Og'ir o'tkir respirator sindromli koronavirus 2 (SARS-CoV-2) uchun vaktsinani ishlab chiqish infektsiyani keltirib chiqaradigan trimerik boshoq oqsiliga qaratilgan. Trimerik boshoqdagi har bir protomer 22 ta glikozillanish joyiga ega. Ushbu saytlarning glikozillanishi virus qaysi hujayralarni yuqtirganiga ta'sir qilishi va ba'zi epitoplarni antikorlarni neytrallashdan himoya qilishi mumkin. Vatanabe kutdi. Rekombinant glikozillangan boshoq trimeri ifodalangan va tozalangan, yagona glikanlarni o'z ichiga olgan glikopeptidlarni ishlab chiqarish uchun proteolizlangan va glikan joylarining tarkibi massa spektrometriyasi bilan aniqlangan. Ushbu tahlil vaktsinalar va antikor testlarini ishlab chiqishda antigen sifatini o'lchash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan benchmarkni taqdim etadi.
b-koronavirus, og'ir o'tkir respirator sindromning paydo bo'lishi koronavirus 2 (SARS-CoV-2) 2019 yilgi koronavirus kasalligining (COVID-19) qo'zg'atuvchisi bo'lib, butun dunyo bo'ylab inson salomatligi uchun katta xavf tug'diradi. Vaktsinani ishlab chiqish humoral immun javobning asosiy maqsadiga, hujayra kirishi va membrana sinteziga vositachilik qiluvchi sinaptik (S) glikoproteinga qaratilgan. Har bir SARS-CoV-2 S geni 22 ta N-bog'langan glikozil ketma-ketligini kodlaydi, bu esa oqsillarni yig'ish va immunitetdan qochishda rol o'ynashi mumkin. Bu erda, saytga xos massa spektrometriyasidan foydalanib, biz rekombinant SARS-CoV-2 S immunogenida glikan tuzilishini aniqladik. Ushbu tahlil trimerik virus cho'qqisi bo'ylab glikanni qayta ishlash holatini xaritalashi mumkin. Biz SARS-CoV-2 S glikani va virus patologiyasi va vaktsina dizayniga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan xos glikanni qayta ishlash o'rtasidagi farqni ko'rsatamiz.
Og'ir o'tkir respirator sindrom Koronavirus 2 (SARS-CoV-2) Koronavirus 2019 (COVID-19) qo'zg'atuvchi patogen (1, 2) bo'lib, isitma, og'ir respirator kasalliklar va pnevmoniyaga olib kelishi mumkin. SARS-CoV-2 angiotensin-konvertatsiya qiluvchi ferment 2 (ACE2) bilan bog'lanish uchun virus yuzasidan chiqadigan keng glikozillangan boshoq (S) oqsilidan foydalanadi (3). S oqsili trimerik I sinf termoyadroviy oqsil bo'lib, ikkita funktsional subbirlikdan iborat bo'lib, retseptorlarni bog'lash (S1 subunit) va membrana sintezi (S2 subunit) uchun javobgardir (4, 5). Qoplangan tirnoqning yuzasi asosan xostdan olingan glikanlar tomonidan nazorat qilinadi va har bir trimer 66 N bilan bog'langan glikozillanish joylarini ko'rsatadi. S proteini vaktsinani loyihalashda asosiy maqsaddir (6). Rekombinant virus spikelarining glikozillanishini tushunish virus biologiyasining asosiy xususiyatlarini ochib beradi va vaktsinalarni loyihalash strategiyasini yo'naltiradi (7, 8).
Virusli glikozillanish virusli patobiologiyada keng ko'lamli rollarga ega, jumladan, oqsil katlamasi va barqarorligi va virus tropizmini shakllantirish (9). Glikozillanish joylari selektiv bosim ostida, chunki ular o'ziga xos epitoplarni antikorlarni neytrallashdan himoya qilish orqali immunitetdan qochishga yordam beradi. Biroq, biz SARS-CoV-2 mutatsiyasining tezligi juda past ekanligini payqadik va hozirgacha N-bog'langan glikozillanish joyi mutatsiyasi kuzatilmagan (10). Glikanlarning g'ayritabiiy darajada yuqori zichligi bo'lgan sirtlar ham immunitet tan olinishiga erishishi mumkin (9, 11, 12). Boshqa koronaviruslar uchun immunogen oqsil epitoplarini kamuflyaj qilishda glikozillanishning roli o'rganilgan (10, 13, 14). Koronaviruslar endoplazmatik retikulum-Golji bo'shlig'iga o'sib, virionlarni hosil qiladi (15, 16). Biroq, virusdan olingan materiallarda glikanlarning murakkab turlari kuzatilganda, virusli glikoproteinga Goljida joylashgan qayta ishlash fermentlari ta'sir ko'rsatishi aniqlandi (13, 17).
Virusli glikanlarning yuqori zichligi va mahalliy oqsil tuzilishi fazoviy ravishda glikanning pishib etish yo'lini buzadi. Oligomannoz tipidagi glikanlarning mavjudligiga olib keladigan buzilgan glikan etukligi tabiiy protein tuzilishining sezgir muxbiri bo'lishi mumkin (8) va turli xil immunogenlarni solishtirish va ishlab chiqarish jarayonlarini kuzatish uchun saytga xos glikan tahlilidan foydalanish mumkin (18). Bundan tashqari, glikozillanish rekombinant immunogenni germinal markazga tashishga ta'sir qilishi mumkin (19).
SARS-CoV-2 S oqsilining saytga xos glikozillanishini hal qilish va glikoproteinlarning butun oqsil yuzasida tarqalishini ko'rish uchun biz rekombinant eruvchan materiallarning uchta biologik jihatini oqsillarni olishda qo'llaniladigan tarzda ifodaladik va tozaladik. . replika. Kifennoninning glikanni qayta ishlashni blokirovka qiluvchi ta'siri yo'qligiga qaramasdan, yuqori aniqlikdagi kriyo-elektron mikroskopiya (kriyo-EM) tuzilishi (4). S oqsilining ushbu variantida SARS-CoV-2 S oqsilidagi barcha 22 glikan mavjud (1A-rasm). Furin parchalanish joyida 986 va 987 (20) qoldiqlarining 2P barqaror mutatsiyalari, GSAS (Gly-Ser-Ala-Ser) o'rnini bosish (qoldiqlar 682 dan 685 gacha) va C dan foydalangan holda, trimerning termoyadroviydan oldingi tuzilishi barqarorlikka erishiladi. -Terminal trimerizatsiya motivi. Bu glikanni qayta ishlash jarayonida to'rtlamchi tuzilmani saqlashga yordam beradi. Tahlil qilishdan oldin rekombinant SARS-CoV-2 S ni o'z ichiga olgan supernatant faqat tabiiy o'xshash trimerik oqsillar tahlil qilinishini ta'minlash uchun o'lchamli istisno xromatografiyasi bilan tozalandi (1B-rasm va S1-rasm). Tozalangan materialning trimer konformatsiyasi manfiy bo'yash EM yordamida tekshirildi (1C-rasm).
(A) SARS-CoV-2 S glikoproteinining sxematik diagrammasi. N-bog'langan glikozillanish ketma-ketligining holati (NXS/T, bu erda X≠P) filial sifatida ko'rsatilgan (N, Asn; X, har qanday qoldiq; S, Ser; T, Thr; P, Pro). Protein domenlarini tavsiflaydi: N-terminal domen (NTD), retseptorlarni bog'lovchi domen (RBD), termoyadroviy peptid (FP), geptapeptid takrori 1 (HR1), markaziy spiral (CH), konnektor domen (CD) ) va transmembran domen (TM) ). (B) inson embrion buyragi (HEK) 293F hujayralarida ifodalangan SARS-CoV-2 S oqsilining (o'q bilan ko'rsatilgan) SDS-poliakrilamid gel elektroforez tahlili. 1-qator: transfektsion hujayralardan filtrlangan supernatant; 2-qator: StrepTactin qatronidan oqim; 3-qator: StrepTactin qatroni bilan yuvish; 4-qator: StrepTactin qatronidan elutsiya. (C) SARS-CoV-2 S oqsilining EM 2D manfiy o‘rtacha qiymati. SARS-CoV-2 S oqsilining 2D oʻrtacha qiymati koʻrsatilgan boʻlib, bu protein strukturani aniqlash uchun ishlatiladigan materialga mos keladigan trimerning termoyadroviydan oldingi konformatsiyasini qabul qilishini tasdiqlaydi (4).
SARS-CoV-2 S ning saytga xos glikozillanishini aniqlash uchun biz uchta glikopeptid namunasini yaratish uchun tripsin, kimotripsin va a-litik proteazdan foydalandik. Ushbu proteazlar bitta N-bog'langan glikan ketma-ketligini o'z ichiga olgan glikopeptidlarni ishlab chiqarish uchun tanlanadi. Glikopeptidlar suyuq xromatografiya-mass-spektrometriya yordamida tahlil qilindi va barcha 22 N-bog'langan glikan joylarining glikan tarkibi aniqlandi (2-rasm). Har bir uchastkaning asosiy ishlov berish xususiyatlarini etkazish uchun, dallanish va fukosilatsiyaga ko'ra, har bir glikanning ko'pligi oligomannoz, gibrid va murakkab glikozillanish toifalariga bo'linadi. S1-jadval va 6-rasmda turli glikan kompozitsiyalari ko'rsatilgan batafsil kengaytirilgan ko'rinishlar berilgan. S2.
Diagrammada glikanlarning oligomannozdan gibrid turlarigacha bo'lgan etilish yo'lida paydo bo'lishi mumkin bo'lgan asosiy turdagi glikanlarning rang kodlari tasvirlangan. Ushbu raqamlar glikan toifasiga qisqartirilgan N-bog'langan glikozillanish joyida mavjud bo'lgan glikan populyatsiyasining miqdoriy massa spektrometriya tahlilini umumlashtiradi. Oligomannoz tipidagi glikanlar seriyasi (M9 dan M5 gacha; Man9GlcNAc2 dan Man5GlcNAc2 gacha) yashil, glikozillanmagan va fukozilatlangan gibrid glikanlar (gibrid va F gibrid), nuqtali chiziq antennalar soniga ko'ra pushti rangga ega. A1 dan FA4 gacha) shartlar mavjud bo'lganda pushti rangga ega. N-bog'langan glikan saytlaridagi vakansiyalar kulrang rangda ko'rsatilgan. Pirog diagrammasi ushbu glikanlarning miqdorini umumlashtiradi. Glikan joylari oligomannoz tipidagi glikanlar tarkibiga ko'ra ranglanadi va glikan joylari yashil (80% dan 100% gacha), to'q sariq (30% dan 79% gacha) va pushti (0% dan 29% gacha) bilan belgilanadi. Har bir toifadagi heterojenlikni ko'rsatuvchi saytga xos tahlilning kengaytirilgan versiyasini S1-jadval va 6-rasmda topish mumkin. S2. Chiziqli grafik uchta biologik replikatsiyaning o'rtacha qiymatini, xato chiziqlari esa o'rtachaning standart xatosini ifodalaydi.
SARS-CoV-2 S ning ikkita joyi asosan oligomannozdir: N234 va N709. N234 dan tashqari, butun oqsilda kuzatilgan asosiy oligomannoz glikan tuzilishi Man5GlcNAc2 (Man, mannose; GlcNAc, N-asetilglyukozamin), bu saytlar asosan a-1,2-mannosidaza kirishi mumkinligini ko'rsatadi, lekin GlcNAcT substrati. -1 kuchsiz, GlcNAcT-1 Golji apparatida geterozigotali va murakkab glikanlarni hosil qiluvchi asosiy ferment hisoblanadi. Qayta ishlashga to'sqinlik qiladigan bosqich virusli boshoqlarda glikanlarning zichligi va namoyon bo'lishi bilan bog'liq xususiyatdir. Misol uchun, OIV-1 Env va Lassa virusi (LASV) GPC ning yuqori glikozillanish cho'qqilari Man9GlcNAc2 (21-24) hukmron bo'lgan ko'plab saytlarni ko'rsatadi.
Oligomannoz va murakkab glikanlar aralashmasini N61, N122, N603, N717, N801 va N1074 joylarida topish mumkin (2-rasm). S proteinidagi 22 ta joydan 8 tasida ko'p sonli oligomannoz tipidagi glikanlar mavjud bo'lib, bu SARS-CoV-2 S glikanlarini qayta ishlash va xost glikoproteini o'rtasidagi farqni ta'kidlaydi (25). Qolgan 14 ta uchastkada glikanlarning qayta ishlangan murakkab turlari ustunlik qiladi.
SARS-CoV-2 S da bo'sh glikozillanish joylari aniqlangan bo'lsa-da, ular miqdorini aniqlashda jami peptidlar kutubxonasining juda kichik qismini tashkil etishi aniqlandi (jadval S2). OIV-1 immunogen tadkikotlarida, band bo'lmagan glikan joylari tomonidan yaratilgan bo'shliqlar immunogen ekanligi va chalg'ituvchi epitoplarga olib kelishi mumkinligi ko'rsatilgan (26). SARS-CoV-2 S ning N-bog'langan glikan ketma-ketligining yuqori bandlik darajasi rekombinant immunogen saytning bandligini oshirish uchun qo'shimcha optimallashtirishni talab qilmasligini ko'rsatadi.
Trimerik SARS-CoV-2 S oqsilining muzlatilgan EM strukturasidan [Protein ma'lumotlar bazasi (PDB) ID 6VSB] (4) foydalanib, koronavirus boshoq mimikining glikozillanish holati eksperimental ravishda aniqlangan uch o'lchovli (3D) tuzilishga ( 3-rasm). Mass-spektrometriya va past haroratli EM tahlilining kombinatsiyasi N-bog'langan glikanlar SARS-CoV-2 boshoqining butun yuzasida turli joylarni qanday ushlab turishini aniqladi.
Trimerik SARS-CoV-2 S glikoproteinining (PDB ID 6VSB) (4) sintezdan oldingi tuzilishidagi model vakili glikanlar, bunda bitta RBD “yuqoriga” konformatsiyada, qolgan ikkita RBD esa “yo‘nalish”da. Pastga” konformatsiyasi. Glikanlar bog'lanish bilan belgilangan oligomannoz tarkibiga ko'ra ranglanadi. ACE2 retseptorlari bilan bog'lanish joyi ochiq ko'k rangda ta'kidlangan. S1 va S2 bo'linmalari mos ravishda ochiq va quyuq kulrang chizilgan yarim shaffof yuzalar bilan ifodalanadi. N74 va N149 glikan joylari joylashgan egiluvchan halqalar kulrang chiziqli chiziqlar bilan ifodalanadi va halqalardagi glikan joylari ularning taxminiy hududlarida xaritada ko'rsatilgan.
SARS-CoV-2 shpikidagi retseptorlarni bog'lash joyi proksimal glikozillanish joylari (N165, N234, N343) tomonidan himoyalanganligini kuzatish mumkin, ayniqsa retseptorlarni bog'lash domeni "pastga" konformatsiyada bo'lsa. SARS-CoV-1 S (10, 13), OIV-1 Env (27), gripp gemagglutinini (28, 29) va LASV GPCda kuzatilganidek, retseptorlarni bog'lash joylarini glikanlar bilan himoyalash Bu virusli glikoproteinlarning umumiy xususiyatidir. . (yigirma to'rt). Retseptorlarni bog'lash joyining funktsional cheklovlari va bu qoldiqlarning past mutatsiya tezligini hisobga olgan holda, ularning tegishli glikoproteinlarining eng saqlanib qolgan va potentsial zaif hududlaridan birini kamuflyaj qilish uchun N-bog'langan glikanlardan foydalanish uchun selektiv bosim bo'lishi mumkin (30, 31).
Biz S1 va S2 subbirliklarida oligomannoz tipidagi glikanlarning tarqalishini payqadik. Bu boshqa virusli glikoproteinlardan farqli o'laroq. Masalan, bir nechta OIV-1 Env shtammlaridagi zich glikan klasterlari antikorlar tomonidan tan olingan oligomannoz tipidagi glikanlarni keltirib chiqarishi mumkin (32, 33). SARS-CoV-2 S da oligomannoz strukturasi N234 glikanlar (qisman N-terminus va retseptorlarni bog'lovchi domen o'rtasida joylashgan) kabi oqsil komponentlari bilan himoyalangan bo'lishi mumkin (3-rasm).
Biz kengaytirilgan moslashuvchan pastadir tuzilmalarida (N74 va N149) va membrananing proksimal C-terminalida (N1158, N1173, N1194) N-bog'langan glikanlarni tavsifladik va bu molekulalar kriyoEM tasvirlarida (4) hal qilinmadi. Bu qoldiqlarning fazoviy mavjudligiga mos keladigan murakkab glikanlar sifatida aniqlandi.
Oligomannoz glikanlarning tarkibi (28%) (S2-jadval) odatdagi xost glikoproteinlariga qaraganda yuqori bo'lsa-da, u boshqa virusli glikoproteinlarga qaraganda past. Masalan, eng zich glikozillangan virusli boshoq oqsillaridan biri OIV-1 Env bo'lib, u ~60% oligomannoz tipidagi glikanlarni namoyish etadi (21, 34). Bu shuni ko'rsatadiki, boshqa virusli glikoproteinlar (jumladan, OIV-1 Env va LASV GPC) bilan solishtirganda SARS-CoV-2 S oqsilining glikozillanishi zaifroq va glikanlarning shakllanishi kamroq himoyalangan, bu neytrallashtiruvchi antikorlarni ishga tushirish uchun foydali bo'lishi mumkin Foydali .
Bundan tashqari, murakkab glikanlarni qayta ishlash immunogen muhandisligida muhim ahamiyatga ega, ayniqsa SARS-CoV-2 S ga qarshi neytrallashtiruvchi antikor epitopida N343 (35) da fukozillangan glikanlar bo'lishi mumkinligini hisobga olsak. 22 N-bog'langan glikozillanish joylari orasida 52% fukozillanish va 15% glikanlarda kamida bitta sialik kislota qoldig'i mavjud (jadval S2 va S3-rasm). Bizning tahlilimiz shuni ko'rsatdiki, N343 fukoza qoldiqlari bilan sinovdan o'tgan glikanlarning 98% tomonidan yuqori darajada fukozillangan. Glikanlarning modifikatsiyasiga ishlatiladigan hujayra ifoda tizimi jiddiy ta'sir ko'rsatadi. Biz ilgari OIV-1 Env glikozillanishi uchun murakkab glikanlarni qayta ishlash ishlab chiqarish hujayralari tomonidan boshqarilishini ko'rsatdik, ammo oligomannoz glikanlarning darajasi asosan ekspresyon tizimidan mustaqil va oqsil tuzilishi bilan bog'liq. Glikan zichligi bilan chambarchas bog'liq (36).
LASV GPC va HIV-1 Env da kuzatilganidek, yuqori zichlikdagi glikan qalqoni oqsil yuzasida mannoz klasterlari (22, 24) deb ataladi (4-rasm). Kichik mannoz tipidagi klasterlar Yaqin Sharq respirator sindromi (MERS)-CoV S (10) ning S1 bo'linmasida topilgan bo'lsa-da, bu hodisa SARS-CoV-1 yoki SARS-CoV-2 S oqsillarida kuzatilmadi. Bu erda xabar qilingan saytga xos glikozillanish tahlili shuni ko'rsatadiki, SARS-CoV-2 S glikan qalqoni boshqa koronaviruslar bilan mos keladi va butun glikan qalqoni ham ko'plab zaifliklarni namoyish etadi (10). Nihoyat, biz Thr323/Ser325 (T323/S325) da O-bog'langan glikozillanishning iz miqdorini aniqladik, bu erda saytlarning 99% dan ko'prog'i o'zgartirilmagan (S4-rasm), bu strukturaning mahalliyga o'xshashligini ko'rsatadi.
Chapdan o'ngga MERS-CoV S (10), SARS-CoV-1 S (10), SARS-CoV-2 S, LASV GPC (24) va OIV-1 Env (8, 21). Saytga xos N-bog'langan glikan oligomannoz miqdori kalit so'zlarga ko'ra ranglanadi. LASV GPC dan tashqari, barcha glikoproteinlar HEK 293F hujayralarida eruvchan trimerlar sifatida ifodalanadi, LASV GPC esa Madin-Darby it buyrak II hujayralarining virusga o'xshash zarralaridan olingan.
Bizning SARS-CoV-2 glikozillanish tahlilimiz tabiiy ravishda buklangan trimer shpiklariga xos bo'lgan saytga xos glikan xususiyatlari uchun batafsil mezon beradi. Glikoproteinlarga asoslangan tobora ko'proq nomzod vaktsinalar ishlab chiqilishi bilan, batafsil glikan tahlili immunogenlarning yaxlitligini solishtirish imkonini beradi va ishlab chiqarish ko'lami klinik foydalanish uchun kengayganligi sababli, monitoring ham juda muhim bo'ladi. Shuning uchun serologik test to'plamlarini ishlab chiqarishda glikan profilini tahlil qilish ham antigen sifatining muhim ko'rsatkichi bo'ladi. Nihoyat, nukleotidlarga asoslangan vaktsinalar paydo bo'lishi bilan, bu etkazib berish mexanizmlari immunogenlarni qayta ishlash va taqdim etishga qanday ta'sir qilishini tushunish muhimdir.
Bu Creative Commons Attribution License shartlariga muvofiq tarqatilgan ochiq kirish maqolasi. Maqola asl asardan to'g'ri iqtibos keltirilishi sharti bilan har qanday vositada cheklovsiz foydalanish, tarqatish va ko'paytirishga ruxsat beradi.
Eslatma: Biz sizdan faqat elektron pochta manzilingizni ko'rsatishingizni so'raymiz, shunda siz sahifaga tavsiya qilgan odam siz u xatni ko'rishni xohlayotganingizni va bu spam emasligini bilishi uchun. Biz hech qanday elektron pochta manzilini ushlamaymiz.
Bu savol sizning tashrif buyuruvchi ekanligingizni tekshirish va avtomatik spam yuborishning oldini olish uchun ishlatiladi.
Mass-spektrometriya tahlili SARS-CoV-2 boshoq oqsilidagi barcha glikozillanish joylarining glikan tarkibini aniqladi.
Mass-spektrometriya tahlili SARS-CoV-2 boshoq oqsilidagi barcha glikozillanish joylarining glikan tarkibini aniqladi.
©2021 Amerika fan taraqqiyoti assotsiatsiyasi. Barcha huquqlar himoyalangan. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef va COUNTER.Science ISSN 1095-9203 hamkori hisoblanadi.
Yuborilgan vaqt: 21-yanvar-2021
