Разпитване на междусубединичния интерфейс на отворения Hv1 протонен канал с алостерично свързана сонда

Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да сте сигурни продължителна поддръжка, ние ще покажем сайта без стилове и JavaScript. Hv1 волтаж-зависимият протонен канал е димерен комплекс, състоящ се от два напрежение-чувствителни домена (VSDs), всеки от които съдържа зависим протонен път на проникване. Димеризацията се контролира от цитоплазмения навито-спирален домен. Преходът от затворено състояние към известно е, че отвореното състояние в двата VSD възниква съвместно; обаче, малко се знае за основните механизми. Междусубединичните интерфейси играят ключова роля в алостеричните процеси; обаче, такива интерфейси не са идентифицирани в отворени Hv1 канали. Тук ние демонстрираме, че 2-гуанидинотиазоловите производни блокират две Hv1 VSDs по съвместен начин и използват едно от тези съединения като сонда за алостерично свързване между отворени субединици. Открихме, че извънклетъчната краят на първия трансмембранен фрагмент на VSD образува междусубединен интерфейс, който медиира свързването между местата на свързване, докато домейнът на спиралата не е пряко включен в този процес. Открихме също убедителни доказателства, че протон-селективният филтър на канала контролира кооперативността на свързване на блокер . Волтаж-зависимите протонни канали играят важна роля в различни организми, от фитопланктона до хората1. В повечето клетки тези канали медиират изтичането на протони от протонната мембрана и регулират активността на NADPH оксидазата. Единственият известен волтаж-зависим протонен канал при хората е Hv1, който е продукт на гена HVCN12,3. Доказано е, че Hv1 (известен още като VSOP) играе роля в пролиферацията на В клетките4, производството на реактивни кислородни видове от вродената имунна система5,6,7,8, сперматозоиди регулиране на подвижността9 и рН на повърхностната течност на дихателните пътища10. Този канал участва в няколко Свръхекспресирани видове рак, като В-клетъчни злокачествени заболявания4,11 и рак на гърдата и колоректален рак12,13. Установено е, че прекомерната Hv1 активност увеличава метастатичния потенциал на раковите клетки11,12. В мозъка Hv1 се експресира от микроглия и е доказано, че неговата активност влошава увреждането на мозъка при модели на исхемичен инсулт. Протеинът Hv1 съдържа волтаж-чувствителен домен (VSD), който се състои от четири трансмембранни сегмента, наречени S1 до S414. VSD прилича на съответните домейни на волтаж-зависими Na+, K+ и Ca2+ канали и чувствителни на напрежение фосфатази, като CiVSP от Ciona gutis15. В тези други протеини С-краят на S4 е прикрепен към ефекторен модул, домен на порите или ензим. В Hv1, S4 е свързан с домена със спирала (CCD), разположен от цитоплазмената страна на мембраната .Каналът е димерен комплекс, състоящ се от две VSD, всяка от които съдържа затворена пътека на проникване на протони 16,17,18. Установено е, че тези две Hv1 субединици се отварят съвместно 19,20,21,22, което предполага, че алостеричното свързване и взаимодействията между субединиците играят важна роля в процеса на стробиране. Интерфейсът между субединиците в рамките на домейна на спиралата на намотката е добре дефиниран, тъй като кристалните структури на двата изолирани домена са налични 22, 23. От друга страна, интерфейсът между VSD в рамките на мембраната не е добре разбрана. Кристалната структура на Hv1-CiVSP химерния протеин не предоставя информация за този интерфейс, тъй като тримерната организация на кристализирания канален комплекс може да е резултат от заместването на нативния Hv1 CCD с дрожден левцин цип GCN424. Неотдавнашно проучване на организацията на субединицата на канала Hv1 заключава, че две спирали S4 преминават в CCD без сериозно разрушаване на вторичната структура, което води до дълги спирали, които започват от мембраната и се издават в цитоплазмата. Въз основа на анализ на омрежване на цистеин, това проучване предлага Hv1 VSD да контактуват помежду си по S4 сегмента. Въпреки това, други проучвания предлагат алтернативни интерфейси между VSD. Тези интерфейси включват S1 сегменти 17, 21, 26 и външните краища на S2 сегмент 21. Възможна причина за конфликта Резултатите от тези проучвания са, че алостеричното свързване между VSD е изследвано във връзка с процеса на стробиране, който зависи от затворените и отворените състояния, а интерфейсът между VSD може да варира в различни промени в състоянието на конформацията. Тук открихме, че 2-гуанидинотиазолът инхибира Hv1 каналите чрез синергично свързване към две отворени VSD и използвахме едно от съединенията, 2-гуанидинобензотиазол (GBTA), за изследване на взаимодействието между субединиците в отворено състояние. Открихме, че кривата на свързване на GBTA може да бъде добре описана чрез количествен модел, при който свързването на инхибитор към една субединица води до увеличаване на афинитета на свързване на съседната субединица. Открихме също, че остатъците D112, селективни филтри за канал 27, 28 и част от мястото на свързване на гуанидиново производно 29 контролира кооперативността на свързване на GBTA. Ние показваме, че кооперативното свързване се поддържа в димера Hv1, където CCD се отделя от сегмента S4, което предполага, че интерфейсът между субединиците в CCD не директно медиира алостеричното свързване между GBTA-свързващите места. За разлика от това, ние откриваме, че S1 фрагментът е част от интерфейса между субединиците и предлагаме подреждане на съседни VSDs с извънклетъчния край на S4 спиралата далеч от центъра на димера, за да позволи фрагментът S1 да бъде в отворено състояние. Малкомолекулни инхибитори на Hv1 са полезни като противоракови лекарства и невропротективни агенти. Досега обаче малко съединения са успели да инхибират канала 30,31,32,33. Сред тях 2-гуанидинобензимидазол (2GBI, съединение [1] на фиг. 1a) и неговите производни е установено, че блокират VSD29,32 проникването на протони през канала. Смята се, че свързването на такива съединения се осъществява независимо в двете отворени субединици. преди това беше показано, че инхибира Hv1 почти толкова ефективно, колкото 2GBI, когато се тества при концентрация от 200 μM (Фигура 1b). Ние изследвахме други производни на тиазол и открихме, че някои от тях инхибират канала с подобна или по-голяма сила от GBTA (Фигура 1 и Допълнителна текст). Ние определихме кривите на реакцията на концентрация на четири тиазолови производни (GBTA и съединения [3], [6] и [11], Фиг. 1c) и установихме, че те са по-стръмни от тези на 2GBI. Коефициентите на Hill (h) на тиазоловите производни варира от 1.109 ± 0.040 до 1.306 ± 0.033 (фиг. 1c и допълнителна фигура 1). За разлика от това коефициентът на Hill за 2GBI е 0,975 ± 0,024 29, фигура 2a и допълнителна фигура 1). Коефициентът на Hill над 1 показва кооперативност на свързване. Тъй като всяка Hv1 субединица има свой собствен инхибитор- място на свързване, 29, 32 ние разсъждавахме, че свързването на тиазолово производно към една субединица може да подобри свързването на втора инхибиторна молекула към съседната субединица. GBTA беше тестовото съединение с най-високия коефициент на Hill. Следователно, ние избрахме това съединение за по-нататъшно изследване на механизма на синергия на свързване и използване на 2GBI като референтна отрицателна контрола. (a) Тествани съединения: [1] Референтен Hv1 инхибитор 2-гуанидино-бензимидазол (2GBI).[2] 2-гуанидино-бензотиазол (GBTA), [3] (5-трифлуорометил-1,3-бензотиазол-2-ил)гуанидин, [4] нафто[1,2-d][1, 3] тиазол-2-ил -гуанидин, [5](4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин, [6](5-бромо-4-метил-1,3-тиазол-2-ил)гуанидин, [7] фамотидин, [8] етилов естер на 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилова киселина, [9] 2-гуанидино-4-метил етил-1,3-тиазол-5-карбоксилат, [10 ](2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил)етил ацетат, [11]1-[4-(4-хлорофенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин, [ 12]1-[4-(3,4-диметоксифенил)-1,3-тиазол-2-ил]гуанидин. (b) Инхибиране на човешка Hv1 активност от посочените гуанидинотиазоли и референтното съединение 2GBI (синьо-зелени ленти) .Hv1 протонните токове бяха измерени в обърнати отвътре навън плаки на ооцити на Xenopus в отговор на деполяризация от задържащ потенциал от -80 mV до +120 mV. Всеки инхибитор беше добавен към банята в концентрация от 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Данните са средни ±SEM (n≥4).(c) Зависещо от концентрацията инхибиране на човешки Hv1 от съединения [2], [3], [6] и [11]. Всяка точка представлява средното инхибиране ± SD от 3 до 15 измервания. Линията е напасване по Хил, използвано за получаване на привидните стойности на Kd, докладвани в допълнителна таблица 1. Коефициентите на Хил са определени от напасванията, докладвани на допълнителна фигура 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (вижте Методи). (a,b) Съединения 2GBI и GBTA инхибират димерен и мономерен Hv1 по начин, зависим от концентрацията. Всяка точка представлява средното инхибиране ± SD от 3 до 8 измервания и кривата е подходяща за Хил. Коефициентите на Хил (h), показани в вмъкнатите хистограми са определени от съвпаденията, докладвани в допълнителни фигури 3 и 4. Концентрационният отговор на GBTA, показан на (a), е същият като този на фигура 1c. Вижте допълнителна таблица 1 за очевидните стойности на Kd. (c) Моделиране на кооперативното свързване на GBTA към димерния Hv1. Плътната черна линия представлява съответствието с експерименталните данни чрез уравнение (6), което описва модела на свързване, показан в (d). Прекъснатите линии, обозначени с Sub 1 и Sub 2, представляват бимолекулярната асоциация - дисоциационни равновесни криви съответно на първото и второто събитие на свързване (Под 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Под 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Схематична диаграма на предложения механизъм на Hv1 блока. В случая на GBTA, свързването към една отворена субединица увеличава афинитета на съседната отворена субединица (Kd2 0,05) намаление на коефициента на Hill на свързване на GBTA с GGG канали в сравнение с дивия тип (фиг. 5c), което предполага, че въпреки ролята му в поддържането на две субединици заедно са важни, но CCD не медиира директно алостеричното свързване между субединиците между местата на свързване на GBTA. (a) Схематична диаграма на Hv1 димера с триглицинова мутация във вътрешния край на S4, предназначена да разруши свързването между субединиците, медиирано от цитоплазмения навит домен (сини стрелки). (b) Схематично представяне на Hv1 димери и димери на лигиране с посочени мутации, предназначени да тестват S1 фрагменти, участващи в свързването между субединици (сини стрелки). (c–h) 2GBI (циан) и GBTA (тъмно червено) инхибират посочените конструкции по начин, зависим от концентрацията. Всяка точка представлява средното инхибиране ± SD от 3 до 10 измервания. Кривата беше напасване по Хил, използвано за получаване на привидни стойности на Kd (вижте допълнителна таблица 1). Коефициентите на Хил в интерполираните хистограми бяха определени, както е описано в раздела за методи (вижте допълнителни фигури 3 и 4). Референтни h стойности за Hv1 WT са показани като пунктирани линии. Звездичките показват статистически значими разлики между мутантни и WT пасажи (р 0.05, Фиг. 5d,i ) ). От друга страна, мутацията D123A значително намалява коефициента на Хил на GBTA (p 0,05/14). Тъй като неутрализирането на заряда в позиция 123 на двете субединици доведе до силна промяна в кооперативността на свързване на GBTA, докато обръщането на заряда на двете субединици имаше само малък ефект, ние разширихме анализа, за да включим само една субединица с инверсионния канал на заряда. генерира Hv1-свързани димери с D123R заместване в С-терминалната субединица (фиг. 5b) и измерва инхибирането на реакцията концентрация от GBTA и 2GBI. Ние открихме, че коефициентът на Хил на свързване на GBTA към WT-D123R каналите е значително по-висок от този на Hv1 от див тип (p 0,05). Ние също така открихме, че в отсъствието на βME, коефициентът на Хил на свързване на GBTA към димера D112E I127C Hv1 е значително по-висок от този, измерен в присъствието на редуциращи агенти (фиг. 6e и допълнителна фигура 4), което означава, че мутацията D112E не премахна увеличаването на GBTA свързващата кооперативност в резултат на кръстосаното свързване на цистеин 127. Коефициентът на Хил на 2GBI свързване към D112E, I127C Hv1 димерите също не беше значително повлиян от D112E мутацията (Фигура 1).6d и Допълнителна Фиг. 3). Взети заедно, тези констатации предполагат, че свързването на GBTA се засилва от взаимодействието между външните краища на S1 фрагменти в съседни Hv1 субединици чрез атрактивни електростатични взаимодействия или чрез образуване на ковалентни връзки между заместени цистеини. Алостеричното свързване между местата се увеличава и води до кооперативност на свързване. Докато ефектът на привлекателните електростатични взаимодействия върху кооперативността може да бъде премахнат чрез мутация D112E, ефектът на ковалентните връзки не може. В нашето изследване на химическото пространство, налично за свързване на гуанидиновите производни към Hv1 каналите, открихме, че 2-гуанидинотиазоли като GBTA имат по-стръмна зависимост от концентрацията, отколкото 2-гуанидинобензимидазолите (фиг. 1c). Анализът на коефициента на Хил на свързването на GBTA към димерите и мономерни канали (Фиг. 2a, b) и към димерния канал, в който една субединица е предварително свързана с инхибитора (Фиг. 4), ни накараха да заключим, че инхибирането на Hv1 от GBTA Действието е синергичен процес и местата на свързване на съединенията в двете субединици са алостерично свързани. Откритието, че GBTA се свързва с отворения канал, както беше показано по-рано за свързаното съединение 2GBI32, предполага, че алостеричното свързване може да бъде специфично оценено в отворено състояние. Нашият модел на кооперативно свързване беше в състояние да опише количествено инхибирането на HV1 от GBTA (фиг. 2С) и да обясни различните ефекти на 2GBI и GBTA върху разпадането на задните токове на канала след реполяризация на мембраната, което подкрепя нашата интерпретация на процеса на свързване. Максималният коефициент на хълм, който може да бъде постигнат в алостеричен протеин с две места на свързване (като HV1), е 2. Измервахме GBTA, за да свържем HV1 див тип с коефициент 1,31, който се увеличава до 1,88 в HV1 I127C.Те Синергична свободна енергия, разликата между свободните енергии на свързване на най-ниските и най-високите места за афинитет (виж методите), е 1,3 kcal/мол в случай на HV1 див тип и 2,7 kcal/мол в случай на HV1 I127C. Свързването от кислород до хемоглобин е най-известният и добре проучен пример за процеса на сътрудничество38.За човешкия хемоглобин (тетрамер с четири алостерично свързани свързващи места), коефициентът на хълма варира от 2,5-3,0, като стойности варират от 1,26 до 3.64 KCAL/MOL, в зависимост от експерименталните условия38.Thus, по отношение на глобалната енергийна енергия, кооперативността на GBTA свързването с HV1 не се различава съществено от тази на свързването на O2 с хемоглобин, когато се разглеждат различния брой протеинови субединици в двете системи. В нашия модел на синергия, свързването на GBTA молекулите с една субединица води до увеличаване на афинитета на свързване на съседната субединица. Предвиждаме процес, при който пренареждането на свързващата среда в резултат на първото събитие на свързване (индуцирано прилягане) води до свързване на свързващата среда, произтичащо от първото събитие на свързване (индуцирано приспособяване) до приспособяване на връзката (индуцирано прилягане) Промени във взаимодействията между субединици. В отговор на тези промени, съседните субединици променят местата си за свързване, което води до по -строго свързване на GBTA. По време на този процес S1 аспартатът D112 е отговорен за пренареждането на мястото на свързване, свързан с повишен афинитет на свързване.D112 По -рано беше показано, че е част от пътя на протоновото проникване на HV1 и действа като филтър за селективност27,28. Нашите резултати показват, че филтрите за селективност в двете HV1 субединици са алостерично свързани в отворено състояние. Фигура 7А показва приблизителното местоположение на мястото на свързване на GBTA и местоположението на остатъците D112, D123, K125 и I127 на схема на HV1 VSD базирани върху кристалната структура на HV1-CIVSP химера. Поставените указания за алостерично свързване, включващи извънклетъчния край на S1, са показани с черни стрелки. (A) Схема на HV1 VSD. базирана върху кристалната структура на HV1-CIVSP химера, спиралните сегменти са показани като цилиндрични. В тази конфигурация вътрешният край на сегмента S4 се слива с CCD (не е показано). The predicted locations of bound GBTA are shown as grey ovals.Black arrows indicate pathways involved in allosteric coupling between binding sites in two adjacent subunits.The positions of the investigated S1 residues are marked with colored spheres.(b) Schematic illustration of Hv1 subunits arranged В две различни конфигурации на димери, както се вижда от извънклетъчната страна на мембранната равнина. На левия панел интерфейсът на димер се образува от спирала S4. Рутиране на двете VSDS 20 градуса по посока на часовниковата стрелка около оста, перпендикулярна на мембранната равнина, придружена от Разделяне на външните краища на двата спирали S4 (пунктирани стрелки), произвежда подредбата, показана вдясно. В тази конфигурация остатъците D123 и I127 от съседните субединици се оставят да се приближат заедно. (C) Схематично представяне на CivSP VSD В конфигурацията на димера, намерена в кристалната структура 4G80. Позиция P140 в Civsp съответства на позиция D123 в HV1. Нашите резултати показват, че отблъскващото електростатично взаимодействие между остатък 123 (123d/123d или 123R/123R) е свързано с "нормално" ниво на GBTA-свързваща кооперативност в отвореното състояние и измества взаимодействието от отблъскване към привлечено (123d/123R) , Повишено сътрудничество (фиг. 5G). Очаква се, че отстраняването на отблъскващото взаимодействие с заместване на аланин също би довело до повишена кооперативност. Въпреки това се наблюдава намаляване на кооперативността на димер 123a/123a (фиг. 5Е). Един възможно explanation is that the destabilizing effect of placing hydrophobic residues in a hydrophilic environment may outweigh the stabilizing effect due to the elimination of repulsive interactions between D123 residues, resulting in an overall reduction in binding cooperativity.Mony et al.39 recently reported that solvent accessibility at Позиция D171 на Ciona Gutis CI-HV1 (съответстваща на D123 при човешки HV1) се увеличава при активиране, подкрепяйки схващането, че D123 е разположен в хидрофилна среда в открито състояние. Известно е, че избиването на HV1 канали се случва чрез множество преходи19,20,26,39,40,41.qiu et al26, установяват, че при деполяризация на мембраната, сензорът за напрежение на CI-HV1 претърпява конформационна промяна, която оставя канала, но все пак затворен , последван от различен преход, който кара протоните да отворят проводимостта и в двата пътя на субединици. Конформационната промяна на сензора за напрежение се следи от флуоресценция на напрежението-скоба и беше установено, че вторият преход се избира селективно от мутацията в позиция D171. Смущения на флуоресцентния сигнал е в съответствие с наличието на електростатични взаимодействия между D171 остатъците на съседни субединици в някакъв момент по протежение на реакционните координати на конформационната промяна. Тази интерпретация е в съответствие с нашето откритие, че остатъците от D123 електростатично взаимодействат в открито състояние и медиира алостерично свързване между местата на свързване на GBTA. Fujiwara et al25 предложиха интерфейсът на димерния домейн на цитоплазмената намотка с намотка да се простира в мембраната, за да съдържа два спирала S4 (фиг. 7б, ляв панел). Модел на това междусубанитно взаимодействие се основава на цистеиновия кръстосан анализ). Целият VSD и функционален анализ на региона, свързващ S4 спиралата и CCD. В липсата на трансмембранен рН градиент, HV1 каналите изискват значителна деполяризация на мембраната, за да се отвори, а цистеиновата омрежване се случва при условия, при които каналът е затворен предимно. Следователно, откритият интерфейс S4-S4 вероятно отразява конфигурацията на субединицата извън състоянието. Други проучвания са открили доказателства за участието на S1 и S2 в интерсубедитни взаимодействия по време на Gating17,21,26, което предполага, че каналите могат да приемат различни конфигурации на субединицата в отворената и Затворени държави, идея, съобразена с откритията на Mony et al. S1 се движи 39 по време на Gating. Тук показваме, че в отворено състояние извънклетъчните краища на спиралата на S1 са достатъчно близки, за да поддържат директни електростатични взаимодействия, които посредничат в алостеричното свързване между субединици. В конфигурацията на димера с разширени взаимодействия S4-S4, спиралите на S1 са твърде далеч Освен един от друг, за да си взаимодействат директно. Въпреки това, въртене на 20 ° по посока на часовниковата стрелка на двете VSD субединици около ос, перпендикулярно на мембранната равнина, комбинирана с разделянето на външните краища на двата спирали S4, даде конфигурация на S1-S1 С нашите открития (фиг. 7b, десен панел). Препоръчваме тази конфигурация за канала в отворено състояние. Въпреки че се смята, че ензимът Civsp функционира като мономер, кристалната структура на изолирания му VSD се улавя в димер За HV1 (фиг. 7в). В димер на Civsp най -близкият остатък от съседната субединица е пролин в позиция 140 (фиг. 7в). Интертензивно, P140 в Civsp съответства на позиция D123 в HV1. Сходството в конфигурацията на субединицата между HV1 и Civsp Dimers предполага, че VSDS на тези протеини имат присъща тенденция да образуват интерфейс, при който взаимодействат извънклетъчните краища на S1. Основната роля на HV1 в активирането на сперматозоидите прави този канал привлекателна лекарствена цел за контрол на мъжката плодовитост. Показано е, че активирането на HV1 в микроглията е установено, че влошава възстановяването от исхемичен инсулт. Преживяемост при пациенти с рак на гърдата 12 или колоректален рак 13 и се смята, че допринася за злокачествени заболявания на В-клетки 11. Затова лекарствата с малки молекули, насочени към HV1, могат да бъдат използвани като невропротективни агенти или противоракови терапевтици. Отворената HV1 субединица, което води до повишен афинитет на свързване, може да доведе до разработване на по -мощни лекарства, насочени към HV1 канали. Site-directed mutagenesis of human Hv1 was performed using standard PCR techniques.In the Hv1NCCiVSP construct, residues 1-96 and 228-273 of Hv1 were replaced by residues 1-113 and 240-576 of CiVSP18.In the Hv1-linked dimer, С-края на една субединица е свързан с N-края на втората субединица чрез GGSGGSGGSGSGGSGG LINKER. T7 mmessage Mmachine Transcription Kit (Ambion) .1-3 дни преди електрофизиологичните измервания, CRNA се инжектира в ооцити на Xenopus (50 nl на клетка, 0,3-1,5 μg/μl). От екоцитна биологична информация. Следване на инжектиране на РНК, клетките се поддържат в ND96 среда, съдържаща 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CACL, 1 mM mgcl, 10 mM HEPES, 5 mM пируват, 100 μg/ml гентамицин, рН 7,2 18 ° С . 2-гуанидино-бензимидазол [1], 2-гуанидино-бензотиазол [2], (4-метил-1,3-тиазол-2-ил) гуанидин [5], (5-бромо-4 -метил-1,3 -тиазол-2-ил) гуанидин) [6], етил 2-гуанидино-5-метил-1,3-тиазол-4-карбоксилат [8], етил 2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол- 5-карбоксилат [9] и (2-гуанидино-4-метил-1,3-тиазол-5-ил) етилацетат [10] са от Sigma-Aldrich.Famotidine [7] е от MP биомедицинас.1- [4 -(4-хлорофенил) -1,3-тиазол-2-ил] гуанидин [11] и 1- [4- (3,4-диметоксифенил) -1,3-тиазол-2-ил] гуанидин [12] е бил От Matrix Scientific. Тези съединения са с най -голяма чистота в търговската мрежа. поне 99% чистота. To a suspension of 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) in 25 mL of aqueous hydrochloric acid (2.5 N) was added solid dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol), and the resulting heterogeneous mixture се нахвърля на обратен хладник с енергично разбъркване в продължение на 4 часа. Реакционната смес се охлажда до стайна температура и се неутрализира чрез постепенно добавяне на 10N калиев хидроксид. Формираната бяла утайка се филтрира, промива се със студена вода (3 × 50 ml), сушена във фурна ( 65 ° С) в продължение на няколко часа и след това прекристализиран от етилацетат/нефтен етер, за да се получи бяло твърдо вещество (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (светлина 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7.25 (много широк S, 4 H), 7.40 (D, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (S, 1 H), 7.92 (D , 1 H, J = 8.1 Hz) .13c NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114.2 (D, J = 3.5 Hz), 117.5 (D, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J, J = 272 Hz), 126.1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): m/z Изчислена стойност.За C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, намерени намерени : 261.0419. Нафто [1,2-D] тиазол-2-амин (300 mg, 1,5 mmol), синтезиран, както е описано по-горе, се нагрява до 200 ° С в маслена баня в малка епруветка.300 mg (голям излишък) цианамид и 1,0 ml conc.to горещото съединение се добавя бързо на солна киселина и сместа се съхранява в маслената баня за около 2 минути, през което време по -голямата част от водата се изпарява. След това реакционната смес се охлажда до стайна температура и полученият втвърден материал е разбит на малки парчета и се измива с вода, за да се осигури бледожълт аморфно твърдо вещество. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z Изчислена стойност.О C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , Намерено: 243.0704. Протонните токове се измерват във вътрешни и външни пластири на яйцеклетки, експресиращи различни конструкции, използвайки усилвател на Axopatch 200B, контролиран от аксон Digidata 1440a (молекулярни устройства) със софтуер PCLAMP10. ) Етансулфонова киселина (MES), 30 mM тетраетиламоний (чай) мезилат, 5 mM чаен хлорид, 5 mM етилен гликол-бис (2-аминоетил) -N, n, n ', n'-тетрацетна киселина (EGTA), коригирана до рН 6.0 с чай хидроксид. Всички измервания се извършват при 22 ± 2 ° C. Пипетата има устойчивост на достъп от 1,5–4 MΩ. Токлетите следи се филтрират при 1 kHz, са взети за вземане на проби при 5 kHz и се анализират с clampfit10.2 (молекулярни устройства ) и Origin8.1 (OriginLab). Разтвори, съдържащи различни концентрации на HV1 инхибитор, а в някои случаи 10 mM βME бяха въведени във банята чрез гравитация чрез колектор, свързан към VC-6 перфузионна система (Warner Instr.), Която се преминава през PCLAMP софтуера TTL (Transistor- Транзисторна логика) сигнали. Експериментите с перфузия на реплика се извършват с помощта на многотният перфузионен молив (автоматичен SCI.) С 360 µm диаметър на върха на подаване, монтиран пред петна. +120 MV деполяризиращ импулс. GVV се извършват, както е описано по -горе18,20. Таречните токове се записват при -40 mV след стъпки на деполяризация при различни напрежения от -20 mV до +120 mV, освен ако не е посочено друго. Референтният импулс предхожда тестовия импулс е Използва се за коригиране на текущия разпад 18. Графиката на GV отговаря на уравнението на Boltzmann: очевидните константи на дисоциация (KD) за различни комбинации от канали и инхибитори (допълнителна таблица 1) се определят чрез монтиране на концентрационната зависимост на инхибирането (средни %инхибират стойности) С уравнението на хълма: където [i] е концентрацията на инхибитор I и H е коефициентът на хълма. За да се изчисли коефициентът на хълма, уравнението (2) се пренарежда като: