Interogarea interfeței intersubunități a canalului de protoni Hv1 deschis cu o sondă cuplată alosteric

Vă mulțumim că vizitați Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a vă asigura suport continuu, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript. Canalul de protoni activat de tensiune Hv1 este un complex dimeric format din două domenii de detectare a tensiunii (VSD), fiecare dintre ele conţinând o cale de permeaţie a protonilor cu portă. Dimerizarea este controlată de domeniul bobinei spiralate citoplasmatice. Tranziţia de la starea închisă la se știe că starea deschisă în ambele VSD-uri are loc în mod cooperativ; cu toate acestea, se știe puțin despre mecanismele de bază. Interfețele intersubunități joacă un rol cheie în procesele alosterice; totuși, astfel de interfețe nu au fost identificate în canalele Hv1 deschise. Aici demonstrăm că derivații de 2-guanidinotiazol blochează două VSD-uri Hv1 într-o manieră cooperantă și folosesc unul dintre acești compuși ca sondă pentru cuplarea alosterică între subunitățile deschise. Am descoperit că extracelularul capătul primului fragment transmembranar al VSD formează o interfață intersubunități care mediază cuplarea între site-urile de legare, în timp ce domeniul bobinei spiralate nu este direct implicat în acest proces. . Canalele de protoni dependente de tensiune joacă roluri importante într-o varietate de organisme, de la fitoplancton la oameni1. În majoritatea celulelor, aceste canale mediază efluxul de protoni din membrana de protoni și reglează activitatea NADPH oxidazei. Singurul canal de protoni dependent de tensiune cunoscut la om. este Hv1, care este produsul genei HVCN1. motilitatea9 și reglarea pH-ului fluidului de suprafață a căilor respiratorii10. Acest canal este implicat în mai multe tipuri de cancer, cum ar fi tumorile maligne cu celule B4,11 și cancerele de sân și colorectal. de microglia, iar activitatea sa s-a demonstrat că exacerba leziunile cerebrale în modelele de accident vascular cerebral ischemic. Proteina Hv1 conține un domeniu de detectare a tensiunii (VSD), care constă din patru segmente transmembranare numite S1 până la S414. Ciona gutis15. În aceste alte proteine, capătul C-terminal al lui S4 este atașat la un modul efector, domeniul porilor sau enzima. În Hv1, S4 este legat de domeniul coiled-coil (CCD) situat pe partea citoplasmatică a membranei. Canalul este un complex dimeric format din două VSD, fiecare conținând o cale de permeație a protonilor întinsă16,17,18. S-a descoperit că aceste două subunități Hv1 se deschid în mod cooperant19,20,21,22, sugerând că cuplarea alosterică și interacțiunile inter-subunități joacă un rol important în procesul de gating. Interfața dintre subunitățile din domeniul bobinei spiralate este bine definită deoarece structurile cristaline ale celor două domenii izolate sunt disponibile22,23. Pe de altă parte, interfața dintre VSD-urile din interiorul membranei nu este bine înțeles. Structura cristalină a proteinei himerice Hv1-CiVSP nu oferă informații despre această interfață, deoarece organizarea trimerică a complexului de canale cristalizate poate rezulta din înlocuirea CCD-ului nativ Hv1 cu fermoarul de leucină de drojdie GCN424. Un studiu recent al organizării subunității canalului Hv1 a concluzionat că două elice S4 tranzitează în CCD fără perturbarea severă a structurii secundare, rezultând elice lungi care pornesc de la membrană și se proiectează în citoplasmă. Pe baza analizei de reticulare a cisteinei, acest studiu propune ca VSD-urile Hv1 să se contacteze între ele de-a lungul segmentului S4. Cu toate acestea, alte studii au propus interfețe alternative între VSD-uri. Aceste interfețe includ segmentele S1 17, 21, 26 și capetele exterioare ale segmentului S2 21. Un posibil motiv pentru conflictul Rezultatele acestor studii sunt că cuplarea alosterică între VSD-uri a fost examinată în legătură cu procesul de gating, care depinde de stările închis și deschis, iar interfața dintre VSD-uri poate varia în diferite schimbări de stare în conformație. Aici, am descoperit că 2-guanidinotiazolul inhibă canalele Hv1 prin legarea sinergică la două VSD-uri deschise și a folosit unul dintre compuși, 2-guanidinobenzotiazol (GBTA), pentru a sonda interacțiunea dintre subunități în stare deschisă. Am constatat că curba de legare GBTA poate fi bine descrisă de un model cantitativ în care legarea unui inhibitor la o subunitate are ca rezultat o creștere a afinității de legare a subunității adiacente. De asemenea, am constatat că reziduurile D112, filtre de selectivitate pentru canalul 27, 28 și o parte a site-ului de legare a derivatului de guanidină 29 controlează cooperativitatea de legare a GBTA. Arătăm că legarea cooperativă este menținută în dimerul Hv1, unde CCD-ul se separă de segmentul S4, sugerând că interfața intersubunității din CCD nu este direct mediază cuplarea alosterică între situsurile de legare a GBTA. În schimb, constatăm că fragmentul S1 face parte din interfața dintre subunități și propunem o aranjare a VSD-urilor adiacente cu capătul extracelular al helixului S4 departe de centrul dimerului pentru a permite fragmentul S1 să fie în stare deschisă. Inhibitorii cu molecule mici ai Hv1 sunt utili ca medicamente anticancer și agenți neuroprotectori. Cu toate acestea, până în prezent, puțini compuși au reușit să inhibe canalul30,31,32,33. Printre aceștia, 2-guanidinobenzimidazolul (2GBI, compusul [1] din Fig. 1a) și derivații săi blochează pătrunderea VSD29,32 a protonilor prin canal. Se crede că legarea unor astfel de compuși are loc independent în cele două subunități deschise.2-guanidinobenzotiazolul (GBTA, compusul [2] din figura 1a) a fost. s-a demonstrat anterior că inhibă Hv1 aproape la fel de eficient ca 2GBI atunci când a fost testat la o concentrație de 200 μM (Figura 1b). Am examinat alți derivați de tiazol și am constatat că unii dintre ei au inhibat canalul cu o potență similară sau mai mare decât GBTA (Figura 1 și Suplimentar). text).Am determinat curbele de răspuns la concentrație a patru derivați de tiazol (GBTA și compuși [3], [6] și [11], Fig. 1c) și am constatat că acestea sunt mai abrupte decât cele ale 2GBI. Coeficienții Hill (h) a derivaților de tiazol au variat între 1,109 ± 0,040 și 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c și Fig. 1). În schimb, coeficientul Hill pentru 2GBI a fost 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a și Fig. 1 suplimentară). Un coeficient Hill peste 1 indică cooperarea de legare. Deoarece fiecare subunitate Hv1 are propriul inhibitor- Situl de legare29,32 am motivat că legarea unui derivat de tiazol la o subunitate ar putea spori legarea unei a doua molecule inhibitoare la subunitatea adiacentă. GBTA a fost compusul de testat cu cel mai mare coeficient Hill. Prin urmare, am ales acest compus pentru studiază în continuare mecanismul sinergiei de legare și a folosit 2GBI ca control negativ de referință. (a) Compuși de testare: [1] Inhibitor de referință Hv1 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluormetil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidină, [4] nafto[1,2-d][1,3] tiazol-2-il -guanidină, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidină, [6](5-brom-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidină, [7] famotidină, [8] ester etilic al acidului 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxilic, [9] 2-guanidino-4-metil etil-1,3-tiazol-5-carboxilat, [10 acetat de ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil, [11]1-[4-(4-clorfenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidină, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidină. (b) Inhibarea activității Hv1 umane de către guanidinotiazolii indicați și compusul de referință 2GBI (bare albastru-verde) .Curenții de protoni Hv1 au fost măsurați în plăci din interiorul exterior ale ovocitelor Xenopus ca răspuns la depolarizarea de la un potențial de reținere de la -80 mV la +120 mV. Fiecare inhibitor a fost adăugat la baie la o concentrație de 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Datele sunt media±SEM (n≥4).(c) Inhibarea dependentă de concentrație a Hv1 uman de către compușii [2], [3], [6] și [11].Fiecare punct reprezintă inhibarea medie ± SD de 3 la 15 măsurători. Linia este o potrivire Hill utilizată pentru a obține valorile Kd aparente raportate în Tabelul suplimentar 1. Coeficienții Hill au fost determinați din potrivirile raportate în Fig. 1 suplimentară: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (vezi Metode). (a,b) Compușii 2GBI și GBTA au inhibat Hv1 dimeric și monomeric într-o manieră dependentă de concentrație. Fiecare punct reprezintă inhibarea medie ± SD a 3 până la 8 măsurători, iar curba este o potrivire Hill. Coeficienții Hill (h) indicați în histogramele inserate au fost determinate din potrivirile raportate în figurile suplimentare 3 și 4. Răspunsul la concentrație al GBTA prezentat în (a) este același cu cel din Fig. 1c. Vezi tabelul suplimentar 1 pentru valorile aparente Kd. (c) Modelarea legarea cooperativă a GBTA la Hv1 dimeric. Linia neagră continuă reprezintă potrivirea la datele experimentale prin ecuația (6), care descrie modelul de legare prezentat în (d). Liniile întrerupte etichetate Sub 1 și Sub 2 reprezintă asocierea bimoleculară -curbe de echilibru de disociere ale primului, respectiv al doilea eveniment de legare (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diagrama schematică a mecanismului propus al blocului Hv1. În cazul GBTA, legarea la o subunitate deschisă crește afinitatea subunității deschise adiacente (Kd2 0,05) a coeficientului Hill de legare a GBTA la canalele GGG în comparație cu tipul sălbatic (Fig. 5c), sugerând că, în ciuda rolului său în menținerea două subunități sunt importante împreună, dar CCD nu mediază direct cuplarea alosterică între subunități între situsurile de legare GBTA. (a) Diagrama schematică a dimerului Hv1 cu o mutație a triglicinei la capătul interior al lui S4, concepută pentru a perturba cuplarea intersubunităților mediată de domeniul citoplasmatic spiralat-coil (săgeți albastre). (b) Reprezentarea schematică a dimerilor Hv1 și a dimerilor de ligatură cu mutațiile indicate, concepute pentru a testa fragmentele S1 implicate în cuplarea între subunități (săgeți albastre).(c–h) 2GBI (cian) și GBTA (roșu închis) inhibă constructele indicate într-o manieră dependentă de concentrație. Fiecare punct reprezintă inhibarea medie. ± SD de la 3 la 10 măsurători. Curba a fost o potrivire Hill utilizată pentru a obține valori Kd aparente (a se vedea tabelul suplimentar 1). Coeficienții Hill în histogramele interpolate au fost determinați așa cum este descris în secțiunea Metode (a se vedea figurile suplimentare 3 și 4). Valorile h de referință pentru Hv1 WT sunt afișate ca linii întrerupte. Asteriscurile indică diferențe semnificative statistic între pasajele mutante și WT (p 0,05, Fig. 5d,i) ). Pe de altă parte, mutația D123A a redus semnificativ coeficientul Hill al GBTA (p 0,05/14). Deoarece neutralizarea sarcinii la poziția 123 pe ambele subunități a dus la o schimbare puternică a cooperativității de legare GBTA, în timp ce inversarea taxei pe ambele subunități a avut doar un efect mic, am extins analiza pentru a include doar o subunitate cu canalul de inversare a sarcinii. a generat dimeri legați de Hv1 cu substituție D123R în subunitatea C-terminală (Fig. 5b) și a măsurat inhibarea concentrației-răspuns de către GBTA și 2GBI. Am descoperit că coeficientul Hill al legării GBTA la canalele WT-D123R a fost semnificativ mai mare decât acesta. de Hv1 de tip sălbatic (p 0,05). De asemenea, am constatat că, în absența βME, coeficientul Hill al legării GBTA la dimerul D112E I127C Hv1 a fost semnificativ mai mare decât cel măsurat în prezența agenților reducători (Fig. 6e și Fig. 4 suplimentară), implicând că mutația D112E nu a desființat creșterea cooperativității de legare a GBTA rezultată din reticulare a cisteinei 127. Coeficientul Hill al legării 2GBI la dimerii D112E, I127C Hv1 nu a fost, de asemenea, afectat semnificativ de mutația D112E (Figura 1). 6d și Suplimentar Fig. 3). Luate împreună, aceste descoperiri sugerează că legarea GBTA este îmbunătățită de interacțiunea dintre capetele exterioare ale fragmentelor S1 din subunitățile Hv1 adiacente prin interacțiuni electrostatice atractive sau prin formarea de legături covalente între cisteinele substituite Cuplarea alosterică între situsuri crește și are ca rezultat cooperarea de legare. În timp ce efectul interacțiunilor electrostatice atractive asupra cooperativității poate fi abolit prin mutația D112E, efectul legăturilor covalente nu poate. În explorarea noastră a spațiului chimic disponibil pentru legarea derivaților de guanidină la canalele Hv1, am descoperit că 2-guanidinotiazolii precum GBTA au o dependență mai mare de concentrație decât 2-guanidinobenzimidazolii (Fig. 1c). Analiza coeficientului Hill a legării GBTA atât la dimerici. și canalele monomerice (Fig. 2a, b) și la canalul dimeric în care o subunitate a fost prelegată de inhibitor (Fig. 4) ne-au determinat să concluzionăm că inhibarea Hv1 de către GBTA Acțiunea este un proces sinergic și situsurile de legare ale compușilor din cele două subunități sunt cuplate alosteric. Descoperirea că GBTA se leagă de canalul deschis, așa cum s-a arătat anterior pentru compusul înrudit 2GBI32, sugerează că cuplarea alosterică poate fi evaluată în mod specific în stare deschisă. Modelul nostru de legare cooperativă a fost capabil să descrie cantitativ inhibarea HV1 de către GBTA (Fig. 2C) și să explice efectele diferite ale 2GBI și GBTA asupra degradării curenților de coadă de canal după repolarizarea membranei, care susține interpretarea noastră a procesului de legare. Coeficientul maxim de deal care poate fi obținut într-o proteină alosterică cu două site-uri de legare (cum ar fi HV1) este 2. Am măsurat GBTA pentru a lega tipul sălbatic HV1 cu un coeficient de 1,31, care a crescut la 1,88 în HV1 I127c. Energia liberă sinergică, diferența dintre energiile libere de legare ale celor mai mici și cele mai înalte site-uri de afinitate (vezi Metode), a fost de 1,3 kcal/mol în cazul HV1 de tip sălbatic și 2,7 kcal/mol în cazul HV1 I127c. Legarea de legare de oxigen la hemoglobină este cel mai cunoscut și bine studiat exemplu al procesului de colaborare38.Pentru hemoglobina umană (un tetramer cu patru site-uri de legare cuplate alosteric), coeficientul de deal variază de la 2,5-3,0, cu valori cuprinse între 1,26 și 3,64 KCAL/MOL, în funcție de condițiile experimentale38. În modelul nostru de sinergie, legarea moleculelor GBTA la o subunitate duce la o creștere a afinității de legare a subunității adiacente. Ne gândim la un proces în care o rearanjare a mediului de legare care rezultă din primul eveniment de legare (Fit indus) duce la Modificări ale interacțiunilor dintre subunități. Răspuns la aceste modificări, subunitățile adiacente își modifică siturile de legare, ceea ce duce la o legare mai strânsă a GBTA. În acest proces, S1 Aspartat D112 este responsabil pentru rearanjarea sitului de legare asociat cu afinitatea de legare crescută.D112 anterior s -a dovedit a face parte din calea de permeație a protonului HV1 și a acționa ca filtru de selectivitate27,28. Rezultatele noastre arată că filtrele de selectivitate din cele două subunități HV1 sunt cuplate alosteric în starea deschisă. Figura 7a arată locația aproximativă a site -ului de legare GBTA și locația reziduurilor D112, D123, K125 și I127 pe o schemă a HV1 VSD bazată pe VSD HV1 VSD Pe structura cristalină a himera HV1-CivSP. Direcții menționate pentru cuplarea alosterică care implică capătul extracelular al S1 sunt afișate cu săgeți negre. (a) Schema HV1 VSD.BASASIZAT PE STRUCTURA CRISTALULUI a himera HV1-CIVSP, segmentele elicoidale sunt dovedite a fi cilindrice. În această configurație, capătul interior al segmentului S4 se contopește cu CCD (nu este prezentat). Locațiile prevăzute ale GBTA legate sunt prezentate ca ovale cenușii. Săgețile Black indică căile implicate în cuplarea alosterică între siturile de legare în două subunități adiacente. Pozițiile reziduurilor S1 investigate sunt marcate cu sfere colorate. În două configurații dimer diferite, așa cum se vede din partea extracelulară a planului membranei. La panoul din stânga, interfața dimer este formată de helixul S4.Rotare a celor două VSDS 20 de grade în sensul acelor de ceasornic în jurul unei axe perpendiculare pe plan Separarea capetelor exterioare ale celor două elice S4 (săgeți punctate), produce aranjamentul afișat în dreapta. În această configurație, reziduurile D123 și I127 din subunitățile adiacente sunt permise să se apropie. (C) Reprezentarea schematică a CIVSP VSD În configurația dimerului găsită în structura de cristal 4G80.Position p140 în CIVSP corespunde poziției D123 în HV1. Rezultatele noastre arată că interacțiunea electrostatică respingătoare dintre reziduurile 123 (123D/123D sau 123R/123R) este asociată cu un nivel „normal” de cooperativitate care leagă GBTA în stare deschisă și trece interacțiunea de la repulsie la atras (123D/123R) , o cooperare crescută (Fig. 5G). Se așteaptă ca eliminarea interacțiunii respingătoare cu substituția alaninei să conducă, de asemenea, la o cooperare crescută. Cu toate acestea, s -a observat o scădere a cooperativității dimerului 123A/123A (Fig. 5E). One posibilă posibilă Explicația este că efectul destabilizator al plasării reziduurilor hidrofobe într -un mediu hidrofil poate depăși efectul de stabilizare datorită eliminării interacțiunilor respingătoare între reziduurile D123, rezultând o reducere generală a cooperativității de legare. Poziția D171 a Ciona gutis CI-HV1 (corespunzătoare D123 în HV1 uman) este crescută la activare, susținând ideea că D123 este localizat într-un mediu hidrofil în stare deschisă. Se știe că închiderea canalelor HV1 se întâmplă prin tranziții multiple19,20,26,39,40,41.Qiu și colab. A constatat că, la depolarizarea membranei, senzorul de tensiune al CI-HV1 suferă o schimbare conformațională care lasă canalul activat, dar încă închis , urmată de o tranziție distinctă care face ca protonii să deschidă conducerea în ambele subunități. Perturbarea semnalului fluorescent este în concordanță cu prezența interacțiunilor electrostatice între reziduurile D171 ale subunităților adiacente la un moment dat de -a lungul coordonatelor de reacție ale schimbării conformaționale. Această interpretare este în concordanță cu constatarea noastră că reziduul D123 interacționează electrostatic în stare deschisă și mediază cuplarea alosterică între site -urile de legare GBTA. Fujiwara et al25 proposed that the dimer interface of the cytoplasmic coiled-coil domain extends into the membrane to contain two S4 helices (Fig. 7b, left panel).A model of this intersubunit interaction is based on cysteine ​​cross-linking analysis covering Întreaga VSD și analiza funcțională a regiunii care conectează helixul S4 și CCD.in absența unui gradient de pH transmembran, canalele HV1 necesită o depolarizare considerabilă a membranei pentru a deschide, iar reticularea cisteinei are loc în condițiile în care canalul este predominant închis. Prin urmare, interfața S4-S4 detectată reflectă probabil configurația subunității off-state. Alte studii au găsit dovezi pentru implicarea S1 și S2 în interacțiunile intersubunitare în timpul Gating17,21,26 care sugerează că canalele pot adopta diferite configurații subunitate la nivelul deschis și Statele închise, o idee în concordanță cu concluziile lui Mony și colab. S1 se mișcă 39 în timpul închiderii. Aici, arătăm că, în stare deschisă, capetele extracelulare ale helixului S1 sunt suficient de aproape pentru a susține interacțiuni electrostatice directe care mediază cuplarea alosterică între subunități. În configurația dimerului cu interacțiuni extinse S4-S4, elicele S1 sunt prea departe În afară de celălalt pentru a interacționa direct. cu concluziile noastre (Fig. 7B, panoul din dreapta). Recomandăm această configurație pentru canalul în stare deschisă. Deși enzima CIVSP este considerată a funcționa ca un monomer, structura cristalină a VSD -ului izolat este capturată într -o stare dimer. Capetele exterioare ale elicelor S1 din acest dimer sunt în mod spațial strâns, iar configurația generală este similară cu cea propusă Pentru HV1 (Fig. 7C). În dimerul CIVSP, cel mai apropiat reziduu din subunitatea adiacentă a fost prolină la poziția 140 (Fig. 7C). În mod interesant, p140 în CIVSP corespunde poziției D123 în HV1. Asemănarea în configurația subunității între HV1 Și dimerii Civsp sugerează că VSD -urile acestor proteine ​​au o tendință intrinsecă de a forma o interfață în care interacționează capetele extracelulare ale S1. Rolul esențial al HV1 în activarea celulelor spermatozoizi face din acest canal o țintă de medicament atractivă pentru controlul fertilității masculine. S -a dovedit că activarea HV1 în microglie agravează recuperarea de la accident vascular cerebral ischemic. Supraviețuirea la pacienții cu sân 12 sau cancer colorectal 13 și se crede că contribuie la malignități cu celule B Subunitatea HV1 deschisă, care duce la creșterea unei afinități de legare, poate duce la dezvoltarea de medicamente mai puternice care vizează canalele HV1. Mutageneza direcționată pe site-ul HV1 umană a fost efectuată folosind tehnici PCR standard. În construcția HV1NCCIVSP, reziduurile 1-96 și 228-273 de HV1 au fost înlocuite de reziduurile 1-113 și 240-576 de Civsp18.in DIMER legat de HV1, DIMER legat de HV1, the C-terminus of one subunit is linked to the N-terminus of the second subunit through the GGSGGSGGSGSGGSGG linker.The pGEMHE plasmids containing the various constructs were linearized with Nhe1 or Sph1 restriction enzymes (New England Biolabs) and RNA synthesis was performed with the Kit de transcripție mmachină MMACHINE (AMBION) .1-3 zile înainte de măsurătorile electrofiziologice, ARNc a fost injectat în ovocite Xenopus (50 nl pe celulă, 0,3-1,5 μg/µl). Din biosciența ecocită. Urmărind injecția de ARN, celulele au fost menținute în mediu ND96 conținând 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CACL, 1 mM MGCL, 10 mM HEPES, 5 mM piruvat, 100 μg/ml gentamicină, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzotiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidină [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -iazol-2-il) guanidină) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxilat [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-tiazol- 5-carboxilat [9] și (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) acetat de etil [10] au fost din Sigma-Aldrich.Famotidina [7] a fost de la MP Biomedicals.1- [4 -(4-clorofenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidină [11] și 1- [4- (3,4-dimetoxifenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidină [12] a fost de la Matrix Scientific.Amii compuși sunt de cea mai mare puritate disponibili comercial. Au fost dizolvați în DMSO uscat pentru a genera o soluție stoc de 100 mM, care a fost apoi diluată în soluția de înregistrare la concentrația finală dorită.comp. Cel puțin 99% puritate. La o suspensie de clorhidrat de 2-amino-4- (trifluometil) benzenethiol (1,02 g, 4,5 mmol) în 25 ml de acid clorhidric apos (2,5 N) solid dicaniamidă (380 mg, 4,5 mmol), iar amestecul heterogenei rezultat rezultate a fost refluxat cu agitare viguroasă timp de 4 ore. Amestecul de reacție a fost răcit la temperatura camerei și neutralizat prin adăugarea treptată de hidroxid de 10N potasiu. Precipitatul alb format a fost filtrat, spălat cu apă rece (3 × 50 ml), uscat într -un cuptor ( 65 ° C) timp de câteva ore, apoi recristalizate din acetat de etil/eter petrolier pentru a da un solid alb (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (lumină 225–226 ° C) 45; 1H RMN (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7,25 (foarte larg, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d , 1 h, j = 8,1 Hz) .13c RMN (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, j = 3,5 Hz), 117,5 (d, j = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, j, j = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152.1, 158,4, 175.5.hrms (ESI): m/z valoare calculată.Pex for c9h8f3n4s (m + h) +: 261.0416, găsit găsit : 261.0419. Naftho [1,2-D] tiazol-2-amină (300 mg, 1,5 mmol), sintetizat așa cum s-a descris anterior, a fost încălzit la 200 ° C într-o baie de ulei într-un mic tub de testare.300 mg (exces mare) cianamidă și 1,0 ml conc. La compusul fierbinte s -a adăugat rapid acid clorhidric și amestecul a fost păstrat în baia de ulei timp de aproximativ 2 minute, timp în care cea mai mare parte a apei s -a evaporat. Amestecul de reacție a fost apoi răcit la temperatura camerei și la materialul solidificat rezultat a fost spart în bucăți mici și spălat cu apă pentru a oferi un solid amorf galben pal. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H RMN (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [PPM] = 7,59 (T, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (T, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (D, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 Hz) .13c RMN (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169.1.hrms (ESI): m/z Valoare calculată.Pentru C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , găsit: 243.0704. Curenții de protoni au fost măsurați în patch-uri interne și externe de ovocite care exprimă diferite construcții folosind un amplificator AXOPATCH 200B controlat de un axon digidata 1440A (dispozitive moleculare) cu software PCLAMP10. ) acid ethanesulfonic (MES), 30 mM tetraetilamoniu (TEA) mesilat, 5 mm clorură de ceai, 5 mm etilen glicol-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraacetic (EGTA), ajustat la pH 6,0 cu hidroxid de ceai. Toate măsurătorile au fost efectuate la 22 ± 2 °. Pipeta are o rezistență de acces de 1,5–4 MΩ. Urmele curent au fost filtrate la 1 kHz, eșantionate la 5 kHz și analizate cu ClampFit10.2 (dispozitive moleculare ) și originea8.1 (OriginLab). Soluții care conțin diverse concentrații de inhibitor HV1 și, în unele cazuri, 10 mM βME au fost introduse în baie de gravitație printr-o galerie conectată la un sistem de supape de perfuzie VC-6 (Warner Instr.), Care a fost trecut prin software-ul PCLAMP TTL (tranzistor- Semnalele logicii tranzistorului). Experimentele de perfuzie aprepide au fost efectuate folosind un creion de perfuzie cu mai multe tuburi (automat SCI.) Cu un vârf de livrare cu diametrul de 360 ​​μm montat în fața unei pipete. Pulse depolarizant de +120 mV. Măsurătorile GV au fost efectuate așa cum s -a descris anterior 18,20. Curenții de coadă au fost înregistrați la -40 mV după etape de depolarizare la diferite tensiuni de la -20 mV la +120 mV, cu excepția cazului în care se menționează altfel. Folosit pentru a corecta pentru descompunerea curentă 18. Graficul GV se potrivește ecuației Boltzmann: Constanțele aparente de disociere (KD) pentru diferite combinații de canale și inhibitori (tabelul suplimentar 1) au fost determinate prin potrivirea dependenței de concentrație a inhibiției (valori medii %inhib) Cu ecuația dealului: unde [i] este concentrația de inhibitor I și H este coeficientul dealului. Pentru a calcula coeficientul dealului, ecuația (2) este rearanjată ca: