Опрос межсубъединичного интерфейса открытого протонного канала Hv1 аллостерически связанным зондом

Благодарим вас за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). А пока, чтобы обеспечить продолжение поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript. Потенциал-зависимый протонный канал Hv1 представляет собой димерный комплекс, состоящий из двух потенциал-чувствительных доменов (VSD), каждый из которых содержит управляемый путь проникновения протонов. Димеризация контролируется цитоплазматическим спиральным доменом. Переход из закрытого состояния в известно, что открытое состояние в обоих ПЧД возникает совместно; однако мало что известно о лежащих в основе механизмах. Межсубъединичные интерфейсы играют ключевую роль в аллостерических процессах; однако такие интерфейсы не были идентифицированы в открытых каналах Hv1. Здесь мы демонстрируем, что производные 2-гуанидинотиазола блокируют два VSD Hv1 кооперативным образом и используют одно из этих соединений в качестве зонда для аллостерического связывания между открытыми субъединицами. Мы обнаружили, что внеклеточные Конец первого трансмембранного фрагмента ДМЖП образует межсубъединичный интерфейс, который обеспечивает соединение между сайтами связывания, тогда как спирально-спиральный домен не участвует напрямую в этом процессе. Мы также обнаружили убедительные доказательства того, что протон-селективный фильтр канала контролирует кооперативность связывания блокаторов. . Потенциал-управляемые протонные каналы играют важную роль во многих организмах, от фитопланктона до человека1. В большинстве клеток эти каналы опосредуют отток протонов из протонной мембраны и регулируют активность НАДФН-оксидазы. Единственный известный потенциал-управляемый протонный канал у человека. Это Hv1, который является продуктом гена HVCN12,3. Было показано, что Hv1 (также известный как VSOP) играет роль в пролиферации B-клеток4, производстве активных форм кислорода врожденной иммунной системой5,6,7,8, сперматозоидах моторика9 и регуляция pH поверхностной жидкости дыхательных путей10. Этот канал участвует в нескольких сверхэкспрессируемых типах рака, таких как B-клеточные злокачественные новообразования4,11, а также рак молочной железы и колоректальный рак12,13. Было обнаружено, что чрезмерная активность Hv1 увеличивает метастатический потенциал раковых клеток11,12. В головном мозге Hv1 экспрессируется микроглией, и было показано, что ее активность усугубляет повреждение головного мозга на моделях ишемического инсульта. Белок Hv1 содержит потенциал-чувствительный домен (VSD), который состоит из четырех трансмембранных сегментов, называемых S1-S414. VSD напоминает соответствующие домены потенциал-зависимых Na+, K+ и Ca2+-каналов и потенциал-чувствительных фосфатаз, таких как CiVSP из Ciona Gutis15. В этих других белках С-конец S4 прикреплен к эффекторному модулю, поровому домену или ферменту. В Hv1 S4 связан со спиральным доменом (CCD), расположенным на цитоплазматической стороне мембраны. Канал представляет собой димерный комплекс, состоящий из двух ДМЖП, каждый из которых содержит закрытый путь проникновения протонов16,17,18. Было обнаружено, что эти две субъединицы Hv1 открываются совместно19,20,21,22, что позволяет предположить, что аллостерическое сцепление и межсубъединичные взаимодействия играют роль играет важную роль в процессе шлюзования. Интерфейс между субъединицами внутри спирально-спирального домена четко определен, поскольку доступны кристаллические структуры двух изолированных доменов22,23. С другой стороны, интерфейс между ДМЖП внутри мембраны не хорошо изучена. Кристаллическая структура химерного белка Hv1-CiVSP не дает информации об этом интерфейсе, поскольку тримерная организация кристаллизованного комплекса каналов может быть результатом замены нативного CCD Hv1 дрожжевой лейциновой застежкой-молнией GCN424. Недавнее исследование субъединичной организации канала Hv1 пришло к выводу, что две спирали S4 переходят в CCD без серьезного нарушения вторичной структуры, в результате чего образуются длинные спирали, которые начинаются с мембраны и выступают в цитоплазму. На основании анализа сшивки цистеина это исследование предполагает, что VSD Hv1 контактируют друг с другом вдоль сегмента S4. Однако другие исследования предложили альтернативные интерфейсы между VSD. Эти интерфейсы включают сегменты S1 17, 21, 26 и внешние концы сегмента S2 21. Возможная причина конфликта Результаты этих исследований заключаются в том, что аллостерическая связь между VSD была изучена в отношении процесса шлюзования, который зависит от закрытого и открытого состояний, а интерфейс между VSD может варьироваться в разных состояниях, меняя конформацию. Здесь мы обнаружили, что 2-гуанидинотиазол ингибирует каналы Hv1 путем синергического связывания с двумя открытыми VSD, и использовали одно из соединений, 2-гуанидинобензотиазол (GBTA), для исследования взаимодействия между субъединицами в открытом состоянии. Мы обнаружили, что кривая связывания GBTA может быть хорошо описана количественной моделью, в которой связывание ингибитора с одной субъединицей приводит к увеличению аффинности связывания соседней субъединицы. Мы также обнаружили, что остатки D112 избирательно фильтруют каналы 27, 28 и часть сайта связывания производного гуанидина 29 контролируют кооперативность связывания GBTA. Мы показываем, что кооперативное связывание поддерживается в димере Hv1, где CCD отделяется от сегмента S4, предполагая, что межсубъединичный интерфейс в CCD напрямую не влияет опосредуют аллостерическую связь между сайтами связывания GBTA. Напротив, мы находим, что фрагмент S1 является частью интерфейса между субъединицами, и предлагаем расположение соседних VSD с внеклеточным концом спирали S4 вдали от центра димера, чтобы позволить фрагмент S1 находиться в открытом состоянии. Маломолекулярные ингибиторы Hv1 полезны в качестве противораковых препаратов и нейропротекторов. Однако на сегодняшний день лишь немногие соединения способны ингибировать канал30,31,32,33. Среди них 2-гуанидинобензимидазол (2GBI, соединение [1] на рис. 1a) и его производные блокируют проникновение протонов VSD29,32 через канал. Считается, что связывание таких соединений происходит независимо в двух открытых субъединицах. Был исследован 2-гуанидинобензотиазол (GBTA, соединение [2] на рисунке 1a). Ранее было показано, что он ингибирует Hv1 почти так же эффективно, как 2GBI, при тестировании в концентрации 200 мкМ (рис. 1b). Мы исследовали другие производные тиазола и обнаружили, что некоторые из них ингибируют канал с такой же или большей эффективностью, чем GBTA (рис. 1 и дополнительные сведения). текст). Мы определили кривые реакции концентрации четырех производных тиазола (GBTA и соединений [3], [6] и [11], рис. 1в) и обнаружили, что они более крутые, чем у 2GBI. Коэффициенты Хилла (h) производных тиазола колебались от 1,109 ± 0,040 до 1,306 ± 0,033 (рис. 1c и дополнительный рисунок 1). Напротив, коэффициент Хилла для 2GBI составлял 0,975 ± 0,024 29, рис. 2a и дополнительный рисунок 1). Коэффициент Хилла выше 1 указывает на кооперативность связывания. Поскольку каждая субъединица Hv1 имеет свой собственный ингибитор- сайт связывания,29,32 мы пришли к выводу, что связывание производного тиазола с одной субъединицей может усилить связывание второй молекулы ингибитора с соседней субъединицей. GBTA было тестируемым соединением с самым высоким коэффициентом Хилла. Поэтому мы выбрали это соединение для дополнительно изучили механизм синергического связывания и использовали 2GBI в качестве эталонного отрицательного контроля. (a) Тестируемые соединения: [1] Эталонный ингибитор Hv1 2-гуанидинобензимидазол (2GBI).[2] 2-гуанидинобензотиазол (ГБТА), [3] (5-трифторметил-1,3-бензотиазол-2-ил)гуанидин, [4] нафто[1,2-d][1, 3] Тиазол-2-ил -гуанидин, [5](4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин, [6](5-бром-4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин, [7] фамотидин, [8] этиловый эфир 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоновой кислоты, [9] 2-гуанидино-4-метилэтил-1,3-тиазол-5-карбоксилат, [10 ](2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)этилацетат, [11]1-[4-(4-хлорфенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин. (b) Ингибирование активности Hv1 человека указанными гуанидинотиазолами и эталонным соединением 2GBI (сине-зеленые столбцы) Токи протонов Hv1 измеряли во вывернутых бляшках ооцитов Xenopus в ответ на деполяризацию от удерживающего потенциала от -80 мВ до +120 мВ. Каждый ингибитор добавляли в ванну в концентрации 200 мкМ. pHi = pHo = 6,0. .Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n≥4). (c) Зависимое от концентрации ингибирование человеческого Hv1 соединениями [2], [3], [6] и [11]. Каждая точка представляет собой среднее ингибирование ± стандартное отклонение 3. до 15 измерений. Линия представляет собой аппроксимацию Хилла, используемую для получения кажущихся значений Kd, указанных в дополнительной таблице 1. Коэффициенты Хилла были определены на основе подгонок, представленных на дополнительном рисунке 1: h (1) = 0,975 ± 0,024 h (2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (см. «Методы»). (a,b) Соединения 2GBI и GBTA ингибировали димерный и мономерный Hv1 в зависимости от концентрации. Каждая точка представляет среднее ингибирование ± стандартное отклонение от 3 до 8 измерений, а кривая представляет собой аппроксимацию Хилла. Коэффициенты Хилла (h) показаны на рис. гистограммы-вставки были определены на основе подгонок, представленных на дополнительных рисунках 3 и 4. Реакция концентрации GBTA, показанная на (a), такая же, как и на рис. 1c. Видимые значения Kd см. в дополнительной таблице 1. (c) Моделирование кооперативное связывание GBTA с димерным Hv1. Сплошная черная линия представляет собой соответствие экспериментальным данным уравнением (6), которое описывает модель связывания, показанную в (d). Пунктирные линии, обозначенные Sub 1 и Sub 2, представляют бимолекулярную ассоциацию. - кривые равновесия диссоциации первого и второго актов связывания соответственно (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 мкМ; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 мкМ ).(d) Схематическая диаграмма предполагаемого механизма блока Hv1. В случае GBTA связывание с одной открытой субъединицей увеличивает сродство соседней открытой субъединицы (Kd2 Каналы Hv1 могут быть мономеризованы путем замены их N- и C-концевых цитоплазматических доменов соответствующими частями потенциал-чувствительной фосфатазы Ciona Intestinalis CiVSP (Hv1NCCiVSP)18,34. Мы измерили концентрационную зависимость ингибирования мономерного Hv1 GBTA и 2GBI и сравнили их с ингибированием димерного канала (дикого типа) (рис. 2a,b). Мы обнаружили, что разница в кооперативности связывания между двумя соединениями была устранена в мономерном Hv1, что подтверждает объяснение, что связывание GBTA с одной субъединицей увеличивает сродство другой субъединицы к ингибитору. Мы пришли к выводу, что связывание GBTA с одной субъединицей Hv1 может привести к перестановке сайта связывания (индуцируя fit35), что вызовет перестановку вакантного сайта связывания соседней субъединицы, что приведет к усилению связывания. близость. Для количественного описания кооперативного связывания GBTA с каналом мы использовали модель, в которой любая субъединица может связывать первую молекулу ингибитора в результате бимолекулярной реакции с константой диссоциации Kd1 (рис. 2в, Sub 1, OO+ B ⇆ BO*). Связывание приводит к тому, что канал переходит в состояние, в котором оставшиеся пустые субъединицы связываются с ингибитором в результате уникальной бимолекулярной реакции с константой диссоциации Kd2, где Kd2 0,05) снижение коэффициента Хилла связывания GBTA с каналами GGG по сравнению с диким типом (рис. 5c), что позволяет предположить, что, несмотря на его роль в сохранении две субъединицы вместе важны, но CCD напрямую не опосредует межсубъединичное аллостерическое сцепление между сайтами связывания GBTA. (а) Схематическая диаграмма димера Hv1 с триглициновой мутацией на внутреннем конце S4, предназначенной для нарушения межсубъединичного сцепления, опосредованного цитоплазматическим доменом спиральной спирали (синие стрелки). (b) Схематическое изображение димеров Hv1 и димеров лигирования с указанные мутации, предназначенные для проверки фрагментов S1, участвующих в соединении между субъединицами (синие стрелки). (c – h) 2GBI (голубой) и GBTA (темно-красный) ингибируют указанные конструкции в зависимости от концентрации. Каждая точка представляет собой среднее ингибирование. ± стандартное отклонение от 3 до 10 измерений. Кривая представляла собой аппроксимацию Хилла, используемую для получения видимых значений Kd (см. дополнительную таблицу 1). Коэффициенты Хилла в интерполированных гистограммах определялись, как описано в разделе «Методы» (см. дополнительные рисунки 3 и 4). Справочные значения h для Hv1 WT показаны пунктирными линиями. Звездочки указывают на статистически значимые различия между пассажами мутанта и WT (p 0,05, рис. 5d,i). ). С другой стороны, мутация D123A значительно снизила коэффициент Хилла GBTA (p 0,05/14). Поскольку нейтрализация заряда в положении 123 на обеих субъединицах привела к сильному изменению кооперативности связывания GBTA, а изменение заряда на обеих субъединицах дало лишь небольшой эффект, мы расширили анализ, включив в него только одну субъединицу с каналом инверсии заряда. Мы генерировали Hv1-связанные димеры с заменой D123R в C-концевой субъединице (рис. 5b) и измеряли ингибирование реакции концентрации с помощью GBTA и 2GBI. Мы обнаружили, что коэффициент Хилла связывания GBTA с каналами WT-D123R был значительно выше, чем у Hv1 дикого типа (p 0,05). Мы также обнаружили, что в отсутствие βME коэффициент Хилла связывания GBTA с димером D112E I127C Hv1 был значительно выше, чем измеренный в присутствии восстанавливающих агентов (рис. 6e и дополнительный рисунок 4), подразумевая, что мутация D112E не отменял увеличение кооперативности связывания GBTA в результате перекрестного связывания цистеина 127. На коэффициент Хилла связывания 2GBI с димерами D112E, I127C Hv1 мутация D112E также существенно не влияла (рис. 1).6d и дополнительные рис. 3). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что связывание GBTA усиливается за счет взаимодействия между внешними концами фрагментов S1 в соседних субъединицах Hv1 посредством притягивающих электростатических взаимодействий или за счет образования ковалентных связей между замещенными цистеинами. Аллостерическое связывание между сайтами увеличивается и приводит к кооперативности связывания. Хотя влияние притягивающих электростатических взаимодействий на кооперативность можно устранить мутацией D112E, влияние ковалентных связей не может. В нашем исследовании химического пространства, доступного для связывания производных гуанидина с каналами Hv1, мы обнаружили, что 2-гуанидинотиазолы, такие как GBTA, имеют более крутую концентрационную зависимость, чем 2-гуанидинобензимидазолы (рис. 1c). Анализ коэффициента Хилла связывания GBTA с обоими димерными и мономерным каналам (рис. 2а, б), а также к димерному каналу, в котором одна субъединица была предварительно связана с ингибитором (рис. 4), привели нас к выводу, что ингибирование Hv1 GBTA является синергическим процессом, и Сайты связывания соединений в двух субъединицах аллостерически связаны. Обнаружение, что GBTA связывается с открытым каналом, как показано ранее для связанного соединения 2GBI32, предполагает, что аллостерическая связь может быть специально оценивается в модели открытого состояния. был способен количественно описать ингибирование HV1 с помощью GBTA (Fig. 2C) и объяснить различные эффекты 2GBI и GBTA на распад канальных хвостовых токов после реполяризации мембраны, что подтверждает нашу интерпретацию процесса связывания. Максимальный коэффициент холма, который может быть достигнут в аллостерическом белке с двумя сайтами связывания (такими как HV1), составляет 2. Мы измерены GBTA, чтобы связывать HV1 дикого типа с коэффициентом 1,31, который увеличился до 1,88 в HV1 I127C. Синергическая свободная энергия, разница между свободными энергиями связывания самых низких и самых высоких сродственных сайтов (см. Методы), составляла 1,3 ккал/моль в случае HV1 дикого типа и 2,7 ккал/моль в случае HV1 I127C. кислорода до гемоглобина является наиболее известным и хорошо изученным примером совместного процесса38. Для гемоглобина человека (тетрамер с четырьмя аллостерически связанными сайтами связывания) коэффициент холма варьируется от 2,5-3,0, со значениями от 1,26 до 3,64 коэффициент холма от 2,5 до 3, KCAL/MOL, в зависимости от экспериментальных условий38. Таким образом, с точки зрения глобальной энергетики, кооперативность связывания GBTA с HV1 существенно не отличается от связывания O2 с гемоглобином, когда рассматривается различное количество субъединиц белка в двух системах. В нашей модели синергии связывание молекул GBTA с одной субъединицей приводит к увеличению аффинности связывания соседней субъединицы. Мы предполагаем процесс, в котором перегруппировка среды связывания, возникающая в результате первого события связывания (индуцированное соответствие) Изменения в взаимодействии между субъединицами. В ответ на эти изменения смежные субъединицы изменяют свои сайты связывания, что приводит к более плотному связыванию GBTA. В соответствии с этим процессом S1 Aspartate D112 отвечает за перегруппировку сайта связывания, связанного с повышенной аффинностью связывания.d112. Ранее было показано, что является частью пути проникновения протона HV1 и выступать в качестве фильтра селективности 27,28. Наши результаты показывают, что фильтры селективности в двух субъединицах HV1 аллостерически связаны в открытом состоянии. На рисунке 7A показано приблизительное местоположение сайта связывания GBTA и местоположение остатков D112, D123, K125 и I127 на схеме на основе VSD HV1, D123, K125 и I127 на основе VSD VSD. На кристаллической структуре химеры HV1-CIVSP. Разжиевые направления для аллостерической связи, включающей внеклеточный конец S1, показаны черными стрелками. (a) Схема VSD. На основе кристаллической структуры химеры HV1-CIVSP, спиральные сегменты, как показано цилиндрическим. В этой конфигурации внутренний конец сегмента S4 объединяется с CCD (не показан). Прогнозируемые местоположения связанных GBTA показаны в виде серых овальных. В двух разных конфигурациях димера, как видно из внеклеточной стороны плоскости мембраны. На левой панели граница раздела димера образуется с помощью спирали S4. Ротация двух VSD 20 градусов по часовой стрелке вокруг оси, перпендикулярной мембранной плоскости, в сопровождении Разделение наружных концов двух спиралей S4 (пунктирные стрелки), создает расположение, показанное справа. В конфигурации димера, обнаруженной в кристаллической структуре 4G80. Положение P140 в CIVSP соответствует положению D123 в HV1. Наши результаты показывают, что отталкивающее электростатическое взаимодействие между остатками 123 (123D/123D или 123R/123R) связано с «нормальным» уровнем кооперативности связывания GBTA в открытом состоянии и смещает взаимодействие от отталкивания к привлечению (123D/123R). , повышенное сотрудничество (рис. 5G). Ожидается, что удаление отталкивающего взаимодействия с заменой аланина также приведет к повышению кооперативности. Однако снижение кооперативности димера 123a/123a (Fig. 5e). объяснение состоит в том, что дестабилизирующий эффект размещения гидрофобных остатков в гидрофильную среду может перевесить стабилизирующий эффект из -за устранения отталкивающих взаимодействий между остатками D123, что приводит к общему снижению кооперативности связывания. Mony et al.39 сообщила, что растворитель Положение D171 CIONA GUTIS CI-HV1 (соответствует D123 в HV1 человека) увеличивается при активации, подтверждая представление о том, что D123 находится в гидрофильной среде в открытом состоянии. Известно, что стробирование каналов HV1 происходит через множественные переходы19,20,26,39,40,41. Qiu и соавт. с последующим отчетливым переходом, который заставляет протоны открывать проводимость в обоих субъединицах. Конформационное изменение датчика напряжения контролировали флуоресценцией напряжения, и было обнаружено, что второй переход был избирательно нарушен мутацией в положении D171. Возмущение флуоресцентного сигнала согласуется с наличием электростатических взаимодействий между остатками D171 соседних субъединиц в какой -то точке вдоль координат реакции конформационных изменений. Эта интерпретация согласуется с нашим открытием, что остаток D123 электростатически взаимодействует в открытом состоянии. и опосредует аллостерическую связь между сайтами связывания GBTA. Fujiwara et al25 предположили, что граница раздела димер цитоплазматической спиральной катушки распространяется на мембрану, чтобы содержать две спирали S4 (рис. 7b, левая панель). Модель этого межсубнитного взаимодействия основана на анализе сшивания цистеина. Весь VSD и функциональный анализ области, соединяющей спираль S4, и CCD.in В отсутствие трансмембранного градиента pH, каналы HV1 требуют, чтобы значительная мембранная деполяризация была открыта, а сшивание цистеина происходит в условиях, когда канал преимущественно закрыт. Следовательно, обнаруженный интерфейс S4-S4, вероятно, отражает конфигурацию субъединиц вне состояния. Другие исследования обнаружили доказательства участия S1 и S2 в межсубъединичных взаимодействиях во время стробирования17,21,26, что позволяет предположить, что каналы могут применять различные конфигурации субъединицы в открытом и открытом Закрытые состояния, идея, соответствующая выводам Mony et al. S1 движется 39 во время стробирования. Здесь мы показываем, что в открытом состоянии внеклеточные концы спирали S1 достаточно близки, чтобы поддерживать прямые электростатические взаимодействия, которые опосредуют аллостерическую связь между субъединицами. В конфигурации димера с расширенными взаимодействиями S4-S4 спирали S1 слишком далеко Помимо друг друга взаимодействовать непосредственно. Тем не менее, 20-° вращение двух субъединиц VSD вокруг оси, перпендикулярной плоскости мембраны, в сочетании с разделением внешних концов двух спиралей S4, дала согласованность конфигурации S1-S1. с нашими выводами (рис. 7b, правая панель). Мы рекомендуем эту конфигурацию для канала в открытом состоянии. Хотя, как полагают, фермент CivSP функционирует как мономер, кристаллическая структура его изолированного VSD фиксируется в состоянии димера. Внешние концы спиралей S1 в этом димеме пространственно близко друг к другу, а общая конфигурация аналогична предложению. Для HV1 (Fig. 7C). В димере CIVSP ближайшим остатком из соседней субъединицы был пролин в положении 140 (рис. 7C). Интересно, что p140 в CIVSP соответствует положению D123 в HV1. Сходство в конфигурации субъединицы между HV1 и димеры CivSP предполагают, что VSD этих белков имеют внутреннюю тенденцию образования границы раздела, где взаимодействуют внеклеточные концы S1. Основная роль HV1 в активации сперматозоидов делает этот канал привлекательной лекарственной мишенью для контроля мужской фертильности. Переялось, что активация HV1 в микроглии было показано, что ухудшается восстановление после ишемического инсульта. Обнаруженная активность HV1 была связана с более низким Выживаемость у пациентов с грудью 12 или колоректального рака 13 и, как полагают, способствует злокачественным новообразованиям B-клеток 11. Таким образом, мелкие молекулярные препараты, нацеленные на HV1 Открытая субъединица HV1, приводящая к повышению аффинности связывания, может привести к развитию более сильных лекарств, нацеленных на каналы HV1. Участок, направленный на сайт мутагенеза человеческого HV1, проводили с использованием стандартных методов ПЦР. В конструкции HV1NCCIVSP, остатки 1-96 и 228-273 HV1 были заменены остатками 1-113 и 240-576 CivSP18.in HV1-Linked Dimer, димер HV1, димер HV1, димеру, связанный с HV1, димер HV1, склонный HV1, димер HV1, димеризацию HV1, привязанный к HV1, димери С-конце одной субъединицы связан с N-конце второй субъединицы через линкер GGSGGSGGSGSGGSGGGGGGG. Пжгемхе-плазмиды, содержащие различные конструкции, были линеаризированы с помощью ограничения NHE1 или SPH1 (новая Англия биол) и РНК были выполнены с помощью с помощью энзирования новой Англии) и РНК T7 MMESSAGE MMACHINE TRANSCTRIPTION CAT (AMBION) .1-3 дня до электрофизиологических измерений вводили в ооциты ксенопуса (50 нл на клетку, 0,3-1,5 мкг/мкл). Стадия V и VI ооциты из Xenopus laevis (NASCO) были получены. Из биологии экоцитов. Следующая инъекция РНК, клетки поддерживали в среде ND96, содержащей 96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl, 1 мм MgCl, 10 мМ HEPES, 5 мМ пируват, 100 мкг/мл гентамицин, pH 7,2 18 ° C, 5 мм, 100 мкг/мл гентамицин, pH 7,2 18 ° C. . 2-guanidino-benzimidazole [1], 2-гуанидино-бензотиазол [2], (4-метил-1,3-тиазол-2-ил) гуанидин [5], (5-бром-4-метил-1,3 -Тиазол-2-ил) гуанидин) [6], этил 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилат [8], этил 2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол- 5-карбоксилат [9] и (2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил) этилацетат [10] был от сигма-Альдриха. Фамотидин [7] был от MP Biomedicals.1- [4 -(4-хлорфенил) -1,3-тиазол-2-ил] гуанидин [11] и 1- [4- (3,4-диметоксифенил) -1,3- Тиазол-2-ил] Гуанидин [12] был Из Matrix Scientific. Эти соединения имеют наибольшую чистоту, коммерчески доступную. Они растворяли в сухом DMSO, чтобы генерировать раствор 100 мМ, который затем разбавляли в растворе записи при желаемой конечной концентрации. не менее 99% чистота. К суспензии 2-амино-4- (трифторметил) бензол-гидрохлорид (1,02 г, 4,5 ммоль) в 25 мл водной соляной кислоты (2,5 н). Добавлял твердый дициандиамид (380 мг, 4,5 ммоль), и в результате гетерогенной смеси (380 мг, 4,5 ммоль) и полученная гетерогенная смесь (380 мг, 4,5 ммоль) и полученная гетерогенная смесь (380 мг, 4,5 ммоль), и в результате с обратным холодильником с энергичным перемешиванием в течение 4 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и нейтрализовали постепенным добавлением 10N -гидроксида калия. Факулируют белый осадок, промывали холодной водой (3 × 50 мл), высушивали в печи ( 65 ° C) в течение нескольких часов, а затем перекристаллизован из этилацетатного/нефтяного эфира, чтобы получить белое твердое вещество (500 мг, 48 %); MP 221–222 ° C (свет 225–226 ° C) 45; 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7,25 (очень широкий S, 4 H), 7,40 (D, 1 H, J = 8,1 Гц), 7,73 (S, 1 H), 7,92 (D , 1 H, J = 8,1 Гц) .13C Ямр (200 МГц, DMSO-D6): Δ = 114,2 (D, J = 3,5 Гц), 117,5 (D, J = 3,5 Гц), 121,7, 124,6 (Q, J = 272 Гц), 126,1 (Q, J = 272 Гц) = 31,6 Гц), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.HRMS (ESI): M/Z Расчеты. : 261.0419. Нафто [1,2-D] тиазол-2-амин (300 мг, 1,5 ммоль), синтезированный, как описано ранее, нагревали до 200 ° С в масляной ванне в небольшой пробирке. 300 мг (большой избыток) цианамид и цианамид и цианамид и цианамид. 1,0 мл концентрации. В горячее соединение быстро добавляли соляную кислоту, а смесь хранилась в масляной бане в течение примерно 2 минуты, в течение которых большая часть воды испарялась. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и полученным затвердевшим материалом. был разбит на мелкие кусочки и промыта водой, чтобы обеспечить бледно-желтое аморфное твердое вещество. (38 мг, 10%) Мп 246-250 ° C; 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (T, 1 H, J = 8,2 Гц), 7,66 (T, 1 H, J = 8,3 Гц), 7,77 (D, 1 ч. , J = 8,6 Гц), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Гц), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Гц), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Гц) .13C ЯМР (150 MHZ, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.HRMS (ESI): M/Z Расчеты. , найдено: 243.0704. Протонные токи измеряли во внутренних и внешних пятнах ооцитов, экспрессирующих различные конструкции с использованием усилителя AxoPatch 200b, контролируемого аксоном Digidata 1440a (молекулярные устройства) с программным обеспечением Pclamp10. Интраклеточные и внеклеточные растворы имеют одинаковую композицию: 100 мм 2- (n-morpholin ) этатансульфокислота (MES), 30 мМ тетраэтиламмония (чай) мезилат, 5 мМ хлорид чая, 5 мМ этиленгликоль-бис (2-аминоэтил) -n, n, n ', н'тетрауксусная кислота (EGTA), адаптированная к PH 6,0 с гидроксидом чая. Все измерения проводили при 22 ± 2 ° C. Пипетка имеет сопротивление доступа 1,5–4 МОм. Тропиды тепловых отборов отфильтровали при 1 кГц, отображали при 5 кГц и анализировали с помощью зажима10,2 (молекулярные устройства. ) и Origin8.1 (OriginLab). Растворы, содержащие различные концентрации ингибитора HV1, и в некоторых случаях 10 мМ βME были введены в ванну путем гравитации с помощью коллектора, соединенного с системой перфузионных клапанов VC-6 (Warner Instr.), Которое было передано через программное обеспечение PCLAMP (Transistor- Транзисторная логика) Сигналы. Эксперименты по перфузии в области перфузии проводили с использованием перфузионного карандаша с несколькими трубками (Automate Sci.) С наконечником доставки диаметром 360 мкм, установленным перед патч +120 МВ деполяризующий импульс. Измерения GV проводили, как описано ранее18,20. Хвостые токи регистрировали при -40 мВ после стадий деполяризации при разных напряжениях от -20 мВ до +120 мВ, если не указано иное. Спортивный импульс, предшествующий тестируемому импульсу, является Используется для коррекции для затухания тока 18. График GV соответствует уравнению Больцмана: кажущиеся константы диссоциации (KD) для различных комбинаций каналов и ингибиторов (дополнительная таблица 1) определяли путем подгонки зависимости концентрации ингибирования (средние %ингибирует значения)) С уравнением холма: где [i] является концентрацией ингибитора I и H является коэффициентом холма. Чтобы рассчитать коэффициент холма, уравнение (2) переставляется как: