د خلاص Hv1 پروټون چینل د انټرسوبونیټ انٹرفیس تفتیش د الوسټریکي جوړه شوي تحقیقات سره

د Nature.com د لیدلو لپاره مننه. د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ د CSS لپاره محدود ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت بند کړئ) په ورته وخت کې، ډاډ ترلاسه کړئ دوامداره ملاتړ، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کړو. د Hv1 ولټاژ ګیټډ پروټون چینل یو ډیمیریک کمپلیکس دی چې د دوه ولټاژ سینس کولو ډومینونو (VSDs) څخه جوړ دی ، چې هر یو یې د ګیټډ پروټون پرمیشن لاره لري. ډیمیرائزیشن د سایټوپلاسمیک کویل شوي کویل ډومین لخوا کنټرول کیږي. له تړل شوي حالت څخه لیږد. په دواړو VSDs کې خلاص حالت په همکارۍ پیژندل کیږي. په هرصورت، د اصلي میکانیزمونو په اړه لږ څه پیژندل شوي دي. په هرصورت، دا ډول انٹرفیسونه په خلاص Hv1 چینلونو کې ندي پیژندل شوي. دلته موږ وښایه چې د 2-guanidinothiazole مشتق دوه Hv1 VSDs په کوپراتیف ډول بندوي او د دې مرکباتو څخه یو یې د خلاص فرعي واحدونو ترمینځ د الوسټریک ترکیب لپاره د تحقیقاتو په توګه کاروي. موږ وموندله چې خارجي حجرې د VSD د لومړۍ ټرانس میمبرین برخې پای د انټرسوبونیټ انٹرفیس رامینځته کوي چې د پابند سایټونو ترمینځ د جوړیدو منځګړیتوب کوي ، پداسې حال کې چې د کویل شوي کویل ډومین په مستقیم ډول پدې پروسه کې دخیل ندي. موږ دا هم قوي شواهد موندلي چې د چینل پروټون انتخابي فلټر د بلاکر پابند همکارۍ کنټرولوي. . د ولتاژ ګیټ پروټون چینلونه د فایټوپلانکټون څخه تر انسانانو پورې په مختلفو ژوندی موجوداتو کې مهم رول لوبوي. په ډیری حجرو کې، دا چینلونه د پروټون غشا څخه د پروټون جریان منځګړیتوب کوي او د NADPH اکسیډیز فعالیت تنظیموي. په انسانانو کې یوازینی پیژندل شوی ولتاژ ګیډ پروټون چینل دی. Hv1 دی، کوم چې د HVCN1 جین 2,3 محصول دی. Hv1 (عرف VSOP) د B حجرو په خپریدو کې رول لوبوي 4، د طبیعي معافیت سیسټم لخوا د عکس العمل اکسیجن ډولونو تولید 5,6,7,8، سپرم حجرې حرکت9 او د هوا د سطحې د مایعاتو pH مقررات 10. دا چینل د سرطان په ډیری ډولونو کې دخیل دی لکه د B-cell malignancies4,11 او د سینې او کولوریکټال سرطانونو 12,13. د Hv1 ډیر فعالیت وموندل شو چې د سرطان حجرو 11, 12 میټاسټاټیک ظرفیت زیاتوي. په مغز کې Hv1 څرګندیږي. د مایکروګلیا لخوا، او د هغې فعالیت د اسکیمیک سټروک ماډلونو کې د دماغ زیان ډیرولو لپاره ښودل شوی. Hv1 پروټین د ولتاژ احساس کولو ډومین (VSD) لري، کوم چې د S1 څخه S414 په نوم څلور ټرانس میمبرین برخې لري. VSD د ولتاژ ګیټیډ Na+، K+ او Ca2+ چینلونو اړونده ډومینونو سره ورته دی او د ولټاژ حساس فاسفټیسس لکه CiVSP څخه. Ciona gutis15. په دې نورو پروټینونو کې، د S4 C-terminus د تاثیر کونکي ماډل، pore domain یا enzyme سره نښلول کیږي. په Hv1 کې، S4 د کویل شوي کویل ډومین (CCD) سره تړاو لري چې د غشا په سایټوپلاسمیک اړخ کې موقعیت لري. .چینل یو ډیمیریک کمپلیکس دی چې دوه VSDs لري چې هر یو یې د 16,17,18 ګیډ شوي پروټون پریمیشن لاره لري. دا دوه Hv1 فرعي واحدونه په ګډه توګه 19,20,21,22 پرانستل شوي ، وړاندیز کوي چې د الوسټریک کوپلینګ او انټر سبونیټ تعاملات لوبې کوي. د ګیټینګ په پروسه کې مهم رول لري. د کویل شوي کویل ډومین کې د فرعي واحدونو ترمینځ انٹرفیس ښه تعریف شوی ځکه چې د دوه جلا شوي ډومینونو کرسټال جوړښتونه شتون لري 22,23. له بلې خوا ، په غشا کې د VSDs ترمینځ انٹرفیس ندی ښه پوه شوی. د Hv1-CiVSP کیمریک پروټین کرسټال جوړښت د دې انٹرفیس په اړه معلومات نه ورکوي، ځکه چې د کریسټال شوي چینل کمپلیکس تریمریک تنظیم ممکن د خمیر لیوسین زپر GCN424 لخوا د اصلي Hv1 CCD د ځای په ځای کولو پایله ولري. د Hv1 چینل د سبونیټ تنظیم وروستۍ مطالعې دې پایلې ته رسیدلي چې دوه S4 هیلیسونه CCD ته د ثانوي جوړښت له جدي ګډوډۍ پرته لیږدوي، چې په پایله کې اوږده هیلیسونه چې د غشا څخه پیل کیږي او د سایتوپلازم ته پروژي. دا څیړنه وړاندیز کوي چې Hv1 VSDs د S4 برخې په اوږدو کې یو له بل سره اړیکه لري. په هرصورت، نورو څیړنو د VSDs تر مینځ بدیل انٹرفیس وړاندیز کړی دی. پدې انٹرفیسونو کې د S1 برخې 17، 21، 26 او د S2 برخې 21 بهرنۍ پایونه شامل دي. د شخړو احتمالي دلیل د دې مطالعاتو پایلې دا دي چې د VSDs تر مینځ الوسټریک جوړه د ګیټینګ پروسې پورې اړوند معاینه شوې ، کوم چې په تړلو او خلاص حالتونو پورې اړه لري ، او د VSDs ترمینځ انٹرفیس ممکن په مختلف حالت کې بدلونونو کې توپیر ولري. دلته، موږ وموندله چې 2-guanidinothiazole Hv1 چینلونه د دوه خلاص VSDs سره په مطابقت کې د پابندۍ له لارې منع کوي، او یو له مرکباتو څخه، 2-guanidininobenzothiazole (GBTA)، په خلاص حالت کې د فرعي واحدونو ترمنځ د تعامل پلټنه کولو لپاره کارول کیږي. interface. موږ وموندله چې د GBTA پابند وکر د کمیتي ماډل لخوا په ښه توګه تشریح کیدی شي چې په کوم کې د یو سبونټ سره د مخنیوی کونکي پابند کول د نږدې سبونیټ د پابند تړاو کې د زیاتوالي لامل کیږي. موږ دا هم وموندله چې د D112 پاتې کیدو لپاره د انتخاب فلټرونه. چینل 27, 28 او د ګیانیډین مشتق بائنډینګ سایټ 29 برخه د GBTA پابند کوپراتیفیت کنټرولوي. موږ ښیې چې د کوپراتیف پابندۍ په Hv1 dimer کې ساتل کیږي ، چیرې چې CCD د S4 برخې څخه جلا کیږي ، وړاندیز کوي چې په CCD کې د انټرسوبونیټ انٹرفیس مستقیم نه وي. د GBTA- binding سایټونو ترمنځ منځګړیتوب allosteric coupling. برعکس، موږ ولیدل چې S1 ټوټه د فرعي واحدونو ترمنځ د انٹرفیس یوه برخه ده او د ډیمر له مرکز څخه لیرې د S4 هیلکس د خارجي پای سره د نږدې VSDs تنظیم کولو وړاندیز کوو. د S1 ټوټه باید په خلاص حالت کې وي. د Hv1 کوچني مالیکول مخنیوی کونکي د سرطان ضد درملو او عصبي محافظتي اجنټانو په توګه ګټور دي. په هرصورت ، تر دې دمه یو څو مرکبات توانیدلي چې د چینل 30,31,32,33 مخه ونیسي. .1a) او د هغې مشتقات وموندل شول چې د چینل له لارې د VSD29,32 د پروټون جریان بندوي. داسې انګیرل کیږي چې د دې ډول مرکبونو تړل په دوه خلاص فرعي واحدونو کې په خپلواکه توګه پیښیږي. مخکې ښودل شوي چې د Hv1 مخنیوی تقریبا د 2GBI په څیر مؤثره دی کله چې د 200 μM غلظت کې ازمول شوي (شکل 1b). موږ نور د تیازول مشتقات معاینه کړل او وموندله چې ځینې یې د GBTA په پرتله ورته یا ډیر ځواک سره چینل منع کوي (انځور 1 او ضمیمه. متن) موږ د څلورو تیازول مشتقاتو (GBTA او مرکباتو [3]، [6] او [11]، شکل 1c) د غلظت غبرګون منحني مشخصې کړې او وموندله چې دوی د 2GBI په پرتله خورا سخت وو. د هیل کوفیفینټ (h) د تیازول مشتق د 1.109 ± 0.040 څخه تر 1.306 ± 0.033 پورې (انځور. 1c او اضافي شکل. 1. په مقابل کې، د 2GBI لپاره د هیل کوفیشینټ 0.975 ± 0.024 29، شکل 2a او اضافي شکل 1. د 1 څخه پورته د هیل کوفینټ د پابندۍ کوپراتیفیت په ګوته کوي. ځکه چې هر یو خپل Hv1 یا فرعي بټ لري. binding site,29,32 موږ استدلال وکړ چې د thiazole مشتق یو سبونټ ته پابند کول کولی شي د بل انابیټر مالیکول سره نږدې subunit ته وتړي. GBTA د ازموینې مرکب و چې د لوړې هیل کوفیشینټ سره. له همدې امله موږ دا مرکب غوره کړ. د پابندو همغږي میکانیزم نوره مطالعه کړئ او 2GBI د منفي کنټرول حوالې په توګه وکارول. (a) د ازموینې مرکبات: [1] حواله Hv1 مخنیوی 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA)، [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine، [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -ګوانایډین، [5](4-میتیل-1,3-تیازول-2-yl)ګوانایډین، [6](5-برومو-4-میتیل-1,3-تیازول-2-yl)ګوانایډین، [7] famotidine، [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate، [10] ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate، [11]1-[4-(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine، 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine. .Hv1 د پروټون جریان د Xenopus oocytes په داخلي تختو کې اندازه شوي چې د -80 mV څخه تر +120 mV پورې د ساتلو ظرفیت څخه د تخریب کولو په ځواب کې. هر مخنیوی په حمام کې د 200 μM.pHi = pHo = 6.0 غلظت کې اضافه شوی. .ډیټا معنی ±SEM (n≥4) دي. (c) د مرکباتو په واسطه د انسان Hv1 غلظت پورې تړلی مخنیوی [2]، [3]، [6] او [11]. هره نقطه د 3 د ± SD د اوسط مخنیوی څرګندوي. تر 15 اندازه. کرښه د هیل فټ ده چې په ضمیمه جدول 1 کې راپور شوي څرګند Kd ارزښتونو ترلاسه کولو لپاره کارول کیږي. د هیل کوفیشینټونه په ضمیمه شکل 1 کې راپور شوي فټ څخه ټاکل شوي: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033، h(3) = 1.25 ± 0.07، h(6) = 1.109 ± 0.040، h (11) = 1.179 ± 0.036 (طريقه وګورئ). (a,b) مرکبات 2GBI او GBTA په غلظت پورې تړلي ډول dimeric او monomeric Hv1 منع کوي. هر ټکی د 3 څخه تر 8 پیمانه د اوسط مخنیوی ± SD استازیتوب کوي او وکر د هیل فټ دی. د هیل کوفیفینټ (h) کې ښودل شوي. د انسیټ هسټوګرامونه په ضمیمه انځر 3 او 4 کې د راپور شوي فټ څخه ټاکل شوي. د GBTA غلظت غبرګون په (a) کې ښودل شوي د عکس 1c سره ورته دی. د ښکاره Kd ارزښتونو لپاره ضمیمه جدول 1 وګورئ. (c) ماډلینګ dimeric Hv1 ته د GBTA کوپراتیف پابند کول. تور تور کرښه د معادلې (6) په واسطه د تجربوي معلوماتو لپاره مناسبه استازیتوب کوي، کوم چې په (d) کې ښودل شوي پابند ماډل تشریح کوي. د سب 1 او فرعي 2 لیبل شوي ډش شوي لینونه د بیمولیکولر اتحادیې استازیتوب کوي. - په ترتیب سره د لومړۍ او دویمې پابندۍ پیښې د انډول کولو انډول منحني (فرعي 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM؛ فرعي 2: BO* + B ⇄ B*O*، Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) د Hv1 بلاک د وړاندیز شوي میکانیزم سکیمیک ډیاګرام. د GBTA په قضیه کې، د یو خلاص سبونټ سره تړل د نږدې خلاص سبونټ (Kd2 د Hv1 چینلونه کولی شي د دوی د N- او C-ټرمینل سایټوپلاسمیک ډومینونو د ورته برخو سره د Ciona Intestinalis ولتاژ حساس فاسفیټس CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18,34 سره په ځای کولو سره مونومرائز شي. موږ د Hv1NCCiVSP او GB2GTA inhibition غلظت انحصار او د HV2GTA inhibition سره اندازه کړل. دوی د ډیمیریک چینل (وحشی ډول) مخنیوی (انځور 2a،b) سره پرتله کړي. موږ وموندله چې د دوه مرکبونو تر مینځ د پابند همکارۍ توپیر په مونومیریک Hv1 کې له مینځه وړل شوی، د دې وضاحت مالتړ کوي چې د GBTA پابند یو سبونټ ته وده ورکوي. د مخنیوی کونکي لپاره د بل فرعي واحد سره تړاو. موږ استدلال وکړ چې د Hv1 سبونټ سره د GBTA پابند کول ممکن د پابندۍ سایټ بیا تنظیم کولو لامل شي (د fit35 هڅول) ، کوم چې به د نږدې فرعي واحد د خالي پابند سایټ بیا تنظیم کولو لامل شي ، چې د پابندۍ زیاتوالي لامل کیږي. تړاو چینل ته د GBTA د کوپراتیف پابندۍ په کمیتي ډول تشریح کولو لپاره، موږ یو ماډل کارولی چې په هغه کې یا هم سبونیټ کولی شي لومړی مخنیوی مالیکول وتړي د بایمولوکولر عکس العمل وروسته د جلا کیدو ثابت Kd1 (انځور 2c، Sub 1، OO+ B ⇆ BO*). پابند کول د دې لامل کیږي چې چینل یو داسې حالت غوره کړي چې په هغه کې پاتې خالي سبونټونه د یو ځانګړي بایمولکولر عکس العمل وروسته د انحطاط سره تړل کیږي د جلا کیدو ثابت Kd2 سره ، چیرې چې Kd2 0.05) کمښت موندلی، دا وړاندیز کوي چې د دې رول په ساتلو کې دوه فرعي واحدونه یوځای مهم دي، مګر CCD په مستقیم ډول د GBTA پابند سایټونو ترمنځ د انټرسوبونیت اللوسټریک جوړه منځګړیتوب نه کوي. (a) د Hv1 ډیمر سکیماتیکي ډیاګرام د S4 په داخلي پای کې د ټرایګلیسین بدلون سره ډیزاین شوی ترڅو د انټرسوبونیت ترکیب ګډوډ کړي چې د سایتوپلاسمیک کویل شوي کویل ډومین (نیلي تیر) لخوا منځګړیتوب کیږي. اشاره شوي بدلونونه، د S1 ټوټې ازموینې لپاره ډیزاین شوي چې د سبونټونو (نیلي تیرونو) ترمنځ په یوځای کولو کې دخیل دي. (c–h) 2GBI (سیان) او GBTA (تور سور) په غلظت پورې تړلي ډول په نښه شوي جوړښتونه منع کوي. هر ټکی د منځنۍ مخنیوی استازیتوب کوي. ± SD د 3 څخه تر 10 اندازه اندازه. وکر یو هیل فټ و چې د څرګند Kd ارزښتونو ترلاسه کولو لپاره کارول کیږي (اضافی جدول 1 وګورئ) . په انټرپول شوي هسټوګرامونو کې د هیل کوفیشینټونه ټاکل شوي لکه څنګه چې د میتودونو برخه کې تشریح شوي (د ضمیمه انځر 3 او 4 وګورئ) لپاره د h ارزښتونو حواله Hv1 WT د ډش شوي لینونو په توګه ښودل شوي. ستوري په احصایه کې د متقابل او WT پاسونو ترمنځ د احصایې له پلوه مهم توپیرونه په ګوته کوي (p 0.05، Fig 5d) په پرتله د هیچا مخنیوی کونکي د هیل کوفیسینټ د پام وړ بدلون نه دی کړی. ). له بلې خوا، بدلون D123A د GBTA (p 0.05/14). له هغه وخته چې په دواړو فرعي واحدونو کې د 123 موقعیت کې چارج بې طرفه کول د GBTA پابند همکارۍ کې د قوي بدلون لامل شو ، پداسې حال کې چې په دواړو سبونټونو کې د چارج بیرته راګرځول یوازې یو کوچنی تاثیر درلود ، موږ تحلیل پراخه کړ ترڅو یوازې د چارج د انعطاف چینل سره یوازې یو سبونیټ شامل کړو. د C-ټرمینل سبونیټ (انځور 5b) کې د D123R بدیل سره د Hv1 سره تړل شوي ډیمرونه رامینځته کړي او د GBTA او 2GBI لخوا د غلظت غبرګون مخنیوی اندازه کړي. موږ وموندله چې د GBTA د هیل کوفیسینټ د WT-D123R چینلونو په پرتله د پام وړ لوړ و. د وحشي ډوله Hv1 (p