiazolu mogą wywoływać zmianą konformacyjne w ograniczeniach konformacyjnych w zakresie konformacyjnych Otwarta podjednostka HV1, prowadząc do zwiększonego powinowactwa wiązania, może prowadzić do rozwoju silniejszych leków ukierunkowanych na kanały HV1. Mutagenezę ludzkiego HV1 wytworzonego przez miejsce przeprowadzono przy użyciu standardowych technik PCR. W konstruktu HV1NCCIVSP pozostałości 1-96 i 228-273 HV1 zastąpiono resztami 1-113 i 240-576 CivSP18. W Dimeru uszczelnionym Hv1, podwodnym HV1, C-koniec jednej podjednostki jest powiązany z N-koniec drugiej podjednostki przez łącznik GGSGSGSGSGSGSGSGGSG. T7 mmessage Zestaw transkrypcji mmachiny (Ambion). 1-3 dni przed pomiarami elektrofizjologicznymi, CRNA wstrzyknięto do oocytów Xenopus (Otrzymano 50 nl na komórkę, 0,3-1,5 μg/μl). STAGA V i VI Oocyty z Xenopus laevis (NASCO) Od bioscie EcoocyT. Following RNA iniekcja, komórki utrzymywano w pożywce ND96 zawierającej 96 mM NaCl, 2 mM Kcl, 1,8 mM CACL, 1 mM MgCl, 10 mM HEPE, 5 mM pirogronianu, 100 μg/ml gentamycyny, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzotiazol [2], (4-metylo-1,3-tiazol-2-ylo) guanidyna [5], (5-bromo-4-metylo-1,3,3 -tiazol-2-ylo) guanidyna) [6], etylo 2-guanidino-5-metylo-1,3-tiazol-4-karboksylan [8], etylo 2-guanidino-4-metylo-1,3-tiazol-- 5-karboksylan [9] i (2-guanidino-4-metylo-1,3-tiazol-5-ylo) octan etylu [10] pochodziły z sigma-aldrich.famotydyny [7] pochodziło z MP Biomedical. 1- [4 -(4-chlorofenylo) -1,3-tiazol-2-ylo] guanidyna [11] i 1- [4- (3,4-dimetoksyfenylo) -1,3-tiazol-2-ylo] guanidyna [12] BES z Matrix Scientific. Te związki mają najwyższą dostępną czystość w handlu. Rozpuszczono je w suchym DMSO, aby wygenerować roztwór podstawowy 100 mm, który następnie rozcieńczono w roztworze rejestrującym w pożądanym stężeniu końcowym Compunds 3 i 4 co najmniej 99% czystości. Do zawiesiny 2-amino-4- (trifluorometylo) benzetetyolowego chlorowodorku (1,02 g, 4,5 mmol) w 25 ml wodnego hydrochlorowego (2,5 N) dodano stałe dicyandiamid (380 mg, 4,5 mmol) refluksowano z energicznym mieszaniem przez 4 godziny. Mieszanina reakcyjna ochłodzono do temperatury pokojowej i zneutralizowano przez stopniowe dodawanie 10n wodorotlenku potasu. Utworzony biały osad został przefiltrowany, przemyto zimną wodą (3 x 50 ml), suszono w piecu ( 65 ° C) przez kilka godzin, a następnie rekrystalizowano z octanu etylu/eteru naftowego, aby uzyskać białą substancję stałą (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (światło 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7,25 (bardzo szerokie S, 4 H), 7,40 (D, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (S, 1 H), 7,92 (D. , 1 H, J = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (Q, J, J, J, J, J, J, J, J = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5. HRMS (ESI): M/z obliczona wartość. Dla C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, znalezione : 261.0419. Nafto [1,2-D] tiazol-2-aminę (300 mg, 1,5 mmol), zsyntetyzowane jak opisano wcześniej, ogrzewano do 200 ° C w kąpieli olejowej w małej rurce testowej. 300 mg (duży nadmiar) cyjanamid i cyjanamid i 1,0 ml conc. do gorącego związku szybko dodano kwas chlorowodorowy i mieszaninę trzymano w kąpieli olejowej przez około 2 minuty, w którym to czasie większość wody odparowano. Następnie mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i powstałym zestalonym materiałem podzielono na małe kawałki i przemyto wodą, aby zapewnić jasnożółtą amorficzną substancję stałą (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (T, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (T, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (D, 1 H. , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.hrms (esi): m/z obliczona wartość. , Znaleziono: 243.0704. Prądy protonowe mierzono w wewnętrznych i zewnętrznych plamach oocytów wyrażających różne konstrukty przy użyciu wzmacniacza Axopatch 200b kontrolowanego przez akson digidata 1440a (urządzenia molekularne) za pomocą oprogramowania PCLAMP10. Roztworów międzykomórkowych i zewnątrzkomórkowych roztworów ma ten sam skład: 100 mm 2- (n-morfolino) ) Kwas etanosulfonowy (MES), 30 mM mesylan tetraetyloamoniowy (herbata), chlorek herbaty 5 mM, 5 mM glikolu etylenowego (2-aminoetylo) -N, N, N ', N'-tetraoctowy kwas (EGTA), dostosowany do pH 6,0 z wodorotlenkiem herbaty. Wszystkie pomiary przeprowadzono przy 22 ± 2 ° C. Pipeta ma rezystancję dostępu 1,5–4 MΩ. Ścieżki prądu filtrowano przy 1 kHz, próbkowano przy 5 kHz i analizowano za pomocą zacisku 10.2 (urządzenia molekularne (urządzenia molekularne (urządzenia molekularne (urządzenia molekularne (urządzenia molekularne ) i Origin8.1 (OriginLab). Roztwory zawierające różne stężenia inhibitora HV1, aw niektórych przypadkach 10 mM βME wprowadzono do kąpieli przez grawitację poprzez kolektor podłączony do systemu zaworu perfuzyjnego VC-6 (Warner Instr.), Który został przekazany przez oprogramowanie PCLAMP TTL (tranzystor-- Logika tranzystorowa) Sygnały. Rapidowe eksperymenty perfuzji przeprowadzono przy użyciu ołówka perfuzyjnego z wieloma rurkami (automatyzacja SCI.) Z końcówką dostarczania o średnicy 360 μm zamontowaną przed pipetą łatki. Zahamowanie komunikacji określono za pomocą izochronalnych pomiarów amperometrycznych na końcu Pomiary depolaryzujące +120 mV Pomiary GV przeprowadzono jak opisano wcześniej 18,20. Prądy kosztowe zarejestrowano przy -40 mV po etapach depolaryzacji przy różnych napięciach od -20 mV do +120 mV, chyba że podano inaczej. Puls referencyjny poprzedzający impuls testowy wynosi Służy do skorygowania do rozkładu prądu 18. Wykres GV pasuje do równania Boltzmanna: pozorne stałe dysocjacji (KD) dla różnych kombinacji kanałów i inhibitorów (Tabela uzupełniająca 1) określono poprzez dopasowanie zależności stężenia hamowania (średnie % %hamowania) Z równaniem wzgórza: gdzie [i] jest stężeniem inhibitora I i H jest współczynnikiem wzgórza. Aby obliczyć współczynnik wzgórza, równanie (2) jest przełożone jako: