Испитивање интерподјединичног интерфејса отвореног Хв1 протонског канала са алостерично спрегнутом сондом

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за ЦСС. За најбоље искуство, препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или искључите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у). У међувремену, да бисте осигурали наставак подршке, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а. Хв1 напонски протонски канал је димерни комплекс који се састоји од два домена осетљива на напон (ВСД), од којих сваки садржи пут протонске пермеације са гатираним протоном. Димеризацију контролише цитоплазматски цоиллед-цоил домен. Прелазак из затвореног стања у познато је да се отворено стање у оба ВСД-а јавља кооперативно; међутим, мало се зна о основним механизмима. Интерфејси међујединица играју кључну улогу у алостеријским процесима; међутим, такви интерфејси нису идентификовани у отвореним Хв1 каналима. Овде показујемо да деривати 2-гванидинотиазола блокирају два Хв1 ВСД на кооперативан начин и користе једно од ових једињења као сонду за алостерично спајање између отворених подјединица. Открили смо да је екстрацелуларно крај првог трансмембранског фрагмента ВСД формира међуподјединични интерфејс који посредује у спајању између места везивања, док домен намотаног калема није директно укључен у овај процес. Такође смо пронашли јаке доказе да протонски селективни филтер канала контролише кооперативност везања блокатора . Напонски протонски канали играју важну улогу у различитим организмима, од фитопланктона до људи1. У већини ћелија, ови канали посредују изливање протона из протонске мембране и регулишу активност НАДПХ оксидазе. Једини познати протонски канал зависан од напона код људи је Хв1, који је производ ХВЦН1 гена2,3. Показало се да Хв1 (ака ВСОП) игра улогу у пролиферацији Б ћелија4, производњи реактивних врста кисеоника од стране урођеног имуног система5,6,7,8, сперматозоида покретљивост9 и регулација пХ површинске течности дисајних путева10. Овај канал је укључен у неколико прекомерно изражених типова карцинома као што су малигни тумори Б-ћелија4,11 и карцином дојке и колоректалног карцинома12,13. Утврђено је да прекомерна активност Хв1 повећава метастатски потенцијал ћелија рака 11, 12. У мозгу је Хв1 експримиран микрогијом, а показало се да његова активност погоршава оштећење мозга на моделима исхемијског можданог удара. Протеин Хв1 садржи домен осетљив на напон (ВСД), који се састоји од четири трансмембранска сегмента названа С1 до С414. ВСД подсећа на одговарајуће домене напонско-зависних На+, К+ и Ца2+ канала и фосфатаза осетљивих на напон, као што је ЦиВСП из Циона гутис15. У овим другим протеинима, Ц-терминус С4 је везан за ефекторски модул, домен пора или ензим. У Хв1, С4 је везан за домен намотаног намотаја (ЦЦД) који се налази на цитоплазматској страни мембране Канал је димерни комплекс који се састоји од два ВСД-а, од којих сваки садржи пут протонске пермеације затвореног типа16,17,18. Утврђено је да се ове две Хв1 подјединице отварају кооперативно19,20,21,22, што сугерише да алостерично спајање и интеракције међу подјединицама играју важну улогу у процесу гајтинга. Интерфејс између подјединица унутар домена намотаног калема је добро дефинисан јер су кристалне структуре два изолована домена доступне22,23. С друге стране, интерфејс између ВСД унутар мембране није добро схваћена. Кристална структура химерног протеина Хв1-ЦиВСП не пружа информације о овом интерфејсу, пошто тримерна организација комплекса кристализованог канала може да буде резултат замене природног Хв1 ЦЦД-а квасац леуцинским патент затварачем ГЦН424. Недавна студија организације подјединица канала Хв1 закључила је да две спирале С4 прелазе у ЦЦД без озбиљног нарушавања секундарне структуре, што резултира дугим спиралама које почињу од мембране и пројектују се у цитоплазму. На основу анализе унакрсног повезивања цистеина, ова студија предлаже да Хв1 ВСД-ови контактирају једни друге дуж сегмента С4. Међутим, друге студије су предложиле алтернативне интерфејсе између ВСД-ова. Ови интерфејси укључују С1 сегменте 17, 21, 26 и спољне крајеве С2 сегмента 21. Могући разлог за конфликт резултати ових студија су да је алостерична спрега између ВСД-а испитивана у односу на процес гајтинга, који зависи од затвореног и отвореног стања, а интерфејс између ВСД-а може варирати у различитим променама стања у конформацији. Овде смо открили да 2-гванидинотиазол инхибира Хв1 канале синергистичким везивањем за два отворена ВСД-а и користили смо једно од једињења, 2-гванидинобензотиазол (ГБТА), да испитамо интеракцију између подјединица у отвореном стању. Открили смо да се крива везивања ГБТА може добро описати квантитативним моделом у којем везивање инхибитора за једну подјединицу резултира повећањем афинитета везивања суседне подјединице. Такође смо открили да остаци Д112, филтери селективности за канал 27, 28 и део везивног места 29 деривата гванидина контролишу кооперативност везивања ГБТА. Показали смо да се кооперативно везивање одржава у Хв1 димеру, где се ЦЦД одваја од сегмента С4, што сугерише да интерфејс између подјединица у ЦЦД-у није директно посредују алостерично спајање између ГБТА-везујућих места. Насупрот томе, налазимо да је С1 фрагмент део интерфејса између подјединица и предлажемо распоред суседних ВСД са екстрацелуларним крајем С4 хеликса удаљеним од центра димера како би се омогућило фрагмент С1 да буде у отвореном стању. Инхибитори малих молекула Хв1 корисни су као лекови против рака и неуропротективни агенси. Међутим, до данас, неколико једињења је било у стању да инхибира канал 30,31,32,33. Међу њима, 2-гванидинобензимидазол (2ГБИ, једињење [1] на Сл. 1а) и његових деривата је утврђено да блокирају ВСД29,32 продирање протона кроз канал. Сматра се да се везивање таквих једињења одвија независно у две отворене подјединице. 2-гванидинобензотиазол (ГБТА, једињење [2] на слици 1а). претходно је показано да инхибира Хв1 скоро једнако ефикасно као 2ГБИ када је тестиран при концентрацији од 200 μМ (Слика 1б). Испитали смо друге деривате тиазола и открили да неки од њих инхибирају канал са сличном или већом снагом од ГБТА (Слика 1 и Додатак). текста). Одредили смо криве концентрацијског одговора четири деривата тиазола (ГБТА и једињења [3], [6] и [11], слика 1ц) и открили да су оне стрмије од оних код 2ГБИ. Хилови коефицијенти (х) деривата тиазола кретао се од 1,109 ± 0,040 до 1,306 ± 0,033 (Сл. 1ц и допунска слика 1). Насупрот томе, Хилл коефицијент за 2ГБИ је био 0,975 ± 0,024 29, слика 2а и додатна слика 1). Хилл коефицијент изнад 1 указује на кооперативност везивања. Пошто свака подјединица Хв1 има свој инхибитор- место везивања,29,32 закључили смо да би везивање деривата тиазола за једну подјединицу могло побољшати везивање другог молекула инхибитора за суседну подјединицу. ГБТА је било тест једињење са највишим Хиловим коефицијентом. Због тога смо изабрали ово једињење за даље проучавају механизам синергије везивања и користи 2ГБИ као референтну негативну контролу. (а) Тест једињења: [1] Референтни инхибитор Хв1 2-гванидино-бензимидазол (2ГБИ).[2] 2-гванидино-бензотиазол (ГБТА), [3] (5-трифлуорометил-1,3-бензотиазол-2-ил)гванидин, [4] нафто[1,2-д][1,3] тиазол-2-ил -гванидин, [5](4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гванидин, [6](5-бромо-4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гванидин, [7] фамотидин, [8] етил естар 2-гванидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилне киселине, [9] 2-гванидино-4-метил етил-1,3-тиазол-5-карбоксилат, [10 ](2-гванидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)етил ацетат, [11]1-[4-(4-хлорофенил)-1,3-тиазол-2-ил]гванидин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гванидин. (б) Инхибиција активности хуманог Хв1 назначеним гванидинотиазолима и референтним једињењем 2ГБИ (плаво-зелене траке) .Хв1 протонске струје мерене су у плаковима изнутра напоље Ксенопус ооцита као одговор на деполаризацију са потенцијала задржавања од -80 мВ до +120 мВ. Сваки инхибитор је додат у купатило у концентрацији од 200 μМ.пХи = пХо = 6,0 .Подаци су средња вредност±СЕМ (н≥4).(ц) Инхибиција хуманог Хв1 зависна од концентрације једињењима [2], [3], [6] и [11].Свака тачка представља средњу инхибицију ± СД од 3 до 15 мерења. Линија је уклапање по брду која се користи за добијање очигледних вредности Кд приказаних у додатној табели 1. Хил коефицијенти су одређени из уклапања пријављених на додатној слици 1: х(1) = 0,975 ± 0,024 х(2) = 1,306 ± 0,033, х(3) = 1,25 ± 0,07, х(6) = 1,109 ± 0,040, х (11) = 1,179 ± 0,036 (видети Методе). (а,б) Једињења 2ГБИ и ГБТА су инхибирала димерни и мономерни Хв1 на начин зависан од концентрације. Свака тачка представља средњу инхибицију ± СД од 3 до 8 мерења, а крива одговара Хиллу. Хилл коефицијенти (х) приказани на уметнути хистограми су одређени из уклапања пријављених на додатним сликама 3 и 4. Концентрациони одговор ГБТА приказан на (а) је исти као онај на слици 1ц. Види додатну табелу 1 за очигледне вредности Кд. (ц) Моделирање кооперативно везивање ГБТА за димерни Хв1. Пуна црна линија представља уклапање у експерименталне податке помоћу једначине (6), која описује модел везивања приказан у (д). Испрекидане линије означене Суб 1 и Суб 2 представљају бимолекуларну асоцијацију -криве равнотеже дисоцијације првог и другог догађаја везивања, респективно (Суб 1: ОО + Б ⇄ БО*, Кд1 = 290 ± 70 μМ; Суб 2: БО* + Б ⇄ Б*О*, Кд2 = 29,3 ± 2,5 μМ ).(д) Шематски дијаграм предложеног механизма Хв1 блока. У случају ГБТА, везивање за једну отворену подјединицу повећава афинитет суседне отворене подјединице (Кд2 0,05) смањење Хилл коефицијента везивања ГБТА за ГГГ канале у поређењу са дивљим типом (слика 5ц), што указује на то да упркос његовој улози у одржавању. две подјединице заједно су важне, али ЦЦД не посредује директно међуподјединичном алостеричном спајању између ГБТА места везивања. (а) Шематски дијаграм Хв1 димера са мутацијом триглицина на унутрашњем крају С4 дизајнираног да поремети спајање међуподјединица посредовано цитоплазматским намотаним доменом (плаве стрелице). (б) Шематски приказ Хв1 димера и лигационих димера са назначене мутације, дизајниране да тестирају С1 фрагменте укључене у спајање између подјединица (плаве стрелице). (ц–х) 2ГБИ (цијан) и ГБТА (тамно црвена) инхибирају назначене конструкте на начин зависан од концентрације. Свака тачка представља средњу инхибицију ± СД од 3 до 10 мерења. Крива је била уклапање по Хилу коришћено за добијање очигледних вредности Кд (видети додатну табелу 1). Хилл коефицијенти у интерполираним хистограмима су одређени како је описано у одељку Методе (види додатне слике 3 и 4). Референтне вредности х за Хв1 ВТ су приказани као испрекидане линије. Звездице означавају статистички значајне разлике између мутантних и ВТ пасуса (п 0,05, слика 5д,и) ). С друге стране, мутација Д123А значајно је смањила Хилл коефицијент ГБТА (п 0,05/14). Пошто је неутрализација наелектрисања на позицији 123 на обе подјединице резултирала снажном променом кооперативности везивања ГБТА, док је преокретање наелектрисања на обе подјединице имало само мали ефекат, проширили смо анализу тако да укључимо само једну подјединицу са инверзионим каналом наелектрисања. генерисали димере повезане са Хв1 са супституцијом Д123Р у Ц-терминалној подјединици (слика 5б) и измерили инхибицију концентрацијског одговора од стране ГБТА и 2ГБИ. Открили смо да је Хилл коефицијент ГБТА везивања за ВТ-Д123Р канале био значајно већи од оног дивљег типа Хв1 (п 0,05). Такође смо открили да је у одсуству βМЕ Хилл коефицијент ГБТА везивања за Д112Е И127Ц Хв1 димер био значајно већи од оног измереног у присуству редукционих агенаса (слика 6е и додатна слика 4), што имплицира да је мутација Д112Е није укинуо повећање кооперативности везивања ГБТА које је резултат унакрсног повезивања цистеина 127. Хил коефицијент везивања 2ГБИ за Д112Е, И127Ц Хв1 димере такође није био значајно под утицајем Д112Е мутације (Слика 1).6д и допунски. Слика 3). Узети заједно, ови налази сугеришу да је ГБТА везивање појачано интеракцијом између спољних крајева С1 фрагмената у суседним Хв1 подјединицама кроз атрактивне електростатичке интеракције или кроз формирање ковалентних веза између супституисаних цистеина Алостерично спајање између места се повећава и резултира кооперативношћу везивања. Док се ефекат привлачних електростатичких интеракција на кооперативност може укинути мутацијом Д112Е, ефекат ковалентних веза не може. У нашем истраживању хемијског простора доступног за везивање деривата гванидина за Хв1 канале, открили смо да 2-гванидинотиазоли попут ГБТА имају већу зависност од концентрације од 2-гванидинобензимидазола (слика 1ц). Анализа Хиловог коефицијента везивања ГБТА за оба димера и мономерних канала (слика 2а,б) и димерног канала у којем је једна подјединица била претходно везана за инхибитор (слика 4) довели су до закључка да је инхибиција Хв1 од стране ГБТА Акција синергистички процес, и места везивања једињења у две подјединице су алостерично спрегнута. Откриће да се ГБТА везује за отворени канал, као што је претходно показано за сродно једињење 2ГБИ32, сугерише да се алостерично спајање може посебно проценити у отвореном стању. Наш модел кооперативног везивања је био у стању да квантитативно описује инхибицију ХВ1 ГБТА (Сл. 2Ц) и објасни различите ефекте 2ГБИ и Гбта на пропадање каналних репних струја након мембранске реполације, који подржава нашу интерпретацију процеса везивања. Максимални коефицијент брда који се може постићи у алостеричном протеину са две веб локације за везивање (као што је ХВ1) је 2. Мери се ГБТА за везу ХВ1 Вилд тип са коефицијентом 1,31, који је повећан на 1,88 у ХВ1 и128Ц. Синергистичка бесплатна енергија, разлика између везујућих слободних енергија најнижих и највиших локација афинитета (види методе), била је 1,3 кцал / мола у случају ХВ1 дивљег типа и 2,7 кцал / мола у случају ХВ1 И127Ц. кисеоника до хемоглобина је најпознатији и добро проучен пример колаборативног процеса38. за хумани хемоглобин (тетрамер са четири алостерично повезане са везом), коефицијент брда се креће од 2.5-3.0, са вредностима од 2,5-3,0, са вредностима од 2,5-3,0, са вредностима од 1,25 до 3,64. КЦАЛ / МОЛ, у зависности од експерименталних услова38.ТХ, у погледу глобалне енергетике, кооперативност везујућег ГБТА-а за ХВ1 није битно различито од оног везу О2 за хемоглобин када се разматра различит број протеинских подјединица у два система. У нашем синергији моделу, везивање молекула ГБТА-а на један подјединицу резултира повећањем везујућих афинитета суседне подјединице. Замисивимо процес у којем је преуређивање везивног окружења произшао из првог везивног догађаја (изазвани фит) Промјене у интеракцијама између подјединице.ин Одговор на ове промене, суседни подјединице мењају своје везивање, што је резултирало чвршћем везом ГБТА-а, С1 Аспартате Д112 је одговоран за преуређивање сајта везивања повезаности са повећањем везујућег афинитета.Д112 Раније је показано да је део пута прокопирања ХВ1 протока и да делује као филтер селективности27,28. Наши резултати показују да су филтри за селективност у две ХВ1 подјединице алостерично повезани у отвореном стању. Фигуре 7а Приказује приближно место везујућег места ГБТА и локацију остатака Д112, Д123, К125 и И127 на шеми ХВ1 ВСД-а На кристалној структури ХВ1-ЦИВСП ЦХИМЕРА.СУГГЕСТИРАНИ СМЕРАКТИ ЗА АЛЛОСоСТЕРИЧКО СПОЗИВАЊЕ УКЉУЧЕНО ИЗВРШЕЊЕ ЕНКАСЕЉЕНОГ КРАЈ С1 приказани су црним стрелицама. (а) Схема ХВ1 ВСД.Басирана на кристалној структури Цхимера ХВ1-ЦИВСП-а, спирални сегменти су приказани цилиндричним. У овој конфигурацији, унутрашњи крај С4 сегмента спаја се са ЦЦД-ом (није приказано). Предвиђене локације везане ГБТА приказане су као Греи овалс.блацк стрелице означавају путеве који су укључени у алостерично спајање између везујућих локација у два суседна подјединице. Положаји истражених С1 остатака су обележени обојеним сферама. (Б) схематске илустрације распоређених са шематским илустрацијама. У две различите димер конфигурације као што се види из екстраћелијске стране мембранске планете.Он леве плоче, димерни интерфејс формира СХ-ов хелик.Ротација два ВСДС 20 степени у смеру казаљке на сату око осе окомитве на мембранским авионом, пратећи Одвајање спољних крајева две С4 хелике (испрекидане стрелице), производи аранжман приказан десно од ове конфигурације, остаци Д123 и И127 са суседних подјединицама да се приближе заједно. (ц) Схематски приказ ЦИВСП ВСД У димеричкој конфигурацији која се налази у 4Г80 кристално структури.Поситион П140 у ЦИВСП одговара позицији Д123 у ХВ1. Наши резултати показују да је одбојна електростатичка интеракција између остатака 123 (123Д / 123Д или 123Р / 123Р) повезана са "нормалним" нивоом кооперативности у отвореном стању и премешта интеракцију од одбијања (123Д / 123Р) , повећана сарадња (Сл. 5Г) .ит се очекује да ће отклањање одбојне интеракције са супституцијом аланина такође довести до повећане кооперативности. Посматрано је смањење кооперативности димер 123А / 123А (Сл. 5е). Објашњење је да дестабилизујући ефекат постављања хидрофобних остатака у хидрофилном окружењу може надмашити стабилизујући ефекат због елиминације одбојних интеракција између Д123 остатака, што резултира укупним смањењем везивне сарадње на то да је недавно приступачност растварача Позиција Д171 Циона ГУТИС ЦИ-ХВ1 (одговарајући Д123 у људском ХВ1) повећава се након активирања, подржавајући појам да се Д123 налази у хидрофилном окружењу у отвореном стању. Познато је да се види ХВ1 канала јавља се кроз више прелаза19,20,26,39,40,41.26,39,40,41.КИУ и АЛ26, на основу мембранског деполаризације, сензор напона ЦИ-ХВ1 подвргнут конформацијској промјени која напушта канал активирајући, али и даље је затворен , након чега слиједи различит транзиција која узрокује да протони отворене проводљивости у оба субнитама. Конформациона промена сензора напона је надгледала флуоресценција стезаљке напона и откривено је да је друга транзиција била селективно узнемирена мутацијом на положају Д171. Пертурбација флуоресцентног сигнала у складу је са присуством електростатичких интеракција између остатака д171 у неким тачкама координата реакције у коорганизацији конформационе промјене. Ова тумачења је у складу са нашим проналажењем да су остаци Д123 Електростатички интерпретише у отвореном стању и посредује алостерично спајање између веб локација за везивање ГБТА. Фујивара и АЛ25 предложио је да се димер интерфејс цитоплазматског домене простире у мембрану да садрже две С4 хелике (Сл. 7б, леви панел) .А Модел ове интерсебунит интеракције заснива се на цистеине системирању прекривања цистеине Читава ВСД и функционална анализа региона који повезују С4 Хеликс и ЦЦД.Ин одсуство трансмбрене пХ градијента, ХВ1 канали захтевају да се отвори значајна мембрана деполаризација, а цистеински умрежавање настаје под условима где је канал претежно затворен. Стога је откривени С4-С4 интерфејс вероватно одражавао конфигурација ван-државе. ОТОКЕ СТУДИЈЕ су пронашле доказе за укључивање С1 и С2 у интеракције ИНТЕРСУБУНИТ-а током гатинг17,21,26 сугерирајући да канали могу да усвоје различите конфигурације подјединице на отвореном и Затворене државе, идеја у складу са налазима МОНИ ет ал. С1 креће 39 током камена. Овде показујемо да су у отвореном стању ванћелијски крајеви С1 Хелик-а довољно близу да подрже директне електростатичке интеракције које посредовала алостерично спајање између подјединице. У димеру конфигурацију са проширеним С1-С4 интеракцијама, С1 Хелике су предалеко осим једни од других да се директно комуницира. Каква је ротација двије ВСД у смеру казаљке начела око осе окомито на авиону мембране, у комбинацији са одвајањем спољних крајева две С4 хелике, дала је С1-С1 конфигурацију конфигурације доследне конфигурације С1-С1 Са нашим налазима (Сл. 7б, десни панел). Препоручујемо ову конфигурацију за канал у отвореном стању. Иако се сматра ЦИВСП ензимом да функционише као мономер, кристална структура њеног изолованог ВСД-а је заробљена у димерном стању. Спољни крајеви С1 хеликација у овом димеру су просторно блиски заједно, а укупна конфигурација је слична оној предложеној за ХВ1 (Сл. 7Ц). У Цивп-у Димер-у, најближи остатак из суседне подјединице био је пролин на положају 140 (Сл. 7Ц) .интестинг, П140 у ЦИВСП-у одговара позицији Д123 у ХВ1.Тилици у конфигурацији у подјединици у подјединици у подјединици у подјединици у подјединици у подјединици у подјединици конфигурације ХВ1 А ЦИВСП димери сугеришу да ВСДС од ових протеина имају унутрашњу тенденцију да формирају интерфејс где екстраћелијски завршеци С1 интеракције. Основна улога ХВ1 у активирању с спермит чини овај канал атрактиван циљ лека за контролу мушке плодности. Курверке, активирање ХВ1 у микроглију је приказано погоршаним опоравком од исхемијског удара. Рекао је да је утврђено да је на СМОЧНОМ ДАЉИНУ. Опстанак код пацијената са 11 или колоректалног карцинома 13 и сматра се да допринели малигниције Б-ћелија 11. Због тога, мали молекул дроге који циљају на ХВ1 могу се користити као неуропротективни агенти или антиканцерогеријски деривати могу да се одрекне гуанидинотхиазол деривати могу изазвати конформацијско преуређивање. Отворите подјединицу ХВ1, што доводи до повећаног афинитета везивања, може довести до развоја моћних лекова који циљају ХВ1 канале. Мутагенеза усмерене на сајту ХВВ-а изведена је помоћу стандардних ПЦР техника. У ХВ1НЦЦИВСП-у конструкцији, остаци 1-96 и 228-273 ХВ1 замењени су остацима 1-113 и 240-576 ЦИВСП18.У ТХЕ ХВ1 ДИМЕР ДИМЕР, Ц-крај једног подјединице повезан је са Н-крај другог подјединице преко ГГСГГГСГГСГСГГСГГ Линкер-а. ПГЕМХЕ плазмиди који садрже различите конструкције су линеаризовани са ензимима ограничења НХЕ1 или СПХ1 (Ново Енглеске Биолабс) и РНА синтеза је извршена Добијена је Т7 ммессаге Комплет за транскрипцију ммахина (Амбион) .1-3 дана пре електрофизиолошке мерења, ЦРНА је убризгавана у ксенопус ооците (50 НЛ по ћелији, 0,3-1,5 μг / μЛ). Стаге В и ВИ ооците из Ксенопуса Лаевис (Насцо) Из екоцита Биосциенце.Продајањење РНА ћелије су одржаване у медијуму НД96 који садржи 96 мм НаЦл, 2 мм КЦл, 1,8 мм ЦАЦЛ, 1 мм МГЦл, 10 мм ХЕПЕ, 5 мм пируват, 100 μг / мл гентамицин, пХ 7.2 18 ° Ц . 2-Гуанидино-Бензимидазол [1], 2-гуанидино-бензотиазол [2], (4-метил-1,3-тиазол-2-ил) ГУАНИДИНЕ [5], (5-бромо-4 -метил-1,3) (5-бромо-4 -метил-1,3) -Тхиазол-2-ил) ГУАНИДИНЕ) [6], етил 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилат [8], етил 2-гуанидино-4- метил-1,3-тиазоле- 5-карбоксилат [9] и (2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил) етил ацетат [10] били су из Сигма-Алдрицх.Фамотидине [7] било је од МП Биомедицалс.1- [4 - (4-хлорофенил) -1,3-тиазол-2-ил] ГУАНИДИНЕ [11] и 1- [4- (3,4-диметоксифенил) -1,3-тиазол-2-ил] ГУАНИДИНЕ [12] из матрикса научно-тока једињења су од највеће чистоће која је комерцијално доступна. Они су растворени у сувом ДМСО-у за генерисање 100 мм залиха решења, које је затим разређено у раствору снимања на жељеној финалном концентрацијском солутираном 3 и 4 су синтетизовани у наставку најмање 99% чистоће. До суспензије 2-амино-4- (трифлуорометил) бензенемиол хидрохлорида (1,02 г, 4,5 ммол) у 25 мл водене хлороводоничне киселине (2,5 н) је додат чврсти диколонд (380 мг, 4,5 ммол) и резултирајућа хетерогена смеша је рефлуксиран снажно мешање током 4 сата. Реакциона смеша је охлађена до собне температуре и неутрализована постепеним додавањем 10н-калијум хидроксида. Остварени бели талог је филтриран, испран у рерни (3 × 50 мл), сушено у рерни (3 × 50 мл). 65 ° Ц) неколико сати, а затим рекристализиран из етил ацетата / нафте да дају белу чврсту супстанцу (500 мг, 48%); МП 221-222 ° Ц (светло 225-226 ° Ц) 45; 1Х НМР (500 МХз, ДМСО-Д6): Δ [ппм] = 7.25 (врло широки С, 4 х), 7,40 (д, 1 х, ј = 8,1 Хз), 7,73 (С, 1Х), 7.92 (Д , 1 х, Ј = 8,1 Хз) .13ц НМР (200 МХз, ДМСО-Д6): Δ = 114,2 (Д, Ј = 3,5 Хз), 117,5 (Д, Ј = 3,5 Хз), 121.7, 124.6 (К, Ј = 272 Хз), 126.1 (К, Ј = 272 Хз) = 31.6 Хз), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.хрмс (ЕСИ): м / з израчуната вредност.ФОР Ц9Х8Ф3Н4С (М + Х) +: 261.0416, пронађено : 261.0419. Нафтол [1,2-Д] Тхиазол-2-Амин (300 мг, 1,5 ммол), синтетизовани како је претходно описано, загревано је до 200 ° Ц у уљној купељи у малој тестиранској цеви.300 мг (велики вишак) цијанамид и 1.0 МЛ Цонц.то вруће једињење је брзо додато хлороводоничну киселину и смеша је задржана у нафтној купељи око 2 минута, у то време већина воде је испарена реакциона смеша је затим охлађена до собне температуре и резултирајући очврснут материјал провалили су се на мале комаде и испрани водом да би се обезбедила бледо жута аморфна чврста супстанца. (38 мг, 10%) МП 246-250 ° Ц; 1Х НМР (500 МХз, ДМСО-Д6, Д2О): Δ [ппм] = 7,59 (Т, 1Х, Ј = 8,2 Хз), 7,66 (Т, 1Х, Ј = 8,3 Хз), 7,77 (Д, 1 х), 7,77 , Ј = 8,6 Хз), 7,89 (Д, 1Х, Ј = 8,6 Хз), 8.02 (Д, 1Х, Ј = 8,2 Хз), 8,35 (Д, 1Х, Ј = 8,3 Хз) .13Ц НМР (150 МХз, ДМСО-Д6): Δ = 119,9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 140.7, 132.1, 140.7, 169.1.хрмс (ЕСИ): м / з израчуната вредност.ФОР Ц12Х11Н4С (М + Х) +: 243.0699 пронађено: 243.0704. Протонске струје мерене су у унутрашњим и спољним мрљама ооцита који изражавају различите конструкције користећи АКСОПАТЦХ 200Б појачало које контролише АКСОН ДИГИДАТА 1440А (молекуларни уређаји) са пцламп10 софтвером. Интрацелуларна и ванћелијска решења имају исти састав: 100 мм 2- (Н-Морфолино). ) етанесулфонска киселина (МЕС), 30 мм тетраетиламонијум (чај) месилат, 5 мм чајни хлорид, 5 мм етилен гликол-бис (2-аминоетил) -Н, н, н ', н'-тетрасична киселина (ЕГТА), прилагођена ПХ 6.0 са чајем хидроксидом .Све мерења су изведене на 22 ± 2 ° Ц.Тетирање приступа 1,5-4 МΩ.ЦУРРЕНТ трагови филтрирани на 1 кХз, узоркују на 5 кХз и анализирани са Цлампфит10.2 (молекуларни уређаји). ) и порекло8.1 (Оригинлаб). Решења која садрже различите концентрације ХВ1 инхибитора и у неким случајевима 10 мм βМЕ уведене су у калупу гравитацијом кроз разводну употребу повезаном са ВЦ-6 перфузиционим системом вентила (Варнер Инстр.), Који је прошао кроз ПЦламп Софтваре ТТЛ (Транзистор- Транзисторска логика) Сигнали.рапид Перфузијски експерименти су изведени помоћу мулти-цеви перфузије (аутоматизирајући СЦИ.) Са врхом пречника пречника 360 μм. Спијем доставе пречника монтираног испред патцх пипетте.Цханнел инхибиција одређено је изохроналним амперометријским мерењима на крају +120 МВ Деполаризација пулс.гв мерења су извршена како је претходно описано 18,20.Таил струја су забиљежене на -40 МВ након корака деполаризације у различитим напонима са -20 МВ до +120 МВ, осим ако није другачије наведено. Референтни импулс је користи се за исправљање текућег пропадања 18. ГВ Графикон одговара Болтзманн једначини: Очигледне константе дисоцијације (КД) за различите комбинације канала и инхибитора (додатна табела 1) одређена је уклањањем зависности од концентрације инхибиције (средње% инхибијске вредности) Помоћу једнаџбе брда: где је [и] концентрација инхибитора И и Х је брдо коефицијент. Да бисте израчунали коефицијент брда, једначина (2) преуређена као: