Dotazování mezipodjednotkového rozhraní otevřeného protonového kanálu Hv1 alostericky vázanou sondou

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro co nejlepší zážitek vám doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v Internet Exploreru). Mezitím, abyste zajistili pokračující podpora, budeme web zobrazovat bez stylů a JavaScriptu. Napěťově řízený protonový kanál Hv1 je dimerický komplex sestávající ze dvou napěťově snímajících domén (VSD), z nichž každá obsahuje hradlovanou protonovou permeační dráhu. Dimerizace je řízena cytoplazmatickou coiled-coil doménou. Přechod z uzavřeného stavu do je známo, že otevřený stav v obou VSD nastává kooperativně; o základních mechanismech je však známo jen málo. Mezijednotková rozhraní hrají klíčovou roli v alosterických procesech; taková rozhraní však nebyla v otevřených kanálech Hv1 identifikována. Zde demonstrujeme, že deriváty 2-guanidinothiazolu blokují dvě VSD Hv1 kooperativním způsobem a jednu z těchto sloučenin používají jako sondu pro alosterické spojení mezi otevřenými podjednotkami. Zjistili jsme, že extracelulární konec prvního transmembránového fragmentu VSD tvoří mezipodjednotkové rozhraní, které zprostředkovává spojení mezi vazebnými místy, zatímco doména coiled-coil není přímo zapojena do tohoto procesu. Našli jsme také silný důkaz, že protonově selektivní filtr kanálu řídí kooperativitu vazby blokátoru . Napěťově řízené protonové kanály hrají důležitou roli v různých organismech, od fytoplanktonu po člověka1. Ve většině buněk tyto kanály zprostředkovávají protonový eflux z protonové membrány a regulují aktivitu NADPH oxidázy. Jediný známý napěťově řízený protonový kanál u lidí je Hv1, který je produktem genu HVCN12,3.Hv1 (aka VSOP) bylo prokázáno, že hraje roli v proliferaci B buněk4, produkci reaktivních forem kyslíku vrozeným imunitním systémem5,6,7,8, spermie motilita9 a regulace pH povrchové tekutiny dýchacích cest10. Tento kanál se podílí na několika nadměrně exprimovaných typech rakoviny, jako jsou B-buněčné malignity4,11 a rakovina prsu a kolorektální karcinom12,13. Bylo zjištěno, že nadměrná aktivita Hv1 zvyšuje metastatický potenciál rakovinných buněk 11, 12. V mozku je exprimován Hv1 mikroglií a bylo prokázáno, že jeho aktivita zhoršuje poškození mozku na modelech ischemické mrtvice. Protein Hv1 obsahuje napěťově citlivou doménu (VSD), která se skládá ze čtyř transmembránových segmentů nazývaných S1 až S414. VSD se podobá odpovídajícím doménám napěťově řízených Na+, K+ a Ca2+ kanálů a napěťově citlivým fosfatázám, jako je CiVSP od Ciona gutis15. V těchto jiných proteinech je C-konec S4 připojen k efektorovému modulu, doméně pórů nebo enzymu. V Hv1 je S4 spojen s doménou coiled-coil (CCD) umístěnou na cytoplazmatické straně membrány Kanál je dimerní komplex skládající se ze dvou VSD, z nichž každá obsahuje hradlovou protonovou permeační dráhu16,17,18. Bylo zjištěno, že tyto dvě podjednotky Hv1 se otevírají kooperativně19,20,21,22, což naznačuje, že alosterická vazba a interakce mezi podjednotkami hrají roli. důležitou roli v procesu hradlování. Rozhraní mezi podjednotkami v doméně coiled coil je dobře definované, protože jsou dostupné krystalové struktury dvou izolovaných domén22,23. Na druhou stranu rozhraní mezi VSD uvnitř membrány není Krystalová struktura chimérického proteinu Hv1-CiVSP neposkytuje informace o tomto rozhraní, protože trimerní organizace komplexu krystalizovaných kanálů může být výsledkem nahrazení nativního Hv1 CCD kvasinkovým leucinovým zipem GCN424. Nedávná studie organizace podjednotek kanálu Hv1 dospěla k závěru, že dvě šroubovice S4 přecházejí do CCD bez vážného narušení sekundární struktury, což má za následek dlouhé šroubovice, které začínají z membrány a vyčnívají do cytoplazmy. Na základě analýzy síťování cysteinu, tato studie navrhuje, aby se Hv1 VSD vzájemně kontaktovaly podél segmentu S4. Jiné studie však navrhly alternativní rozhraní mezi VSD. Tato rozhraní zahrnují segmenty S1 17, 21, 26 a vnější konce segmentu S2 21. Možný důvod konfliktu výsledky těchto studií jsou takové, že alosterická vazba mezi VSD byla zkoumána ve vztahu k procesu hradlování, který závisí na uzavřeném a otevřeném stavu, a rozhraní mezi VSD se může lišit v různých stavových změnách v konformaci. Zde jsme zjistili, že 2-guanidinothiazol inhibuje kanály Hv1 synergickou vazbou na dvě otevřené VSD a použili jsme jednu ze sloučenin, 2-guanidinobenzothiazol (GBTA), ke zkoumání interakce mezi podjednotkami v otevřeném stavu. Zjistili jsme, že vazebnou křivku GBTA lze dobře popsat pomocí kvantitativního modelu, ve kterém vazba inhibitoru na jednu podjednotku vede ke zvýšení vazebné afinity sousední podjednotky. Také jsme zjistili, že zbytky D112, selektivní filtry pro kanál 27, 28 a část vazebného místa guanidinového derivátu 29 řídí vazebnou kooperativitu GBTA. Ukazujeme, že kooperativní vazba je udržována v dimeru Hv1, kde se CCD odděluje od segmentu S4, což naznačuje, že mezipodjednotkové rozhraní v CCD nepůsobí přímo zprostředkovávají alosterické spojení mezi vazebnými místy GBTA. Naproti tomu jsme zjistili, že fragment S1 je součástí rozhraní mezi podjednotkami a navrhujeme uspořádání sousedních VSD s extracelulárním koncem šroubovice S4 směrem od středu dimeru, aby bylo možné aby byl fragment S1 v otevřeném stavu. Inhibitory Hv1 s malou molekulou jsou užitečné jako protirakovinná léčiva a neuroprotektivní činidla. Dosud však jen málo sloučenin dokázalo inhibovat kanál30,31,32,33. Mezi nimi 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, sloučenina [1] na Obr. 1a) a jeho derivátů bylo zjištěno, že blokují VSD29,32 permeaci protonů přes kanál. Předpokládá se, že vázání těchto sloučenin probíhá nezávisle ve dvou otevřených podjednotkách. 2-guanidinobenzothiazol (GBTA, sloučenina [2] na obr. dříve bylo prokázáno, že inhibuje Hv1 téměř stejně účinně jako 2GBI při testování v koncentraci 200 μM (obrázek 1b). Zkoumali jsme další thiazolové deriváty a zjistili jsme, že některé z nich inhibovaly kanál s podobnou nebo větší účinností než GBTA (obrázek 1 a doplňkový text). Stanovili jsme křivky odezvy na koncentraci čtyř derivátů thiazolu (GBTA a sloučenin [3], [6] a [11], obr. 1c) a zjistili jsme, že jsou strmější než křivky 2GBI. Hillovy koeficienty (h) thiazolových derivátů se pohybovala od 1,109 ± 0,040 do 1,306 ± 0,033 (obr. 1c a doplňkový obr. 1). Naproti tomu Hillův koeficient pro 2GBI byl 0,975 ± 0,024 29, obr. 2a a doplňkový obr. 1). Hillův koeficient nad 1 označuje vazebnou kooperativitu. Protože každá podjednotka Hv1 má svůj vlastní inhibitor- vazebné místo,29,32 jsme usoudili, že vazba thiazolového derivátu na jednu podjednotku by mohla zvýšit vazbu druhé molekuly inhibitoru na sousední podjednotku. GBTA byla testovaná sloučenina s nejvyšším Hillovým koeficientem. Proto jsme vybrali tuto sloučeninu dále studoval mechanismus vazebné synergie a použil 2GBI jako referenční negativní kontrolu. (a) Testované sloučeniny: [1] Referenční inhibitor Hv1 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazol (GBTA), [3] (5-trifluormethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidin, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidin, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [6](5-brom-4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [7] famotidin, [8] ethylester 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazol-4-karboxylové kyseliny, [9] 2-guanidino-4-methylethyl-1,3-thiazol-5-karboxylát, [10 [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyfenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidin. (b) Inhibice lidské aktivity Hv1 uvedenými guanidinothiazoly a referenční sloučeninou 2GBI (modrozelené sloupce) Protonové proudy Hv1 byly měřeny v plakech oocytů Xenopus naruby jako odpověď na depolarizaci z udržovacího potenciálu -80 mV až +120 mV. Každý inhibitor byl přidán do lázně v koncentraci 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Data jsou průměr ± SEM (n≥4).(c) Inhibice lidského Hv1 závislá na koncentraci sloučeninami [2], [3], [6] a [11]. Každý bod představuje průměr inhibice ± SD 3 až 15 měření. Čára je Hillův fit použitý k získání zdánlivých hodnot Kd uvedených v doplňkové tabulce 1. Hillovy koeficienty byly stanoveny z proložení uvedených na doplňkovém obrázku 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (viz Metody). (a,b) Sloučeniny 2GBI a GBTA inhibovaly dimerní a monomerní Hv1 způsobem závislým na koncentraci. Každý bod představuje průměrnou inhibici ± SD ze 3 až 8 měření a křivka je Hill fit. Hillovy koeficienty (h) zobrazené na vložené histogramy byly stanoveny z proložení uvedených na doplňkových obrázcích 3 a 4. Koncentrační odezva GBTA znázorněná na (a) je stejná jako na obr. 1c. Zřejmé hodnoty Kd viz doplňková tabulka 1. (c) Modelování kooperativní vazba GBTA na dimerní Hv1. Plná černá čára představuje přizpůsobení experimentálním datům rovnicí (6), která popisuje model vazby znázorněný v (d). Přerušované čáry označené Sub 1 a Sub 2 představují bimolekulární asociaci -disociační rovnovážné křivky první a druhé vazebné události (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Schematický diagram navrhovaného mechanismu Hv1 bloku.V případě GBTA vazba na jednu otevřenou podjednotku zvyšuje afinitu sousední otevřené podjednotky (Kd2 0,05) pokles Hillova koeficientu vazby GBTA na kanály GGG ve srovnání s divokým typem (obr. 5c), což naznačuje, že navzdory jeho roli v udržování dvě podjednotky spolu důležité, ale CCD přímo nezprostředkovává mezipodjednotkové alosterické spojení mezi vazebnými místy GBTA. (a) Schematický diagram dimeru Hv1 s triglycinovou mutací na vnitřním konci S4 navržený tak, aby narušil spojení mezi podjednotkami zprostředkované cytoplazmatickou coiled-coil doménou (modré šipky).(b) Schematické znázornění dimerů Hv1 a ligačních dimerů s označené mutace, navržené k testování fragmentů S1 podílejících se na spojení mezi podjednotkami (modré šipky).(c–h) 2GBI (azurová) a GBTA (tmavě červená) inhibují uvedené konstrukty způsobem závislým na koncentraci. Každý bod představuje průměrnou inhibici ± SD 3 až 10 měření. Křivka byla Hillova proložení použitá k získání zdánlivých hodnot Kd (viz doplňková tabulka 1). Hillovy koeficienty v interpolovaných histogramech byly stanoveny tak, jak je popsáno v části Metody (viz doplňkové obrázky 3 a 4). Referenční hodnoty h pro Hv1 WT jsou zobrazeny jako přerušované čáry. Hvězdičky označují statisticky významné rozdíly mezi pasážemi mutant a WT (p 0,05, obr. 5d,i). ). Na druhé straně mutace D123A významně snížila Hillův koeficient GBTA (p 0,05/14). Protože neutralizace náboje na pozici 123 na obou podjednotkách vedla k silné změně vazebné kooperativity GBTA, zatímco obrácení náboje na obou podjednotkách mělo jen malý účinek, rozšířili jsme analýzu tak, aby zahrnovala pouze jednu podjednotku s inverzním kanálem náboje. generovali dimery spojené s Hv1 se substitucí D123R v C-terminální podjednotce (obr. 5b) a měřili inhibici reakce na koncentraci pomocí GBTA a 2GBI. Zjistili jsme, že Hillův koeficient vazby GBTA na kanály WT-D123R byl významně vyšší než divokého typu Hv1 (p 0,05). Zjistili jsme také, že v nepřítomnosti βME byl Hillův koeficient vazby GBTA na dimer D112E I127C Hv1 významně vyšší než koeficient naměřený v přítomnosti redukčních činidel (obr. 6e a doplňkový obr. 4), což naznačuje, že mutace D112E nezrušilo zvýšení vazebné kooperativity GBTA vyplývající ze síťování cysteinu 127. Hillův koeficient vazby 2GBI na dimery D112E, I127C Hv1 také nebyl významně ovlivněn mutací D112E (obrázek 1).6d a doplňkové Obr. 3). Celkově vzato tato zjištění naznačují, že vazba GBTA je zesílena interakcí mezi vnějšími konci fragmentů S1 v sousedních podjednotkách Hv1 prostřednictvím atraktivních elektrostatických interakcí nebo prostřednictvím tvorby kovalentních vazeb mezi substituovanými cysteiny Alosterická vazba mezi místy se zvyšuje a vede k vazebné kooperativitě. Zatímco vliv atraktivních elektrostatických interakcí na kooperativitu lze zrušit mutací D112E, vliv kovalentních vazeb nikoli. Při našem zkoumání chemického prostoru dostupného pro vazbu derivátů guanidinu na Hv1 kanály jsme zjistili, že 2-guanidinothiazoly jako GBTA mají strmější koncentrační závislost než 2-guanidinobenzimidazoly (obr. 1c). Analýza Hillova koeficientu vazby GBTA na oba dimerní a monomerní kanály (obr. 2a,b) a dimerní kanál, ve kterém byla jedna podjednotka předem navázána na inhibitor (obr. 4), nás vedlo k závěru, že inhibice Hv1 pomocí GBTA Působení je synergický proces a vazebná místa sloučenin ve dvou podjednotkách jsou alostericky spojena. Zjištění, že GBTA se váže na otevřený kanál, jak bylo dříve ukázáno pro příbuznou sloučeninu 2GBI32, naznačuje, že alosterické navázání může být specificky hodnoceno v otevřeném stavu. Náš kooperativní vazebný model byl schopen kvantitativně popsat inhibici HV1 GBTA (obr. 2c) a vysvětlit různé účinky 2GBI a GBTA na rozpad kanálových ocasních proudů po membránové repolarizaci, což podporuje naši interpretaci vazebného procesu. Maximální koeficient kopce, kterého lze dosáhnout v alosterickém proteinu se dvěma vazebnými místy (jako je HV1), je 2. Měřili jsme GBTA pro vázání HV1 divokého typu s koeficientem 1,31, který se zvýšil na 1,88 v Hv1 I127c. Synergická volná energie, rozdíl mezi volnými energiemi vázání nejnižších a nejvyšších afinitních míst (viz metody), byl 1,3 kcal/mol v případě divokého typu HV1 a 2,7 kcal/mol v případě HV1 I127C. kyslíku na hemoglobin je nejslavnějším a dobře studovaným příkladem procesu spolupráce38. pro lidský hemoglobin (tetramer se čtyřmi alostericky spojenými vazebnými místy), koeficient kopce se pohybuje od 2,5 do 3,0, s hodnotami v rozmezí 1,26 do 3,64 Kcal/mol, v závislosti na experimentálních podmínkách38.Thus, pokud jde o globální energetiku, se kooperativita vazby GBTA na HV1 podstatně neliší od vazby O2 na hemoglobin, když se zvažuje odlišný počet proteinových podjednotek ve dvou systémech. V našem modelu synergie má vazba molekul GBTA na jednu podjednotku vede ke zvýšení vazebné afinity sousední podjednotky. Představujeme si proces, ve kterém přestavba vazebného prostředí vyplývá z první vazebné události (indukované přizpůsobení) Změny v interakcích mezi podjednotkami. bylo dříve prokázáno, že je součástí Permeation Permeation Permeation HV1 a působí jako filtr selektivity27,28. Naše výsledky ukazují, že filtry selektivity ve dvou podjednotkách HV1 jsou alostericky spojeny v otevřeném stavu. Nafigus 7a ukazuje přibližné umístění vazebného místa GBTA a umístění zbytků D112, D123, K125 a I127 na schématu HV1 VSD na základě HV1 VSD. Na krystalové struktuře HV1-CIVSP chiméry.Suggeded směry pro alosterickou vazbu zahrnující extracelulární konec S1 jsou znázorněny černými šipkami. (A) Schéma HV1 VSD. založené na krystalové struktuře chiméry HV1-CIVSP, je ukázáno, že helikální segmenty jsou válcovské. V této konfiguraci se spojuje vnitřní konec segmentu S4 s CCD (není ukázáno). Předpokládaná umístění vázaných GBTA jsou znázorněny jako šedé ovály. Šipky Black označují cesty zapojené do alosterické vazby mezi vazebnými místy ve dvou sousedních podjednotkách. Pozice zkoumaných zbytků S1 jsou označeny barevnými koulemi. Ve dvou různých konfiguracích dimeru, jak je vidět z extracelulární strany membránové roviny. Na levém panelu je rozhraní dimeru tvořeno helixem S4. Separace vnějších konců dvou helixů S4 (přerušované šipky), vytváří uspořádání uvedené napravo. V konfiguraci dimeru nalezené v krystalové struktuře 4G80.pozice P140 v CIVSP odpovídá poloze D123 v HV1. Naše výsledky ukazují, že odpudivá elektrostatická interakce mezi zbytkem 123 (123d/123d nebo 123r/123r) je spojena s „normální“ hladinou kooperace vázající GBTA v otevřeném stavu a posune interakci od odpuzování k přitahovanému (123d/123r) , zvýšená spolupráce (obr. 5G). Očekává se, že odstranění odpudivé interakce s alaninovou substitucí by také vedlo ke zvýšené kooperaci. Vysvětlení je, že destabilizující účinek umístění hydrofobních zbytků do hydrofilního prostředí může převažovat nad stabilizačním účinku v důsledku eliminace odpudivých interakcí mezi zbytky D123, což má za následek celkovou snížení vazebné kooperace. Poloha D171 Ciona gutIS CI-HV1 (odpovídající D123 v lidském HV1) se po aktivaci zvyšuje, což podporuje představu, že D123 je umístěn v hydrofilním prostředí v otevřeném stavu. Je známo, že hradlování kanálů HV1 se vyskytuje prostřednictvím více přechodů19,20,26,39,40,41.Qiu et al26, že po depolarizaci membrány podléhá napěťové senzor CI-HV1 konformační změnu, která ponechává kanál aktivovaný, ale stále zavřený, ale stále zavřený , následovaný zřetelným přechodem, který způsobuje otevření protonů v obou podjednotkách. Konformační změna senzoru napětí byla monitorována fluorescencí napětí a bylo zjištěno, že druhý přechod byl selektivně narušen mutací v poloze D171. Porušení fluorescenčního signálu je v souladu s přítomností elektrostatických interakcí mezi zbytky D171 v sousedním podjednotkách v určitém okamžiku podél reakčních souřadnic konformační změny. Tato interpretace je v souladu s naším zjištěním, že zbytky D123 elektrostaticky interagují v otevřeném stavu a zprostředkovává alosterické spojení mezi vazebnými místy GBTA. Fujiwara et al25 navrhl, že rozhraní dimeru cytoplazmatické domény stočené kolíčky se rozprostírá do membrány tak, aby obsahovala dvě helixy S4 (obr. 7b, levý panel). Model této intersubunitské interakce je založen na analýze křížového spojení cysteinu, která je založena Celá VSD a funkční analýza oblasti spojující helix S4 a CCD. v nepřítomnosti transmembránového gradientu pH, HV1 kanály vyžadují k otevření značné depolarizace membrány a cysteinové zesíťování dochází za podmínek, kde je kanál převážně uzavřen. Proto detekované rozhraní S4-S4 pravděpodobně odráží konfiguraci podjednotky mimo stát. Jiné studie zjistily důkaz o zapojení S1 a S2 do intersubunitových interakcí během Gating17,21,26, což naznačuje, že kanály mohou přijmout různé konfigurace podjednotek na otevřeném stavu a Uzavřené stavy, myšlenka v souladu s nálezy Mony et al. S1 se během hradlování pohybuje 39. Zde ukazujeme, že v otevřeném stavu jsou extracelulární konce šroubovice S1 dostatečně blízko, aby podporovaly přímé elektrostatické interakce, které zprostředkovávají alosterické spojení mezi podjednotkami. V konfiguraci dimeru s prodlouženými interakcemi S4-S4 jsou příliš daleko Kromě sebe navzájem přímo interagovat. S našimi zjištěními (obr. 7b, pravý panel). Doporučujeme tuto konfiguraci pro kanál v otevřeném stavu. Ačkoli se předpokládá, že enzym CIVSP funguje jako monomer, krystalová struktura jeho izolovaného VSD je zachycena ve stavu dimeru. Vnější konce helixů S1 v tomto dimeru jsou prostorově blízko u sebe a celková konfigurace je podobná jako navrhovaná konfigurace Pro HV1 (obr. 7c). V dimeru CIVSP byl nejbližším zbytkem ze sousední podjednotky prolin v poloze 140 (obr. 7c). Zájemtně p140 v CIVSP odpovídá poloze D123 v HV1. a dimery CIVSP naznačují, že VSD těchto proteinů mají vnitřní tendenci tvořit rozhraní, kde interagují extracelulární konce S1. Základní role HV1 v aktivaci spermatických buněk činí tento kanál atraktivním cílem léčiva pro kontrolu plodnosti samce. Na základě bylo prokázáno, že aktivace HV1 v mikrogliích zhoršuje zotavení z ischemické mrtvice. Zvýšená aktivita HV1 byla spojena s nižšími aktivitami HV1. Přežití u pacientů s rakovinami prsu 12 nebo kolorektálním karcinomem 13 a předpokládá se, že přispívá k malignitům B-buněk 11. Proto lze drogy s malými molekulami zaměřit na HV1 jako neuroprotektivní látky nebo protirakovinové terapeutiky. Objev, že guanidinothiazolové deriváty mohou indukovat konformační přerušení v zákulisí v konformačním přerušení v konformačním přerušení Otevřená podjednotka HV1, což vede ke zvýšené afinitě vazebné, může vést k vývoji účinnějších léků zaměřených na kanály HV1. Místo zaměřená mutageneze lidského HV1 byla provedena pomocí standardních technik PCR. V konstruktu HV1NCCIVSP, zbytky 1-96 a 228-273 HV1 byly nahrazeny zbytky 1-113 a 240-576 CIVSP18. V HV1-vazbě dimeru, HV1-vazbě, Hv1-line, dimer, Hv1-linked dimer. C-konec jedné podjednotky je spojen s N-konec druhé podjednotky prostřednictvím linkeru Ggsggsgsgsggsgg. T7 MMessage Mmachine Transkription Kit (Ambion) .1-3 dny před elektrofyziologickou měřením byl injikován do xenopus oocytů (50 nl na buňku, 0,3-1,5 μg/μl). STAGE V a VI OOCYTY Z ekocytů bioscience. Injekci RNA byly udržovány buňky v médiu ND96 obsahujícího 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mm CaCl, 1 mm mgcl, 10 mM HEPES, 5 mm pyruvát, 100 μg/ml gentamicicinu, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzothiazol [2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidin [5], (5-bromo-4-methyl-1,3 -Thiazol-2-yl) guanidin) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazol-4-karboxylát [8], ethyl 2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol--thiazol- 5-karboxylát [9] a (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethylacetát [10] pocházel od Sigma-Aldrich.Famotidin [7] pocházel z MP Biomedical.1- [4 -(4-chlorfenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidin [11] a 1- [4- (3,4-dimethoxyfenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidin [12] Z matice Scientific. Tyto sloučeniny jsou z nejvyšší čistoty komerčně dostupné. Byly rozpuštěny v suchém DMSO za vzniku 100 mm zásobního roztoku, který byl poté zředěn v záznamu při požadované konečné koncentraci. 3 a 4 byly syntetizovány níže níže Nejméně 99% čistoty. K suspenzi 2-amino-4- (trifluormethyl) benzenEthethiol hydrochlorid (1,02 g, 4,5 mmol) v 25 ml kyseliny chlorovodíkové (2,5 N) byl přidán pevný dicyandiamid (380 mg, 4,5 mmol) a výsledný heterogenní směs) a výsledný heterogenní směs) a výsledný heterogenní směs) a výsledný heterogenus. byl refluxován s intenzivním mícháním po dobu 4 hodin. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a neutralizováno postupným přidáním hydroxidu draselného. 65 ° C) po dobu několika hodin a poté rekrystalizováno z ethylacetátu/petroletheru za vzniku bílé pevné látky (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (světlo 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): A [ppm] = 7,25 (velmi široké S, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d (d d (d d (d d (d d (d d (d d (d d (d d (d d (d d (d d 7,92 (d (d d (d d (d , 1 h, j = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): A = 114,2 (d, j = 3,5 Hz), 117,5 (d, j = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J. = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.HRMS (ESI): M/Z Vypočtená hodnota. Pro C9H8F3n4S (M + H) +: 261.0416, nalezeno : 261.0419. Nafto [1,2-d] thiazol-2-amin (300 mg, 1,5 mmol), syntetizovaný, jak bylo dříve popsáno, byl zahříván na 200 ° C v olejové lázni v malé zkumavce.300 mg (velký exces) a cyanamid a 1,0 ml konc. byl rozbitý na malé kousky a omyl vodou, aby poskytoval světle žlutou amorfní pevnou pevnou látku. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h) , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 Hz) .13c NMR (150 MHz, DMSO-D6): A = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132.1, 140,7, 169.1.HRMS (ESI): M/Z Vypočítaná hodnota. Pro C12H1nn4s (M + H) +: 243,0699 , Nalezeno: 243.0704. Protonové proudy byly měřeny ve vnitřních a externích skvrnách oocytů exprimujících různé konstrukty pomocí zesilovače AxoPatch 200b ovládaného axon Digidata 1440a (Molecular Devices) s softwarem PCLAMP10. Vrcholcelulární a extracelulární roztoky: 100 mm 2- (n-morfolino) ) kyselina ethanesulfonová (MES), 30 mm tetraethylamonium (čaj) mesylát, 5 mm chlorid čaje, 5 mm ethylenglykol-bis (2-aminoethyl) -n, n, n ', N'-tetraoctová kyselina (EGTA), upravena pH 6,0 s hydroxidem čaje. Všechna měření byla prováděna při 22 ± 2 ° C. Pipeta má přístupový odpor 1,5–4 MΩ. Tráhací stopy byly filtrovány při 1 kHz, vzorkovány při 5 kHz a analyzovány pomocí ClampFit10.2 (molekulární zařízení (molekulární zařízení (molekulární zařízení ) a původ8.1 (původ). Roztoky obsahující různé koncentrace inhibitoru HV1 a v některých případech bylo do lázně zavedeno 10 mm βme pomocí rozdělovače připojeného k perfúznímu ventilu VC-6 (Warner Inters.), Který prošel softwarem PCLAMP (tranzistor- Tranzistorové logiky) signály. Experimenty s perfúzními experimenty byly prováděny pomocí perfuzní tužky s více trubicí (automatizující sci.) S 360 μm průměrem namontovanou před záplatovou pipetou. Inhibice kanálu byla určena isochronálním měřením amperometrických měřením. +120 mV depolarizační puls.gv měření byla provedena, jak bylo popsáno dříve, že bylo zaznamenáno na -40 mV po depolarizačních krocích při různých napětích od -20 mV do +120 mV, pokud není uvedeno jinak. Používá se k opravě proudového rozpadu 18. Graf GV odpovídá Boltzmannově rovnici: Zjevné disociační konstanty (KD) pro různé kombinace kanálů a inhibitorů (doplňková tabulka 1) byla stanovena namontováním závislosti na koncentraci inhibice (průměrné %inhibiční hodnoty)) S rovnicí kopce: kde [i] je koncentrace inhibitoru I a H je koeficient kopce. Pro výpočet kopce kopce je rovnice (2) přeskupena jako: