استجواب الواجهة intersubunit لقناة بروتون Hv1 المفتوحة باستخدام مسبار مقترن بشكل خافت

شكرًا لك على زيارة Nature.com. إن إصدار المتصفح الذي تستخدمه يتمتع بدعم محدود لـ CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، لضمان الدعم المستمر، سوف نقوم بعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت. قناة البروتون ذات الجهد الكهربي Hv1 عبارة عن مجمع ثنائي يتكون من مجالين لاستشعار الجهد (VSDs)، يحتوي كل منهما على مسار تخلل البروتون المسور. يتم التحكم في Dimerization بواسطة مجال الملف اللولبي السيتوبلازمي. الانتقال من الحالة المغلقة إلى الحالة المغلقة من المعروف أن الحالة المفتوحة في كلا VSDs تحدث بشكل تعاوني؛ ومع ذلك، لا يُعرف سوى القليل عن الآليات الأساسية. تلعب واجهات الوحدات الفرعية دورًا رئيسيًا في العمليات التفارغية؛ ومع ذلك، لم يتم تحديد مثل هذه الواجهات في قنوات Hv1 المفتوحة. نوضح هنا أن مشتقات 2-جوانيدينوثيازول تمنع اثنين من Hv1 VSDs بطريقة تعاونية وتستخدم أحد هذه المركبات كمسبار للاقتران التفارغي بين الوحدات الفرعية المفتوحة. لقد وجدنا أن الخلايا خارج الخلية تشكل نهاية الجزء الأول من الغشاء من VSD واجهة بين الوحدات التي تتوسط الاقتران بين مواقع الربط، في حين أن مجال الملف اللولبي لا يشارك بشكل مباشر في هذه العملية. لقد وجدنا أيضًا دليلًا قويًا على أن المرشح الانتقائي للبروتون في القناة يتحكم في تعاونية ربط مانع الارتباط . تلعب قنوات البروتون ذات بوابات الجهد أدوارًا مهمة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، بدءًا من العوالق النباتية وحتى البشر. في معظم الخلايا، تتوسط هذه القنوات تدفق البروتون من غشاء البروتون وتنظم نشاط أوكسيديز NADPH. قناة البروتون الوحيدة المعروفة ذات بوابات الجهد في البشر هو Hv1، وهو نتاج جين HVCN12،3. وقد ثبت أن Hv1 (ويعرف أيضًا باسم VSOP) يلعب دورًا في تكاثر الخلايا البائية، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة الجهاز المناعي الفطري، وخلايا الحيوانات المنوية. الحركة 9 وتنظيم درجة الحموضة لسائل سطح مجرى الهواء . تشارك هذه القناة في العديد من أنواع السرطان التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط مثل الأورام الخبيثة في الخلايا البائية 4،11 وسرطان الثدي وسرطان القولون والمستقيم 12،13. وقد وجد أن نشاط Hv1 الزائد يزيد من احتمالية انتشار الخلايا السرطانية 11، 12. في الدماغ، يتم التعبير عن Hv1 بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة، وقد تبين أن نشاطها يؤدي إلى تفاقم تلف الدماغ في نماذج السكتة الدماغية. يحتوي بروتين Hv1 على مجال استشعار الجهد (VSD)، الذي يتكون من أربعة أجزاء غشائية تسمى S1 إلى S414. ويشبه VSD المجالات المقابلة لقنوات Na+ وK+ وCa2+ ذات البوابات الكهربية والفوسفاتيز الحساسة للجهد، مثل CiVSP من Ciona Gutis15. في هذه البروتينات الأخرى، يتم ربط الطرف C لـ S4 بوحدة المستجيب أو مجال المسام أو الإنزيم. في Hv1، يرتبط S4 بنطاق الملف اللولبي (CCD) الموجود على الجانب السيتوبلازمي للغشاء. القناة عبارة عن مجمع ثنائي يتكون من اثنين من VSDs، يحتوي كل منهما على مسار تخلل البروتون المسور16،17،18. تم العثور على هاتين الوحدتين الفرعيتين Hv1 لفتحهما بشكل تعاوني19،20،21،22، مما يشير إلى أن الاقتران التفارفي والتفاعلات بين الوحدات الفرعية تلعب دورًا دورًا مهمًا في عملية البوابات. إن الواجهة بين الوحدات الفرعية داخل مجال الملف الملتف محددة جيدًا لأن الهياكل البلورية للنطاقين المعزولين متاحة 22،23. ومن ناحية أخرى، فإن الواجهة بين VSDs داخل الغشاء ليست كذلك مفهومة جيدًا. لا يوفر الهيكل البلوري للبروتين الخيميري Hv1-CiVSP معلومات حول هذه الواجهة، حيث أن التنظيم الثلاثي لمجمع القنوات المتبلورة قد ينجم عن استبدال Hv1 CCD الأصلي بسحاب خميرة الليوسين GCN424. خلصت دراسة حديثة لتنظيم الوحدة الفرعية لقناة Hv1 إلى أن حلزونين S4 ينتقلان إلى CCD دون حدوث اضطراب شديد في البنية الثانوية، مما يؤدي إلى ظهور حلزونات طويلة تبدأ من الغشاء وتمتد إلى السيتوبلازم. استنادًا إلى تحليل تشابك السيستين، تقترح هذه الدراسة أن تتصل VSDs Hv1 ببعضها البعض على طول مقطع S4. ومع ذلك، اقترحت دراسات أخرى واجهات بديلة بين VSDs. تتضمن هذه الواجهات مقاطع S1 17 و21 و26 والأطراف الخارجية للجزء S2 21. سبب محتمل للتعارض نتائج هذه الدراسات هي أنه تم فحص الاقتران التفارحي بين VSDs فيما يتعلق بعملية النابضة، والتي تعتمد على الحالات المغلقة والمفتوحة، وقد تختلف الواجهة بين VSDs في تغيرات الحالة المختلفة في التشكل. هنا، وجدنا أن 2-جوانيدينوثيازول يثبط قنوات Hv1 عن طريق الارتباط التآزري لاثنين من VSDs المفتوحة، واستخدم أحد المركبات، 2-جوانيدينوبنزوثيازول (GBTA)، لاستكشاف التفاعل بين الوحدات الفرعية في الحالة المفتوحة. لقد وجدنا أن منحنى ربط GBTA يمكن وصفه جيدًا من خلال نموذج كمي يؤدي فيه ربط المثبط بوحدة فرعية واحدة إلى زيادة في تقارب الارتباط للوحدة الفرعية المجاورة. كما وجدنا أن البقايا D112، مرشحات انتقائية لـ تتحكم القناة 27 و28 وجزء من موقع ربط مشتق الجوانيدين 29 في تعاون ربط GBTA. لقد أظهرنا أنه يتم الحفاظ على الارتباط التعاوني في ثنائي Hv1، حيث ينفصل CCD عن الجزء S4، مما يشير إلى أن الواجهة البينية في CCD لا تنفصل بشكل مباشر التوسط في الاقتران الخيفي بين مواقع ربط GBTA. في المقابل، نجد أن الجزء S1 هو جزء من الواجهة بين الوحدات الفرعية ويقترح ترتيبًا لـ VSDs المجاورة مع النهاية خارج الخلية للحلزون S4 بعيدًا عن مركز الخافتة للسماح أن يكون الجزء S1 في الحالة المفتوحة. تعتبر مثبطات الجزيئات الصغيرة لـ Hv1 مفيدة كأدوية مضادة للسرطان وعوامل وقائية للأعصاب. ومع ذلك، حتى الآن، عدد قليل من المركبات قادرة على تثبيط القناة 30،31،32،33. من بينها، 2-جوانيدينوبنزيميدازول (2GBI، مركب [1] في الشكل 1a) ومشتقاته تمنع تخلل VSD29,32 للبروتونات عبر القناة. ويُعتقد أن ربط هذه المركبات يحدث بشكل مستقل في الوحدتين الفرعيتين المفتوحتين. أظهر سابقًا أنه يمنع Hv1 بنفس فعالية 2GBI عند اختباره بتركيز 200 ميكرومتر (الشكل 1 ب). قمنا بفحص مشتقات الثيازول الأخرى ووجدنا أن بعضها يثبط القناة بقوة مماثلة أو أكبر من GBTA (الشكل 1 والتكميلي) نص). لقد حددنا منحنيات استجابة التركيز لأربعة مشتقات الثيازول (GBTA والمركبات [3] و [6] و [11]، الشكل 1 ج) ووجدنا أنها كانت أكثر انحدارًا من تلك الخاصة بـ 2GBI. معاملات هيل (ح) تراوحت مشتقات الثيازول من 1.109 ± 0.040 إلى 1.306 ± 0.033 (الشكل 1 أ). 1 ج والشكل التكميلي 1). في المقابل، كان معامل هيل لـ 2GBI هو 0.975 ± 0.024 29، الشكل 2 أ والشكل التكميلي 1). يشير معامل هيل أعلى من 1 إلى التعاون الملزم. لأن كل وحدة فرعية من Hv1 لها مثبط خاص بها- موقع الربط، 29،32 لقد فكرنا في أن ربط مشتق الثيازول بوحدة فرعية واحدة يمكن أن يعزز ربط جزيء مثبط ثانٍ بالوحدة الفرعية المجاورة. كان GBTA هو مركب الاختبار ذو أعلى معامل هيل. لذلك، اخترنا هذا المركب مزيد من الدراسة لآلية التآزر الملزم واستخدام 2GBI كعنصر تحكم سلبي مرجعي. (أ) مركبات الاختبار: [1] مثبط Hv1 المرجعي 2-جوانيدينو-بنزيميدازول (2GBI).[2] 2-جوانيدينو-بنزوثيازول (GBTA)، [3] (5-ثلاثي فلورو ميثيل-1،3-بنزوثيازول-2-ييل) جوانيدين، [4] نافثو[1،2-د] [1، 3] ثيازول-2-ييل -جوانيدين، [5](4-ميثيل-1،3-ثيازول-2-ييل)جوانيدين، [6](5-برومو-4-ميثيل-1،3-ثيازول-2-ييل)جوانيدين، [7] فاموتيدين، [8] 2-جوانيدينو-5-ميثيل-1،3-ثيازول-4-إيثيل إستر حمض الكربوكسيل، [9] 2-جوانيدينو-4-ميثيل إيثيل-1،3-ثيازول-5-كربوكسيلات، [10] ](2-جوانيدينو-4-ميثيل-1,3-ثيازول-5-ييل) أسيتات إيثيل، [11]1-[4-(4-كلوروفينيل)-1,3-ثيازول-2-ييل]جوانيدين، [ 12]1-[4-(3,4-ديميثوكسيفينيل)-1,3-ثيازول-2-ييل]جوانيدين.(ب) تثبيط نشاط Hv1 البشري بواسطة جوانيدينوثيازولات المشار إليها والمركب المرجعي 2GBI (أشرطة زرقاء وخضراء) تم قياس تيارات بروتون Hv1 في لويحات من الداخل إلى الخارج لبويضات Xenopus استجابةً لإزالة الاستقطاب من قدرة احتجاز تبلغ -80 مللي فولت إلى +120 مللي فولت. تمت إضافة كل مثبط إلى الحمام بتركيز 200 ميكرومتر.pHi = pHo = 6.0 البيانات تعني ±SEM (n≥4).(ج) تثبيط Hv1 البشري المعتمد على التركيز بواسطة المركبات [2]، [3]، [6] و [11]. تمثل كل نقطة متوسط ​​التثبيط ± SD لـ 3 إلى 15 قياسًا. الخط عبارة عن تل مناسب يستخدم للحصول على قيم Kd الظاهرة المذكورة في الجدول التكميلي 1. تم تحديد معاملات التل من النوبات المذكورة في الشكل التكميلي 1: h (1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033، h(3) = 1.25 ± 0.07، h(6) = 1.109 ± 0.040، h (11) = 1.179 ± 0.036 (انظر الطرق). (أ،ب) تمنع المركبات 2GBI وGBTA Hv1 الثنائي والمونوميري بطريقة تعتمد على التركيز. تمثل كل نقطة متوسط ​​التثبيط ± SD من 3 إلى 8 قياسات والمنحنى مناسب للتل. معاملات التل (ح) الموضحة في تم تحديد الرسوم البيانية الداخلية من النوبات المذكورة في الشكلين التكميلي 3 و 4. استجابة تركيز GBTA الموضحة في (أ) هي نفسها كما في الشكل 1 ج. انظر الجدول التكميلي 1 لمعرفة قيم Kd الواضحة. (ج) نمذجة الارتباط التعاوني لـ GBTA إلى Hv1 الخافت. يمثل الخط الأسود الصلب الملاءمة للبيانات التجريبية من خلال المعادلة (6)، التي تصف نموذج الربط الموضح في (د). تمثل الخطوط المتقطعة المسمى Sub 1 و Sub 2 الارتباط الثنائي الجزيئي منحنيات توازن التفكك لأحداث الربط الأولى والثانية، على التوالي (Sub 1: OO + B ⇄ BO*، Kd1 = 290 ± 70 μM؛ Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*، Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM (د) رسم تخطيطي للآلية المقترحة لكتلة Hv1. في حالة GBTA، يؤدي الارتباط بوحدة فرعية مفتوحة واحدة إلى زيادة تقارب الوحدة الفرعية المفتوحة المجاورة (Kd2 يمكن مونومرة قنوات Hv1 عن طريق استبدال مجالاتها السيتوبلازمية N و C بأجزاء مقابلة من Ciona Intestinalis الفوسفاتيز الحساس للجهد CiVSP (Hv1NCCiVSP) 18،34. قمنا بقياس اعتماد التركيز على تثبيط Hv1 المونومري بواسطة GBTA و 2GBI و قارنوها بتثبيط القناة الخافتة (النوع البري) (الشكل 2 أ، ب). لقد وجدنا أنه تم التخلص من الفرق في التعاون الملزم بين المركبين في Hv1 المونومري، مما يدعم التفسير القائل بأن ربط GBTA بوحدة فرعية واحدة يزيد من تقارب الوحدة الفرعية الأخرى للمثبط. لقد اعتقدنا أن ربط GBTA بوحدة فرعية واحدة من Hv1 قد يؤدي إلى إعادة ترتيب موقع الربط (التسبب في fit35)، مما قد يؤدي إلى إعادة ترتيب موقع الربط الشاغر للوحدة الفرعية المجاورة، مما يؤدي إلى زيادة الارتباط التقارب. لوصف الارتباط التعاوني لـ GBTA بالقناة كميًا، استخدمنا نموذجًا يمكن لأي وحدة فرعية من خلاله ربط جزيء المثبط الأول بعد تفاعل ثنائي الجزيئي مع ثابت تفكك Kd1 (الشكل 2c، Sub 1، OO+ B ⇆ BO*). يؤدي الارتباط إلى اعتماد القناة لحالة ترتبط فيها الوحدات الفرعية الفارغة المتبقية بالمثبط بعد تفاعل جزيئي فريد مع ثابت التفكك Kd2، حيث Kd2 0.05) في معامل Hill لربط GBTA بقنوات GGG مقارنة بالنوع البري (الشكل 5 ج)، مما يشير إلى أنه على الرغم من دوره في الحفاظ على. وحدتان فرعيتان معًا مهمتان، لكن CCD لا تتوسط بشكل مباشر في الاقتران الخيفي بين الوحدات الفرعية بين مواقع ربط GBTA. ( أ ) رسم تخطيطي لثنائي Hv1 مع طفرة الدهون الثلاثية في الطرف الداخلي لـ S4 المصمم لتعطيل الاقتران بين الوحدات بوساطة مجال الملف اللولبي السيتوبلازمي (الأسهم الزرقاء). (ب) تمثيل تخطيطي لثنائيات Hv1 وثنائيات الربط مع الطفرات المشار إليها، المصممة لاختبار شظايا S1 المشاركة في الاقتران بين الوحدات الفرعية (الأسهم الزرقاء). (ج - ح) 2GBI (سماوي) وGBTA (أحمر غامق) تمنع التركيبات المشار إليها بطريقة تعتمد على التركيز. تمثل كل نقطة متوسط ​​التثبيط ± SD من 3 إلى 10 قياسات. كان المنحنى مناسبًا للتل المستخدم للحصول على قيم Kd واضحة (انظر الجدول التكميلي 1). تم تحديد معاملات Hill في الرسوم البيانية المحرفة كما هو موضح في قسم الطرق (انظر الشكلين التكميلي 3 و 4). قيم h المرجعية لـ تظهر Hv1 WT كخطوط متقطعة. تشير العلامات النجمية إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين الممرات المتحولة وWT (P 0.05، الشكل 5 د، ط) ). من ناحية أخرى ، قللت الطفرة D123A بشكل كبير من معامل Hill لـ GBTA (p 0.05/14). نظرًا لأن تحييد الشحنة في الموضع 123 على كلتا الوحدتين الفرعيتين أدى إلى تغيير قوي في تعاون ربط GBTA، في حين أن عكس الشحنة على كلتا الوحدتين الفرعيتين لم يكن له سوى تأثير بسيط، فقد قمنا بتوسيع التحليل ليشمل وحدة فرعية واحدة فقط مع قناة الشحن الانعكاسية. تم إنشاء ثنائيات مرتبطة بـ Hv1 مع استبدال D123R في الوحدة الفرعية للمحطة C (الشكل 5 ب) وقياس تثبيط استجابة التركيز بواسطة GBTA و2GBI. لقد وجدنا أن معامل Hill لربط GBTA بقنوات WT-D123R كان أعلى بكثير من ذلك من النوع البري Hv1 (p 0.05). لقد وجدنا أيضًا أنه في غياب βME، كان معامل Hill الخاص بـ GBTA المرتبط بـ dimer D112E I127C Hv1 أعلى بكثير من ذلك المقاس في وجود عوامل الاختزال (الشكل 6e والشكل التكميلي 4)، مما يعني أن طفرة D112E لم يلغي الزيادة في تعاون ربط GBTA الناتج عن الارتباط المتقاطع للسيستين 127. كما لم يتأثر معامل Hill لـ 2GBI المرتبط بـ D112E و I127C Hv1 بشكل كبير بطفرة D112E (الشكل 1).6d والتكميلي تين. 3). مجتمعة، تشير هذه النتائج إلى أن ربط GBTA يتم تعزيزه من خلال التفاعل بين الأطراف الخارجية لشظايا S1 في الوحدات الفرعية Hv1 المجاورة من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية الجذابة أو من خلال تكوين روابط تساهمية بين السيستين المستبدلة، ويزيد الاقتران الخيفي بين المواقع ويؤدي إلى تعاون ملزم. في حين أنه يمكن إلغاء تأثير التفاعلات الكهروستاتيكية الجذابة على التعاونية عن طريق الطفرة D112E، إلا أن تأثير الروابط التساهمية لا يمكن إلغاءه. في استكشافنا للمساحة الكيميائية المتاحة لربط مشتقات الجوانيدين بقنوات Hv1، وجدنا أن 2-جوانيدينوثيازول مثل GBTA لديهم اعتماد أكثر حدة على التركيز من 2-جوانيدينوبنزيميدازول (الشكل 1 ج). تحليل معامل هيل لربط GBTA لكل من ثنائي جوانيدين والقنوات الأحادية (الشكل 2 أ، ب) والقناة الخافتة التي كانت فيها وحدة فرعية واحدة مرتبطة مسبقًا بالمثبط (الشكل 4) قادتنا إلى استنتاج أن تثبيط Hv1 بواسطة GBTA الإجراء هو عملية تآزرية، و مواقع الربط للمركبات في الوحدتين الفرعيتين مقترنة بشكل تفارغي. إن اكتشاف أن GBTA يرتبط بالقناة المفتوحة، كما هو موضح سابقًا للمركب ذي الصلة 2GBI32، يشير إلى أنه يمكن تقييم الاقتران التفارغي على وجه التحديد في الحالة المفتوحة. نموذج الارتباط التعاوني الخاص بنا كان قادرًا على الوصف الكمي لتثبيط Hv1 بواسطة GBTA (الشكل 2 ج) وشرح التأثيرات المختلفة لـ 2GBI وGBTA على انحلال تيارات ذيل القناة بعد إعادة استقطاب الغشاء، وهو ما يدعم تفسيرنا لعملية الربط. الحد الأقصى لمعامل التل الذي يمكن تحقيقه في بروتين allosteric مع موقعين ربطين (مثل HV1) هو 2. نقاس GBTA لربط النوع البري HV1 مع معامل 1.31 ، والتي زادت إلى 1.88 في HV1 I127C.Thethethethethethethethethe كان الطاقة الحرة التآزرية ، والفرق بين الطاقات الحرة الملزمة لأدنى وأعلى مواقع التقارب (انظر الطرق) ، 1.3 كيلو كالوري/مول في حالة النوع البري HV1 و 2.7 كيلو كالوري/مول في حالة HV1 I127C. من الأكسجين إلى الهيموغلوبين هو المثال الأكثر شهرة والدراسة الجيدة للعملية التعاونية 38. بالنسبة للهيموغلوبين البشري (رباعي الأبراج مع أربعة مواقع ربط مقترنة بشكل متقلد) ، يتراوح معامل التل من 2.5-3.0 ، مع قيم تتراوح من 1.26 إلى 3.64 KCAL/MOL ، اعتمادًا على الظروف التجريبية 38. ثم ، من حيث الطاقة العالمية ، لا يختلف تعاون GBTA المرتبط بـ HV1 اختلافًا كبيرًا عن الربط O2 إلى الهيموغلوبين عند النظر في الأرقام المختلفة للوحدات الفرعية للبروتين في النظامين. في نموذج التآزر الخاص بنا ، يؤدي ربط جزيئات GBTA إلى وحدة فرعية واحدة إلى زيادة في التقارب الملزم للوحدة الفرعية المجاورة. التغييرات في التفاعلات بين الوحدات الفرعية. الاستجابة لهذه التغييرات ، تغير الوحدات الفرعية المجاورة مواقع الربط الخاصة بها ، مما يؤدي إلى ارتباط GBTA أكثر تشددًا. وقد سبق أن أظهر أنه جزء من مسار تخلل بروتون HV1 وأن ​​يكون بمثابة مرشح الانتقائية 27،28. تظهر نتائجنا أن مرشحات الانتقائية في الوحدات الفرعية HV1 مقترنة بشكل خبيث في الحالة المفتوحة. الشكل 7A يوضح الموقع التقريبي لموقع الربط GBTA وموقع البقايا D112 و D123 و K125 و I127 على مخطط HV1 VSD. على التركيب البلوري للشيميرا HV1-CIVSP. يتم عرض الاتجاهات المخصصة للاقتران اللطيف الذي ينطوي على الطرف خارج الخلية من S1 مع الأسهم السوداء. (أ) تخطيطي لـ HV1 VSD.BOSS على التركيب البلوري لشيميرا HV1-CIVSP ، تُظهر الأجزاء الحلزونية أنها أسطوانية. في هذا التكوين ، تندمج الطرف الداخلي لقطاع S4 مع CCD (غير مبين). يتم عرض المواقع المتوقعة لـ GBTA المرتبطة على أنها بيضاوية رمادية. تشير الأسهم إلى مسارات متورطة في اقتران allosteric بين مواقع الربط في وحدات فرعية مجاورة. يتم ترتيب مواقع بقايا S1 التي تم التحقيق فيها مع مجالات ملونة. (ب) توضيح تخطيطي للوحدات الفرعية HV1 التي تم ترتيب في تكوينين مختلفين مختلفين كما هو موضح من الجانب خارج الخلية من مستوى الغشاء. على اللوحة اليسرى ، يتم تشكيل واجهة Dimer بواسطة حلزوني S4. ينتج عن الفصل بين الأطراف الخارجية للطائرات S4 (السهام المتقطعة) ، وينتج الترتيب الموضح على اليمين. في هذا التكوين ، يُسمح بقايا D123 و I127 من الوحدات الفرعية المجاورة للاقتراب معًا. (ج) تمثيل تخطيطي لـ Civsp VSD في تكوين Dimer الموجود في الهيكل البلوري 4G80. الموضع P140 في CIVSP يتوافق مع الموضع D123 في HV1. تظهر نتائجنا أن التفاعل الإلكتروستاتيكي المثير للاشمئزاز بين البقايا 123 (123D/123D أو 123R/123R) يرتبط بمستوى "طبيعي" من تعاون GBTA في الحالة المفتوحة ويحول التفاعل من التنافر إلى جذب (123D/123R) ، زيادة التعاون (الشكل 5G). ومن المتوقع أن يؤدي إزالة التفاعل البغيض مع استبدال الألانين أيضًا إلى زيادة التعاونية. ومع ذلك ، لوحظ انخفاض في التعاون في Dimer 123A/123A (الشكل 5E). التفسير هو أن تأثير زعزعة الاستقرار لوضع البقايا مسعور في بيئة محبة للماء قد يفوق تأثير الاستقرار بسبب القضاء على التفاعلات البغيضة بين بقايا D123 ، مما يؤدي إلى انخفاض إجمالي في التعاونية الملزمة. يتم زيادة الموضع D171 من Ciona gutis CI-HV1 (المقابلة لـ D123 في HV1 البشري) عند التنشيط ، مما يدعم فكرة أن D123 يقع في بيئة ماء في الحالة المفتوحة. من المعروف أن بوابة قنوات HV1 تحدث من خلال تحولات متعددة 19،20،26،39،40،41.qiu et al26 وجدت أنه عند إزالة الاستقطاب الغشائي ، لا يزال مستشعر الجهد لـ CI-HV1 يخضع لتغيير مطابق يترك القناة المنشطة ولكن لا يزال مغلقًا ، يليه انتقال متميز يتسبب في فتح البروتونات في كل من المسار الفرعي. تم رصد التغيير التوافقي لمستشعر الجهد بواسطة مضان من المشبك الجهد ، ووجد أن الانتقال الثاني كان مضطربًا بشكل انتقائي من الطفرة في الموضع D171. يتسق اضطراب إشارة الفلورسنت مع وجود التفاعلات الإلكتروستاتيكية بين بقايا D171 للوحدات الفرعية المجاورة في مرحلة ما على طول إحداثيات التفاعل للتغيير التوافقي. هذا التفسير يتسق مع اكتشافنا أن مخلفات D123 تتفاعل كهربائيًا في الحالة المفتوحة ويتوسط اقتران allosteric بين مواقع ربط GBTA. اقترح Fujiwara et al25 أن الواجهة الخافتة لمجال الويلزية ملفوفة السيتوبلازمية تمتد إلى الغشاء لاحتواء حلزتين S4 (الشكل 7 ب ، اللوحة اليسرى). يعتمد نموذج من هذا التفاعل بين intersubunit كامل VSD والتحليل الوظيفي للمنطقة التي تربط الحلزون S4 و CCD.In عدم وجود تدرج الأس الهيدروجيني عبر الغشاء ، تتطلب قنوات HV1 استقطاب غشاء كبير لفتح ، ويحدث تشابك السيستين في ظل الظروف التي يتم فيها إغلاق القناة في الغالب. لذلك ، من المحتمل أن تعكس واجهة S4-S4 المكتشفة تكوين الوحدة الفرعية خارج الدولة. وقد وجدت الدراسات الأخرى أدلة على تورط S1 و S2 في تفاعلات intersubunit خلال Gating17،21،26 التي تشير إلى أن القنوات قد تعتمد تكوينات فرعية مختلفة في المفتوحة و حالات مغلقة ، وهي فكرة تتفق مع نتائج موني وآخرون. يتحرك S1 39 أثناء البوابات. هنا ، نوضح أنه في الحالة المفتوحة ، تكون الأطراف خارج الخلية لسلاسة S1 قريبة بما يكفي لدعم التفاعلات الإلكتروستاتيكية المباشرة التي تتوسط في اقتران المائل بين الوحدات الفرعية. في تكوين Dimer مع تفاعلات S4-S4 الموسعة ، تكون S1 Helices بعيدة جدًا بصرف النظر عن بعضها البعض للتفاعل مباشرة. على الرغم من ذلك ، فإن دوران 20 درجة في اتجاه عقارب الساعة من وحدتي VSD حول محور عمودي على مستوى الغشاء ، جنبا إلى جنب مع فصل الطرفي الخارجي للسلان S4 ، أسفر عن تكوين S1-S1 متسق مع النتائج التي توصلنا إليها (الشكل 7 ب ، اللوحة اليمنى). نوصي بهذا التكوين للقناة في الحالة المفتوحة. على الرغم من أنه يُعتقد أن إنزيم CIVSP يعمل كمونومر ، إلا أنه يتم التقاط البنية البلورية لـ VSD المعزولة في حالة خافتة. الأطراف الخارجية لملحوم S1 في هذا الخافت قريبة مكانيًا ، والتكوين العام يشبه ذلك المقترح بالنسبة لـ HV1 (الشكل 7C). في CIVSP Dimer ، كان أقرب بقايا من الوحدة الفرعية المجاورة هو البرولين في الموضع 140 (الشكل 7C). ويشير Civsp Dimers إلى أن VSDs لهذه البروتينات لها ميل جوهري لتشكيل واجهة حيث تتفاعل الأطراف خارج الخلية S1. إن الدور الأساسي لـ HV1 في تنشيط خلايا الحيوانات المنوية يجعل هذه القناة هدفًا جذابًا للدواء للسيطرة على خصوبة الذكور. البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يعانون من الثدي 12 أو سرطان القولون والمستقيم 13 ويعتقد أنه يساهم في الأورام الخبيثة في الخلايا B 11. قد تؤدي الوحدة الفرعية المفتوحة HV1 ، مما يؤدي إلى زيادة تقارب الربط ، إلى تطوير أدوية أكثر قوة تستهدف قنوات HV1. تم إجراء الطفرات الموجه إلى الموقع لـ HV1 البشري باستخدام تقنيات PCR القياسية. في بنية HV1NCCIVSP ، تم استبدال المخلفات 1-96 و 228-273 من HV1 بمخلفات 1-113 و 240-576 من CIVSP18.in الأتير المرتبط HV1 ، يرتبط الطرف C لوحدة فرعية واحدة إلى الطرف N من الوحدة الفرعية الثانية من خلال رابط GGSGGSGGSGSGSGGG. طقم نسخ T7 mmessage Mmachine (Ambion) .1-3 أيام قبل القياسات الفيزيولوجية الكهربية ، تم حقن CRNA في البويضات Xenopus (50 NL لكل خلية ، 0.3-1.5 ميكروغرام/ميكرولتر). من العلوم البيولوجية Ecocyte. تتبع حقن الحمض النووي الريبي ، تم الحفاظ على الخلايا في وسط ND96 يحتوي على 96 ملم كلوريد الصوديوم ، 2 ملم KCl ، 1.8 مم cacl ، 1 مم ملغ ، 10 ملم HEPES ، 5 ​​مم البيروفات ، 100 ميكروغرام/مل ، ph 7.2 18 درجة مئوية . 2-Guanidino-benzimidazole [1] ، 2-Guanidino-benzothiazole [2] ، (4-methyl-1،3-thiazol-2-yl) guanidine [5] ، (5-bromo-4-methyl-1،3 -THIAZOL-2-yl) guanidine) [6] ، إيثيل 2-Guanidino-5-methyl-1،3-thiazole-4-carboxylate [8] ، إيثيل 2-غواندينو -4- ميثيل -1،3-ثاازول-- 5-carboxylate [9] و (2-Guanidino-4-methyl-1،3-thiazol-5-yl) كانت إيثيل أسيتات [10] من سيجما ألدريتش. فاميوتيدين [7] كان من MP Biomedicals.1- [4 -(4 كلوروفينيل) -1،3-ثيازول -2-ييل] guanidine [11] و 1- [4- (3،4-dimethoxyphenyl) -1،3- Thiazol-2-yl] guanidine [12] من المصفوفة العلمية. هذه المركبات من أعلى نقاء متوفرة تجاريًا. تم إذابةها في DMSO الجافة لإنشاء محلول مخزون 100 مم ، والذي تم تخفيفه بعد ذلك في محلول التسجيل في التركيز النهائي المطلوب. ما لا يقل عن 99 ٪ نقاء. لتعليق 2-amino-4- (trifluoromethyl) تمت إضافة هيدروكلوريد البنزنيثول (1.02 جم ، 4.5 مليمول) في 25 مل من حمض الهيدروكلوريك المائي (2.5 ن) تم تراجعه مع التحريك القوي لمدة 4 ساعات. تم تبريد خليط التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة وتحييده عن طريق الإضافة التدريجية من هيدروكسيد البوتاسيوم 10N. تم ترشيح الترسب الأبيض المتكون ، وغسله بالماء البارد (3 × 50 مل) ، المجفف في الفرن ( 65 درجة مئوية) لعدة ساعات ، ثم إعادة بلورة من إيثيل أسيتات/الأثير البترولي لإعطاء صلبة بيضاء (500 ملغ ، 48 ٪) ؛ MP 221–222 درجة مئوية (الضوء 225-226 درجة مئوية) 45 ؛ 1H NMR (500 MHz ، DMSO-D6): Δ [ppm] = 7.25 (S wagr للغاية ، 4 ساعات) ، 7.40 (D ، 1 H ، J = 8.1 Hz) ، 7.73 (S ، 1 H) ، 7.92 (D ، 1 H ، J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz ، DMSO-D6): Δ = 114.2 (D ، J = 3.5 Hz) ، 117.5 (D ، J = 3.5 Hz) ، 121.7 ، 124.6 (Q ، J = 272 هرتز) ، 126.1 (q ، j = 272 هرتز) = 31.6 هرتز) ، 134.8 ، 152.1 ، 158.4 ، 175.55.hrms (ESI): m/z القيمة المحسوبة. : 261.0419. نافتو [1،2-D] ثيازول -2 أمين (300 ملغ ، 1.5 مليمول) ، تم تصنيعه كما هو موضح سابقًا ، تم تسخينه إلى 200 درجة مئوية في حمام زيت في أنبوب اختبار صغير. تمت إضافة 1.0 مل conc. إلى المركب الساخن حامض الهيدروكلوريك بسرعة وتم الاحتفاظ بالمزيج في حمام الزيت لمدة دقيقتين تقريبًا ، وخلال ذلك الوقت تبخرت معظم الماء. ثم تم تبريد خليط التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة والمواد الصلبة الناتجة تم تقسيمها إلى قطع صغيرة وغسلها بالماء لتوفير صلبة غير متبلورة أصفر شاحب. (38 ملغ ، 10 ٪) MP 246-250 درجة مئوية ؛ 1H NMR (500 MHz ، DMSO-D6 ، D2O): Δ [جزء في المليون] = 7.59 (T ، 1 H ، J = 8.2 Hz) ، 7.66 (T ، 1 H ، J = 8.3 Hz) ، 7.77 (D ، 1 H) ، J = 8.6 Hz) ، 7.89 (D ، 1 H ، J = 8.6 Hz) ، 8.02 (D ، 1 H ، J = 8.2 Hz) ، 8.35 (D ، 1 H ، J = 8.3 Hz) .13C NMR (150 MHZ ، DMSO-D6): Δ = 119.9 ، 122.7 ، 123.4 ، 123.6 ، 126.5 ، 127.1 ، 128.7 ، 132.1 ، 140.7 ، 169.1.HRMS (ESI): m/z value. ، وجدت: 243.0704. تم قياس تيارات البروتون في بقع داخلية وخارجية من البويضات التي تعبر عن بنيات مختلفة باستخدام مضخم Axopatch 200b الذي يتحكم فيه بواسطة محور عصبي Digidata 1440a (الأجهزة الجزيئية) مع برنامج PCLAMP10. ) حمض الإيثانيسولفونيك (MES) ، 30 ملم رباعي ميثيل الأمونيوم (TEA) ، كلوريد الشاي 5 ملم ، 5 ملم الإيثيلين غليكول-بيس (2-أمين إيثيل) -N ، N ، N '، حمض N'-tetraacetic (EGTA) الرقم الهيدروجيني 6.0 مع هيدروكسيد الشاي. تم إجراء جميع القياسات عند 22 ± 2 درجة مئوية. يحتوي ماصة على مقاومة للوصول من 1.5-4 MΩ. تم ترشيح آثار current عند 1 كيلو هرتز ، وأخذ عينات من 5 كيلو هرتز وتحليلها باستخدام clampfit10.2 (الأجهزة الجزيئية ) و Origin8.1 (OriginLab). تم إدخال حلول تحتوي على تركيزات مختلفة من مثبط HV1 وفي بعض الحالات تم إدخال 10 مم βME في الحمام عن طريق الجاذبية من خلال مشعب متصل بنظام صمام نضح VC-6 (Warner Instr. منطق الترانزستور) تم إجراء إشارات. تجارب نضح Rapid باستخدام قلم رصاص نضح متعدد الأنبوب (أتمتة SCI) +120 mV depolarizing pulse.gv تم إجراء قياسات كما هو موضح سابقًا 18،20. تم تسجيل التيارات في -40 mV بعد خطوات إزالة الاستقطاب في فولتية مختلفة من -20 mV إلى +120 mV ما لم ينص على خلاف ذلك. تستخدم لتصحيح الاضمحلال الحالي 18. الرسم البياني GV يناسب معادلة بولتزمان: تم تحديد ثوابت التفكك الظاهرة (KD) لمجموعات مختلفة من القنوات ومثبطات (الجدول التكميلي 1) عن طريق تركيب الاعتماد على تركيز التثبيط (متوسط ​​قيم Inhib) مع معادلة التل: حيث [i] هو تركيز المانع I و H هو معامل التل. لحساب معامل التل ، يتم إعادة ترتيب المعادلة (2) على النحو التالي: