Forespørgsel af intersubunit-grænsefladen af ​​den åbne Hv1-protonkanal med en allosterisk koblet probe

Tak fordi du besøgte Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden for at sikre fortsat support, vil vi vise siden uden stilarter og JavaScript. Den Hv1 voltage-gatede protonkanal er et dimerisk kompleks bestående af to voltage-sensing domæner (VSD'er), som hver indeholder en gated protonpermeationsvej.Dimerisering styres af det cytoplasmatiske coiled-coil domæne.Overgangen fra den lukkede tilstand til den åbne tilstand i begge VSD'er er kendt for at forekomme kooperativt; der er dog lidt kendt om de underliggende mekanismer. Intersubunit-grænseflader spiller en nøglerolle i allosteriske processer; sådanne grænseflader er imidlertid ikke blevet identificeret i åbne Hv1-kanaler. Her demonstrerer vi, at 2-guanidinothiazol-derivater blokerer to Hv1-VSD'er på en kooperativ måde og bruger en af ​​disse forbindelser som en probe til allosterisk kobling mellem åbne underenheder. Vi fandt, at den ekstracellulære ende af det første transmembrane fragment af VSD danner en intersubunit-grænseflade, der medierer kobling mellem bindingssteder, hvorimod coiled-coil-domænet ikke er direkte involveret i denne proces. Vi fandt også stærke beviser på, at kanalens proton-selektive filter kontrollerer bloker-bindings-kooperativitet . Spændingsstyrede protonkanaler spiller vigtige roller i en række forskellige organismer, fra fytoplankton til mennesker1. I de fleste celler medierer disse kanaler protonudstrømning fra protonmembranen og regulerer aktiviteten af ​​NADPH-oxidase. Den eneste kendte spændingsstyrede protonkanal hos mennesker er Hv1, som er produktet af HVCN1-genet2,3.Hv1 (aka VSOP) har vist sig at spille en rolle i B-celleproliferation4, produktion af reaktive oxygenarter af det medfødte immunsystem5,6,7,8, sædcelle motilitet9 og pH-regulering af luftvejsoverfladevæske10. Denne kanal er involveret i adskillige Overudtrykte i cancertyper såsom B-celle malignitet4,11 og bryst- og kolorektal cancer12,13. Overdreven Hv1 aktivitet blev fundet at øge det metastatiske potentiale af cancerceller 11, 12. I hjernen udtrykkes Hv1 af mikroglia, og dets aktivitet har vist sig at forværre hjerneskade i modeller af iskæmisk slagtilfælde. Hv1-proteinet indeholder et spændingsfølende domæne (VSD), som består af fire transmembrane segmenter kaldet S1 til S414. VSD'en ligner de tilsvarende domæner af spændingsstyrede Na+, K+ og Ca2+ kanaler og spændingsfølsomme fosfataser, såsom CiVSP fra Ciona gutis15.I disse andre proteiner er C-terminalen af ​​S4 knyttet til et effektormodul, poredomænet eller enzymet.I Hv1 er S4 forbundet med coiled-coil domænet (CCD) placeret på den cytoplasmatiske side af membranen .Kanalen er et dimerisk kompleks bestående af to VSD'er, der hver indeholder en gated protonpermeationsvej16,17,18. Disse to Hv1-underenheder viste sig at åbne kooperativt19,20,21,22, hvilket tyder på, at allosterisk kobling og inter-underenhedsinteraktioner spiller en vigtig rolle i gating-processen. Grænsefladen mellem underenhederne i det coiled coil-domæne er veldefineret, fordi krystalstrukturerne i de to isolerede domæner er tilgængelige22,23. På den anden side er grænsefladen mellem VSD'er i membranen ikke godt forstået. Krystalstrukturen af ​​det kimære Hv1-CiVSP-protein giver ikke information om denne grænseflade, da den trimere organisering af det krystalliserede kanalkompleks kan skyldes udskiftningen af ​​den native Hv1 CCD med gærleucin-lynlåsen GCN424. En nylig undersøgelse af underenhedsorganisationen af ​​Hv1-kanalen konkluderede, at to S4-helixer går over i CCD uden alvorlig afbrydelse af sekundær struktur, hvilket resulterer i lange helixer, der starter fra membranen og rager ind i cytoplasmaet. Baseret på cystein-tværbindingsanalyse, denne undersøgelse foreslår, at Hv1 VSD'er kontakter hinanden langs S4-segmentet. Andre undersøgelser har imidlertid foreslået alternative grænseflader mellem VSD'er. Disse grænseflader omfatter S1-segmenter 17, 21, 26 og de ydre ender af S2-segment 21. En mulig årsag til den modstridende resultaterne af disse undersøgelser er, at allosterisk kobling mellem VSD'er blev undersøgt i forhold til gating-processen, som afhænger af de lukkede og åbne tilstande, og grænsefladen mellem VSD'er kan variere i forskellige tilstandsændringer i konformation. Her fandt vi ud af, at 2-guanidinothiazol hæmmer Hv1-kanaler ved synergistisk binding til to åbne VSD'er og brugte en af ​​forbindelserne, 2-guanidinobenzothiazol (GBTA), til at undersøge interaktionen mellem underenheder i åben tilstand. interface. Vi fandt ud af, at GBTA-bindingskurven godt kan beskrives af en kvantitativ model, hvor binding af en inhibitor til én underenhed resulterer i en stigning i bindingsaffiniteten af ​​den tilstødende underenhed. Vi fandt også, at rester D112, selektivitetsfiltre for kanal 27, 28 og en del af guanidinderivatets bindingssted 29 kontrollerer GBTA-bindings-kooperativitet. Vi viser, at kooperativ binding opretholdes i Hv1-dimeren, hvor CCD'en adskilles fra S4-segmentet, hvilket tyder på, at intersubunit-grænsefladen i CCD ikke direkte medierer allosterisk kobling mellem GBTA-bindingssteder. I modsætning hertil finder vi, at S1-fragmentet er en del af grænsefladen mellem underenhederne og foreslår et arrangement af tilstødende VSD'er med den ekstracellulære ende af S4-helixen væk fra midten af ​​dimeren for at tillade S1-fragmentet skal være i åben tilstand. Små molekyle-hæmmere af Hv1 er nyttige som anticancer-lægemidler og neurobeskyttende midler. Men til dato har få forbindelser været i stand til at hæmme kanalen30,31,32,33. Blandt dem 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, forbindelse [1] i fig. 1a) og dets derivater blev fundet at blokere VSD29,32-permeation af protoner gennem kanalen. Binding af sådanne forbindelser menes at forekomme uafhængigt i de to åbne underenheder.2-guanidinobenzothiazol (GBTA, forbindelse [2] i figur 1a) var tidligere vist at hæmme Hv1 næsten lige så effektivt som 2GBI, når det blev testet ved en koncentration på 200 μM (Figur 1b). Vi undersøgte andre thiazolderivater og fandt ud af, at nogle af dem hæmmede kanalen med lignende eller større styrke end GBTA (Fig. 1 og Supplerende) tekst). Vi bestemte koncentrationsresponskurverne for fire thiazolderivater (GBTA og forbindelser [3], [6] og [11], fig. 1c) og fandt, at de var stejlere end dem for 2GBI. Hill-koefficienterne (h) thiazolderivater varierede fra 1,109 ± 0,040 til 1,306 ± 0,033 (fig. 1c og Supplerende Fig. 1). I modsætning hertil var Hill-koefficienten for 2GBI 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a og Supplerende Fig. 1). En Hill-koefficient over 1 indikerer bindingskooperativitet.Fordi hver Hv1-underenhed har sin egen inhibitor- bindingssted,29,32 argumenterede vi for, at bindingen af ​​et thiazolderivat til én underenhed kunne øge bindingen af ​​et andet inhibitormolekyle til den tilstødende underenhed. GBTA var testforbindelsen med den højeste Hill-koefficient. Derfor valgte vi denne forbindelse til at yderligere studere mekanismen for bindingssynergi og brugte 2GBI som en negativ referencekontrol. (a) Testforbindelser: [1] Reference Hv1-hæmmer 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazol (GBTA), [3] (5-trifluormethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidin, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidin, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [6](5-brom-4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazol-4-carboxylsyreethylester, [9] 2-guanidino-4-methylethyl-1,3-thiazol-5-carboxylat, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethylacetat, [11]1-[4-(4-chlorphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidin.(b) Inhibering af human Hv1-aktivitet med de angivne guanidinothiazoler og referenceforbindelsen 2GBI (blå-grønne søjler) .Hv1-protonstrømme blev målt i plaques fra Xenopus-oocytter som reaktion på depolarisering fra et holdepotentiale på -80 mV til +120 mV. Hver inhibitor blev tilsat til badet i en koncentration på 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Data er middel ±SEM (n≥4).(c) Koncentrationsafhængig hæmning af human Hv1 af forbindelser [2], [3], [6] og [11]. Hvert punkt repræsenterer middelhæmningen ± SD på 3 til 15 målinger. Linjen er en Hill-tilpasning, der bruges til at opnå de tilsyneladende Kd-værdier rapporteret i supplerende tabel 1. Hill-koefficienter blev bestemt ud fra tilpasningerne rapporteret i Supplerende Fig. 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (se metoder). (a,b) Forbindelser 2GBI og GBTA hæmmede dimer og monomer Hv1 på en koncentrationsafhængig måde. Hvert punkt repræsenterer middelhæmningen ± SD på 3 til 8 målinger, og kurven er en Hill fit. Hill-koefficienterne (h) vist i de indsatte histogrammer blev bestemt ud fra tilpasningerne rapporteret i de supplerende figurer 3 og 4. Koncentrationsresponset af GBTA vist i (a) er det samme som det i figur 1c. Se supplerende tabel 1 for tilsyneladende Kd-værdier. (c) Modellering af den kooperative binding af GBTA til dimer Hv1. Den ubrudte sorte linje repræsenterer tilpasningen til de eksperimentelle data ved ligning (6), som beskriver bindingsmodellen vist i (d). De stiplede linjer mærket Sub 1 og Sub 2 repræsenterer den bimolekylære association -dissociationsligevægtskurver for henholdsvis den første og anden bindingsbegivenhed (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Skematisk diagram af den foreslåede mekanisme for Hv1-blokken. I tilfælde af GBTA øger binding til én åben underenhed affiniteten af ​​den tilstødende åbne underenhed (Kd2 0,05) fald i Hill-koefficienten for GBTA-binding til GGG-kanaler sammenlignet med vildtype (fig. 5c), hvilket tyder på, at på trods af dens rolle i at holde to underenheder sammen vigtige, men CCD medierer ikke direkte intersubunit allosterisk kobling mellem GBTA-bindingssteder. (a) Skematisk diagram af Hv1-dimeren med en triglycinmutation i den indre ende af S4 designet til at forstyrre intersubunit-koblingen medieret af det cytoplasmatiske coiled-coil-domæne (blå pile).(b) Skematisk repræsentation af Hv1-dimerer og ligationsdimerer med indikerede mutationer, designet til at teste S1-fragmenter involveret i kobling mellem underenheder (blå pile).(c–h) 2GBI (cyan) og GBTA (mørkerød) hæmmer de angivne konstruktioner på en koncentrationsafhængig måde. Hvert punkt repræsenterer den gennemsnitlige inhibering ± SD på 3 til 10 målinger. Kurven var en Hill fit brugt til at opnå tilsyneladende Kd-værdier (se supplerende tabel 1). Hill-koefficienter i de interpolerede histogrammer blev bestemt som beskrevet i metodeafsnittet (se supplerende figurer 3 og 4). Reference h-værdier for Hv1 WT er vist som stiplede linjer. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle mellem mutant- og WT-passager (p 0,05, fig. 5d,i). ). På den anden side reducerede mutation D123A signifikant Hill-koefficienten for GBTA (p 0,05/14). Da neutralisering af ladningen i position 123 på begge underenheder resulterede i en stærk ændring i GBTA-bindingssamarbejdet, mens reversering af ladningen på begge underenheder kun havde en lille effekt, udvidede vi analysen til kun at omfatte én underenhed med inversionskanalen for ladning. genererede Hv1-koblede dimerer med D123R-substitution i den C-terminale underenhed (fig. 5b) og målte koncentration-respons-hæmningen af ​​GBTA og 2GBI. Vi fandt, at Hill-koefficienten for GBTA-binding til WT-D123R-kanaler var signifikant højere end det af vildtype Hv1 (p 0,05). Vi fandt også, at i fravær af βME var Hill-koefficienten for GBTA-binding til D112E I127C Hv1-dimeren signifikant højere end den målt i nærvær af reduktionsmidler (fig. 6e og supplerende fig. 4), hvilket antyder, at D112E-mutationen ophævede ikke stigningen i GBTA-bindende kooperativitet som følge af tværbindingen af ​​cystein 127. Hill-koefficienten for 2GBI-binding til D112E, I127C Hv1-dimerer var heller ikke signifikant påvirket af D112E-mutationen (figur 1).6d og Supplerende Fig. 3). Tilsammen tyder disse fund på, at GBTA-binding forstærkes af interaktionen mellem de ydre ender af S1-fragmenter i tilstødende Hv1-underenheder gennem attraktive elektrostatiske interaktioner eller gennem dannelsen af ​​kovalente bindinger mellem substituerede cysteiner. Allosterisk kobling mellem steder øges og resulterer i bindingssamarbejde. Mens effekten af ​​attraktive elektrostatiske interaktioner på kooperativitet kan ophæves ved mutation D112E, kan effekten af ​​kovalente bindinger ikke. I vores udforskning af det kemiske rum, der er tilgængeligt for binding af guanidinderivater til Hv1-kanaler, fandt vi ud af, at 2-guanidinothiazoler som GBTA har en stejlere koncentrationsafhængighed end 2-guanidinobenzimidazoler (fig. 1c). Hill-koefficientanalysen af ​​GBTA-binding til begge de dimere og monomere kanaler (fig. 2a,b) og til den dimere kanal, hvori en underenhed var præbundet til inhibitoren (fig. 4), førte os til at konkludere, at inhiberingen af ​​Hv1 af GBTA. Virkningen er en synergistisk proces, og bindingsstederne for forbindelserne i de to underenheder er allosterisk koblet. Opdagelsen af, at GBTA binder til den åbne kanal, som tidligere vist for den beslægtede forbindelse 2GBI32, tyder på, at allosterisk kobling specifikt kan vurderes i åben tilstand. Vores kooperative bindingsmodel var i stand til kvantitativt at beskrive inhiberingen af ​​HV1 af GBTA (fig. 2C) og forklare de forskellige effekter af 2GBI og GBTA på forfaldet af kanalhalstrømme efter membranrepolarisering, som understøtter vores fortolkning af bindingsprocessen. Den maksimale bakkekoefficient, der kan opnås i et allosterisk protein med to bindingssteder (såsom HV1), er 2. Vi målte GBTA for at binde HV1 vildtype med en koefficient på 1,31, som steg til 1,88 i HV1 I127C.TheTheTheThe. Synergistisk fri energi, forskellen mellem de bindende frie energier på de laveste og højeste affinitetssteder (se metoder), var 1,3 kcal/mol i tilfælde af HV1 vildtype og 2,7 kcal/mol i tilfælde af HV1 I127C.The binding af ilt til hæmoglobin er det mest berømte og godt studerede eksempel på samarbejdsprocessen38.For human hæmoglobin (en tetramer med fire allosterisk koblede bindingssteder), bakkekoefficienten varierer fra 2,5-3,0, med værdier, der varierer fra 1,26 til 3.64 Kcal/mol, afhængigt af eksperimentelle betingelser38. Derfor er det ikke væsentligt forskelligt fra det for O2 -binding til hæmoglobin, når det forskellige protein -underenheder i de to systemer overvejes. I vores synergimodel resulterer bindingen af ​​GBTA -molekyler til en underenhed i en stigning i bindingsaffiniteten af ​​den tilstødende underenhed. Vi forestiller sig en proces, hvor en omarrangement af det bindende miljø, der er resultatet af den første bindende begivenhed (induceret pasform), fører til Ændringer i samspillet mellem underenheder. I respons på disse ændringer ændrer tilstødende underenheder deres bindingssteder, hvilket resulterer i strammere GBTA -binding. I denne proces er S1 -aspartatet D112 ansvarlig for omarrangementet af bindingsstedet forbundet med øget bindingsaffinitet.D112 blev tidligere vist at være en del af HV1 -protonpermeationsvejen og fungere som selektivitetsfilter27,28. Vores resultater viser, at selektivitetsfiltre i de to HV1 -underenheder er allosterisk koblet i den åbne tilstand.Figure 7A viser den omtrentlige placering af GBTA -bindingsstedet og placeringen af ​​rester D112, D123, K125 og I127 på et skema af HV1 VSD -baserede baserede På krystalstrukturen af ​​HV1-CIVSP-kimæren. Betydede retninger for allosterisk kobling, der involverer den ekstracellulære ende af S1, vises med sorte pile. (A) Skematisk af HV1 VSD.baseret på krystalstrukturen af ​​HV1-CIVSP-kimæren, vises de spiralformede segmenter at være cylindriske. I denne konfiguration fusionerer den indre ende af S4-segmentet med CCD (ikke vist). De forudsagte placeringer af bundne GBTA er vist som grå ovaler. Black -pile angiver veje involveret i allosterisk kobling mellem bindingssteder i to tilstødende underenheder. Positionerne for de undersøgte S1 -rester er markeret med farvede kugler. (B) Skematisk illustration af HV1 -underenheder, der er arrangeret I to forskellige dimerkonfigurationer set fra den ekstracellulære side af membranplanet. På venstre panel dannes dimergrænsefladen af ​​S4 -helix.rotation af de to VSD'er 20 grader med uret omkring en akse vinkelret til membranplanet, ledsaget af ledsaget af Adskillelse af de ydre ender af de to S4 -helixer (stiplede pile), producerer arrangementet vist på højre i dimerkonfigurationen, der findes i 4G80 -krystalstrukturen. Position P140 i CIVSP svarer til position D123 i HV1. Vores resultater viser, at den frastødende elektrostatiske interaktion mellem rest 123 (123D/123D eller 123R/123R) er forbundet med et "normalt" niveau af GBTA-bindende kooperativitet i den åbne tilstand og skifter interaktionen fra frastødning til tiltrukket (123d/123R) , øget samarbejde (fig. 5G) .Det forventes, at fjernelse af den frastødende interaktion med alaninudskiftning også ville føre til øget kooperativitet. Endelig blev der observeret et fald i kooperativiteten af ​​123A/123A -dimeren (fig. 5e). En mulig mulig Forklaring er, at den destabiliserende virkning af at placere hydrofobe rester i et hydrofil Position D171 af Ciona Gutis CI-HV1 (svarende til D123 i human HV1) øges ved aktivering, hvilket understøtter forestillingen om, at D123 er placeret i et hydrofilt miljø i den åbne tilstand. Det vides, at indhaltning af HV1-kanaler forekommer gennem flere overgange19,20,26,39,40,41.Qiu et al26, at på membran depolarisering gennemgår spændingssensor efterfulgt af en tydelig overgang, der får protoner til at åbne ledning i begge underenhedsstien. Den konformationelle ændring af spændingssensoren blev overvåget ved spændingsklemmefluorescens, og det blev konstateret, at den anden overgang blev selektivt forstyrret af mutationen i position D171. Forstyrrelsen af ​​det fluorescerende signal er i overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​elektrostatiske interaktioner mellem D171 -resterne af tilstødende underenheder på et tidspunkt langs reaktionskoordinaterne for den konformationelle ændring. Denne fortolkning er i overensstemmelse med vores konstatering af, at D123 -resteren elektrostatisk interagerer i den åbne tilstand og formidler allosterisk kobling mellem GBTA -bindingssteder. Fujiwara et al25 foreslog, at dimergrænsefladen af ​​det cytoplasmatiske coiled-spiraldomæne strækker sig ind i membranen for at indeholde to S4-helixer (fig. 7b, venstre panel). En model af denne intersubunit-interaktion er baseret på cystein tværbindingsanalyse, der dækker Hele VSD og funktionel analyse af regionen, der forbinder S4 -helix og CCD. I fraværet af en transmembran -pH -gradient kræver HV1 -kanaler betydelig membrandepolarisering for at åbne, og cystein -tværbinding forekommer under forhold, hvor kanalen er overvejende lukket. Derfor afspejler den detekterede S4-S4-interface sandsynligvis den off-state underenhedskonfiguration. Andre undersøgelser har fundet bevis for involvering af S1 og S2 i intersubunit-interaktioner under Gating17,21,26, hvilket antyder, at kanaler kan vedtage forskellige underenhedskonfigurationer i det åbne Lukkede tilstande, en idé, der er i overensstemmelse med resultaterne af Mony et al. S1 bevæger sig 39 under porten. Her viser vi, at i den åbne tilstand er de ekstracellulære ender af S1-helixen tæt nok til at understøtte direkte elektrostatiske interaktioner, der medierer allosterisk kobling mellem underenheder. I dimerkonfigurationen med udvidede S4-S4-interaktioner er S1-helixerne for langt Bortset fra hinanden for at interagere direkte. Dog en 20 ° rotation med uret af de to VSD-underenheder omkring en akse vinkelret på membranplanet kombineret med adskillelsen af ​​de ydre ender af de to S4-helixer, gav en S1-S1-konfiguration konsistent med vores fund (fig. 7b, højre panel). Vi anbefaler denne konfiguration til kanalen i den åbne tilstand. Selvom CivSP -enzymet antages at fungere som en monomer, er krystalstrukturen af ​​dets isolerede VSD fanget i en dimertilstand. De ydre ender af S1 -helixerne i denne dimer er rumligt tæt sammen, og den samlede konfiguration ligner den, der foreslås For HV1 (fig. 7C). I CIVSP -dimeren blev den nærmeste rest fra den tilstødende underenhed prolin i position 140 (fig. 7C). Interessant, P140 i CIVSP svarer til position D123 i HV1.The lighed i underenhedskonfiguration mellem HV1 Og CIVSP -dimerer antyder, at VSD'erne for disse proteiner har en iboende tendens til at danne en grænseflade, hvor de ekstracellulære ender af S1 interagerer. Den væsentlige rolle af HV1 i sædcelleaktivering gør denne kanal til et attraktivt lægemiddelmål til kontrol af mandlig fertilitet. Furmisk, aktivering af HV1 i mikroglia har vist sig at forværre bedring fra iskæmisk slagtilfælde. Overlevelse hos patienter med bryst 12 eller kolorektal kræft 13 og menes at bidrage til B-celle maligniteter 11. Derfor kan små molekyle-lægemidler, der er målrettet mod HV1, bruges som neurobeskyttelsesmidler eller anticancerterapeutik. Opdagelsen af, at guanidinothiazol-derivater kan inducere konformationelle ramre i den Åben HV1 -underenhed, der fører til øget bindingsaffinitet, kan føre til udvikling af mere potente lægemidler, der er målrettet mod HV1 -kanaler. Stedsstyret mutagenese af human HV1 blev udført under anvendelse af standard PCR-teknikker. I HV1NCCIVSP-konstruktionen blev rester 1-96 og 228-273 af HV1 erstattet af rester 1-113 og 240-576 af Civsp18.in HV1-linked dimer, C-terminalen af ​​en underenhed er knyttet til N-terminalen af ​​den anden underenhed gennem GGSGGSGGSGSGGSGG-linker. PGEMHE-plasmiderne indeholdende de forskellige konstruktioner blev lineariseret med NHE1- eller SPH1-begrænsningsenzymer (New England BioLabs), og RNA-syntesen blev udført med PH- T7 mmessage mmachine transkriptionssæt (Ambion) .1-3 dage før elektrofysiologiske målinger blev CRNA injiceret i xenopus-oocytter (50 nl pr. Celle, 0,3-1,5 μg/μl). Fase V og VI-oocytter fra Xenopus laevis (NASCO) blev opnået Fra Ecocyt Bioscience. Følgende RNA -injektion blev celler opretholdt i ND96 -medium indeholdende 96 mM NaCI, 2 mM KCI, 1,8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvat, 100 μg/ml gentamin, pH 7,2 18 ° C . 2-Guanidino-benzimidazol [1], 2-Guanidino-benzothiazol [2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidin [5], (5-bromo-4-methyl-1,3 -thiazol-2-yl) guanidin) [6], ethyl 2-Guanidino-5-methyl-1,3-thiazol-4-carboxylat [8], ethyl 2-Guanidino-4- methyl-1,3-thiazol- 5-carboxylat [9] og (2-Guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethylacetat [10] var fra Sigma-Aldrich.famotidin [7] var fra MP Biomedicals.1- [4 4 -(4-chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidin [11] og 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3- thiazol-2-yl] guanidin [12] var fra matrix videnskabelig. Disse forbindelser er af den højeste renhed kommercielt tilgængelige. De blev opløst i tør DMSO for at generere en 100 mm stamopløsning, som derefter blev fortyndet i optagelsesopløsningen ved den ønskede slutkoncentration. Pund 3 og 4 blev syntetiseret nedenfor med Mindst 99% renhed. Til en suspension af 2-amino-4- (trifluormethyl) benzenethiolhydrochlorid (1,02 g, 4,5 mmol) i 25 ml vandig hydrochlorsyre (2,5 n) blev tilsat fast dicyandiamid (380 mg, 4,5 mmol), og den resulterende heterogene blanding blev tilbagesvalet med kraftig omrøring i 4 timer. Reaktionsblandingen blev afkølet til stuetemperatur og neutraliseret ved gradvis tilsætning af 10N kaliumhydroxid. Det dannede hvide bundfald blev filtreret, vasket med koldt vand (3 × 50 ml), tørret i en ovn ( 65 ° C) i flere timer og omkrystalliserede derefter fra ethylacetat/petroleumsether for at give et hvidt fast stof (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (lys 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7,25 (meget bred S, 4 timer), 7,40 (D, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (S, 1 H), 7,92 (D , 1 H, J = 8,1 Hz) .13c NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, J = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.HRMS (ESI): M/Z beregnet værdi.For C9H8F3N4S (M + H) +: 261,0416, fundet : 261.0419. Naphtho [1,2-D] thiazol-2-amin (300 mg, 1,5 mmol), syntetiseret som tidligere beskrevet, blev opvarmet til 200 ° C i et oliebad i et lille reagensglas .300 mg (stort overskydende) cyanamid og 1,0 ml Conct til den varme forbindelse blev tilsat saltsyre hurtigt, og blandingen blev holdt i oliebadet i cirka 2 minutter, i hvilket tidsrum det meste af vandet fordampede. Reaktionsblandingen blev derefter afkølet til stuetemperatur og det resulterende størknet materiale blev opdelt i små stykker og vasket med vand for at tilvejebringe et lysegult amorf fast stof. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 time, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 time , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 Hz) .13c NMR (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.hrms (ESI): m/z beregnet værdi.For C12H11N4S (M + H) +: 243,0699 , fundet: 243.0704. Protonstrømme blev målt i interne og eksterne pletter af oocytter, der udtrykker forskellige konstruktioner ved hjælp af en Axopatch 200b-forstærker kontrolleret af en Axon Digidata 1440A (molekylære enheder) med PCLAMP10-software. Intracellulære og ekstracellulære opløsninger har den samme sammensætning: 100 mm 2- (n-morpholino ) Ethansulfonsyre (MES), 30 mm tetraethylammonium (te) mesylat, 5 mm te-chlorid, 5 mm ethylenglycol-bis (2-aminoethyl) -n, n, n ', n'-tetraeddikesyre (EGTA), justeret til pH 6,0 med tehydroxid. Alle målinger blev udført ved 22 ± 2 ° C. Pipetten har en adgangsmodstand på 1,5–4 MΩ. Strømspor blev filtreret ved 1 kHz, samplet ved 5 kHz og analyseret med CLAMPFIT10.2 (molecular -enheder ) og Origin8.1 (OriginLab). Opløsninger indeholdende forskellige koncentrationer af HV1-hæmmer og i nogle tilfælde blev der introduceret 10 mM βMe i badet af tyngdekraften gennem en manifold, der Transistorlogik) Signaler. Rapid perfusionseksperimenter blev udført under anvendelse af en perfusionsblyant med flere rør (Automat SCI.) Med en levering af en diameter på 360 μm blev monteret foran en patch-pipette. Channelinhibering blev bestemt ved isokronale amperometriske målinger i slutningen af ​​den. +120 mV depolariserende puls.gv -målinger blev udført som tidligere beskrevet18,20.Tailstrømme blev registreret ved -40 mV efter depolariseringstrin ved forskellige spændinger fra -20 mV til +120 mV, medmindre andet er angivet. Referencepulsen forud for testpulsen er Brugt til at korrigere for nuværende forfald 18. GV -grafen passer til Boltzmann -ligningen: de tilsyneladende dissociationskonstanter (KD) for forskellige kombinationer af kanaler og hæmmere (Supplerende tabel 1) blev bestemt ved at montere koncentrationsafhængigheden af ​​inhibering (gennemsnit %hæmningsværdier) Med bakke ligningen: hvor [I] er koncentrationen af ​​hæmmer I og H er bakkekoefficienten. For at beregne bakkekoefficienten omarrangeres ligningen (2) som: