Pridemandado de la intersubunua interfaco de la malferma Hv1-protonkanalo per alostere kunligita enketo

Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecreĝimon en Internet Explorer).Dume, por certigi daŭra subteno, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript. La Hv1 tensi-enirigita protonkanalo estas dimera komplekso konsistanta el du tensio-sensantaj domajnoj (VSDoj), ĉiu el kiuj enhavas enirkontrolitan protonan trapenetran vojon. la malferma stato en ambaŭ VSD-oj povas okazi kunlabore; tamen, oni scias malmulte pri la subaj mekanismoj.Intersubunuaj interfacoj ludas ŝlosilan rolon en alosteraj procezoj; tamen, tiaj interfacoj ne estis identigitaj en malfermaj Hv1-kanaloj.Ĉi tie ni pruvas, ke 2-guanidinotiazolaj derivaĵoj blokas du Hv1-VSD-ojn en kunlabora maniero kaj uzas unu el ĉi tiuj kunmetaĵoj kiel enketon por alostera kuniĝo inter malfermaj subunuoj.Ni trovis, ke la eksterĉelaj subunuoj. fino de la unua transmembranfragmento de VSD formas intersubunuan interfacon kiu mediacias kunligadon inter ligejoj, dum la boben-volva domajno ne estas rekte implikita en ĉi tiu procezo. Ni ankaŭ trovis fortan indicon ke la proton-selektema filtrilo de la kanalo kontrolas blokil-ligan kunlaboron. . Tensi-enirigitaj protonkanaloj ludas gravajn rolojn en diversaj organismoj, de fitoplanktono ĝis homoj1. En la plej multaj ĉeloj, tiuj kanaloj mediacias protonelfluon de la protonmembrano kaj reguligas la agadon de NADPH-oksidazo. La nura konata tensio-enirigita protonkanalo en homoj. estas Hv1, kiu estas la produkto de la geno HVCN12,3.Hv1 (alinome VSOP) pruviĝis ludi rolon en proliferado de B-ĉeloj4, produktado de reaktivaj oksigenaj specioj per la denaska imunsistemo5,6,7,8, spermoĉelo. motileco9 kaj pH-reguligo de aervoja surfaca fluido10. Ĉi tiu kanalo estas implikita en pluraj Troesprimitaj en kanceraj tipoj kiel B-ĉelaj malignaĵoj4,11 kaj mamaj kaj kolorektaj kanceroj12,13. Troa agado de Hv1 estis trovita pliigi la metastazan potencialon de kanceraj ĉeloj 11, 12. En la cerbo, Hv1 estas esprimita. de mikroglia, kaj ĝia agado pruviĝis pliseverigi cerbolezon en modeloj de iskemia bato. La Hv1-proteino enhavas tensi-sentantan domajnon (VSD), kiu konsistas el kvar transmembransegmentoj nomitaj S1 al S414. La VSD similas la ekvivalentajn domajnojn de tensi-enirigitaj Na+, K+ kaj Ca2+-kanaloj kaj tensi-sentemaj fosfatazoj, kiel ekzemple CiVSP de Ciona gutis15.En ĉi tiuj aliaj proteinoj, la C-finaĵo de S4 estas alkroĉita al efektormodulo, la pordomajno aŭ enzimo.En Hv1, S4 estas ligita al la bobenaĵa domajno (CCD) situanta sur la citoplasma flanko de la membrano. .La kanalo estas dimera komplekso konsistanta el du VSDoj, ĉiu enhavanta enirigitan protonan trapenetran vojon16,17,18.Ĉi tiuj du Hv1-subunuoj estis trovitaj malfermiĝi kooperative19,20,21,22, sugestante ke alostera kuplado kaj inter-subunuaj interagoj ludas. grava rolo en la enirprocezo.La interfaco inter la subunuoj ene de la volvita bobena domajno estas bone difinita ĉar la kristalaj strukturoj de la du izolitaj domajnoj estas haveblaj22,23.Aliflanke, la interfaco inter VSDoj ene de la membrano ne estas. bone komprenita.La kristala strukturo de la ĥimera proteino Hv1-CiVSP ne provizas informojn pri ĉi tiu interfaco, ĉar la trimera organizo de la kristaligita kanalkomplekso povas rezulti de la anstataŭigo de la indiĝena Hv1 CCD per la gistoleŭcina zipo GCN424. Lastatempa studo pri la subunua organizo de la kanalo Hv1 konkludis, ke du S4-helicoj transiras al la CCD sen severa interrompo de sekundara strukturo, rezultigante longajn helicojn kiuj komenciĝas de la membrano kaj projekcias en la citoplasmon. Surbaze de cisteina krucliga analizo, ĉi tiu studo proponas, ke Hv1-VSD-oj kontaktu unu la alian laŭ la S4-segmento. Tamen, aliaj studoj proponis alternativajn interfacojn inter VSD-oj. Ĉi tiuj interfacoj inkluzivas S1-segmentojn 17, 21, 26 kaj la eksterajn finaĵojn de S2-segmento 21. Ebla kialo de la konfliktanta. rezultoj de ĉi tiuj studoj estas ke alostera kuplado inter VSDoj estis ekzamenita rilate al la enirprocezo, kiu dependas de la fermitaj kaj malfermaj ŝtatoj, kaj la interfaco inter VSDoj povas varii en malsamaj ŝtatŝanĝoj en formo. Ĉi tie, ni trovis, ke 2-guanidinotiazole malhelpas Hv1-kanalojn per sinergie ligado al du malfermitaj VSD-oj, kaj uzis unu el la komponaĵoj, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), por sondi la interagadon inter subunuoj en la malferma stato. interfaco.Ni trovis, ke la GBTA-liga kurbo povas esti bone priskribita per kvanta modelo, en kiu ligado de inhibitoro al unu subunuo rezultigas pliiĝon en la liga afineco de la apuda subunuo.Ni ankaŭ trovis, ke restaĵoj D112, selektivecaj filtriloj por la kanalo 27, 28 kaj parto de la guanidina derivaĵo ligo-ejo 29 kontrolas GBTA-ligan kooperativecon.Ni montras, ke koopera ligado estas konservita en la Hv1-dimero, kie la CCD disiĝas de la S4-segmento, sugestante, ke la intersubunua interfaco en la CCD ne rekte disiĝas. mediaci alosteran kunligadon inter GBTA-ligaj ejoj. Kontraste, ni trovas ke la S1-fragmento estas parto de la interfaco inter la subunuoj kaj proponas aranĝon de apudaj VSDoj kun la eksterĉela fino de la S4-helico for de la centro de la dimero por permesi. la S1 fragmento esti en la malferma stato. Malgrandaj molekulaj inhibidores de Hv1 estas utilaj kiel kontraŭkancero-medikamentoj kaj neŭroprotektaj agentoj.Tamen, ĝis nun, malmultaj komponaĵoj povis malhelpi la kanalon30,31,32,33.Inter ili, 2-guanidinobenzimidazolo (2GBI, kunmetaĵo [1] en Figo). 1a) kaj ĝiaj derivaĵoj estis trovitaj bloki VSD29,32 trapenetron de protonoj tra la kanalo.Ligado de tiaj kunmetaĵoj okazas sendepende en la du malfermitaj subunuoj.2-guanidinobenzotiazole (GBTA, kunmetaĵo [2] en Figuro 1a) estis. antaŭe montrite inhibicii Hv1 preskaŭ same efike kiel 2GBI kiam provite ĉe koncentriĝo de 200 μM (Figuro 1b).Ni ekzamenis aliajn tiazolderivaĵojn kaj trovis, ke kelkaj el ili malhelpis la kanalon kun simila aŭ pli granda potenco ol GBTA (Fig. 1 kaj Suplementa). teksto).Ni determinis la koncentriĝajn respondkurbojn de kvar tiazolderivaĵoj (GBTA kaj kunmetaĵoj [3], [6] kaj [11], Fig. 1c) kaj trovis, ke ili estas pli krutaj ol tiuj de 2GBI.La Hill-koeficientoj (h) de tiazolderivaĵoj variis de 1.109 ± 0.040 ĝis 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c kaj Suplementa Fig. 1). Kontraste, la Hill-koeficiento por 2GBI estis 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a kaj Supplementary Fig. 1). Hill-koeficiento super 1 indikas ligan kunlaboron.Ĉar ĉiu Hv1-subunuo havas sian propran inhibitoron-. liga loko,29,32 ni rezonis, ke la ligado de tiazolderivaĵo al unu subunuo povus plibonigi la ligon de dua inhibitora molekulo al la apuda subunuo.GBTA estis la testa kunmetaĵo kun la plej alta Hill-koeficiento. Tial ni elektis ĉi tiun kunmetaĵon por plue studas la mekanismon de liga sinergio kaj uzis 2GBI kiel referencon negativa kontrolo. (a) Testaj komponaĵoj: [1] Referenco Hv1-inhibitoro 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazolo (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il) guanidino, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidine, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidine, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidine, [7] famotidino, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazole-4-karboksila acida etilestero, [9] 2-guanidino-4-metiletil-1,3-tiazole-5-karboksilato, [10] ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etila acetato, [11]1-[4-(4-Klorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidino, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidine .(b) Inhibicio de homa Hv1-agado per la indikitaj guanidinotiazoloj kaj la referenca kunmetaĵo 2GBI (bluverdaj stangoj) .Hv1-protonfluoj estis mezuritaj en eksteren-plakoj de Xenopus-ocitoj en respondo al malpolariĝo de tena potencialo de -80 mV ĝis +120 mV. Ĉiu inhibitoro estis aldonita al la bano ĉe koncentriĝo de 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Datumoj estas meznombro±SEM (n≥4).(c) Koncentriĝo-dependa inhibicio de homa Hv1 per kunmetaĵoj [2], [3], [6] kaj [11].Ĉiu punkto reprezentas la averaĝan inhibicion ± SD de 3 al 15 mezuradoj. La linio estas Monteta kongruo uzata por akiri la ŝajnajn Kd-valorojn raportitajn en Suplementa Tabelo 1.Hill-koeficientoj estis determinitaj el la kongruoj raportitaj en Suplementa Fig. 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0,033, h (3) = 1,25 ± 0,07, h (6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (vidu Metodoj). (a,b) Kunmetaĵoj 2GBI kaj GBTA inhibiciis dimeran kaj monomeran Hv1 en koncentriĝ-dependa maniero. Ĉiu punkto reprezentas la averaĝan inhibicion ± SD de 3 ĝis 8 mezuradoj kaj la kurbo estas Monteta konveno. La Hill-koeficientoj (h) montritaj en la enmetitaj histogramoj estis determinitaj de la kongruoj raportitaj en Suplementaj Figoj 3 kaj 4.La koncentriĝrespondo de GBTA montrita en (a) estas la sama kiel tiu en Fig. 1c.Vidu Suplementan Tabelon 1 por ŝajnaj Kd-valoroj. (c) Modelado de la kunlabora ligo de GBTA al dimera Hv1.La solida nigra linio reprezentas la kongruon al la eksperimentaj datumoj per ekvacio (6), kiu priskribas la ligan modelon montritan en (d).La strekitaj linioj etikeditaj Sub 1 kaj Sub 2 reprezentas la bimolekulan asocion. -disociaj ekvilibraj kurboj de la unua kaj dua liga eventoj, respektive (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Skema diagramo de la proponita mekanismo de la Hv1-bloko.En la kazo de GBTA, ligado al unu malferma subunuo pliigas la afinecon de la apuda malferma subunuo (Kd2 0.05) malkreskon en la Hill-koeficiento de GBTA-ligado al GGG-kanaloj kompare kun sovaĝa tipo (Fig. 5c), sugestante ke malgraŭ ĝia rolo en konservado de la. du subunuoj kune grava, sed CCD ne rekte mediacias intersubunit allosteric kuplado inter GBTA ligejoj. (a) Skema diagramo de la Hv1-dimero kun triglicinmutacio ĉe la interna fino de S4 dizajnita por interrompi la intersubunuan kupladon mediaciitan per la citoplasma volvita-volvaĵa domajno (bluaj sagoj). (b) Skema reprezentado de Hv1-dimeroj kaj ligaddimeroj kun indikitaj mutacioj, dizajnitaj por testi S1-fragmentojn implikitajn en kunigado inter subunuoj (bluaj sagoj). (c–h) 2GBI (ciano) kaj GBTA (malhelruĝa) malhelpas la indikitajn konstrukciojn en koncentriĝdependa maniero. Ĉiu punkto reprezentas la averaĝan inhibicion. ± SD de 3 ĝis 10 mezuradoj. La kurbo estis Monteta konveno uzata por akiri ŝajnajn Kd-valorojn (vidu Suplementan Tabelon 1). Hill-koeficientoj en la interpolitaj histogramoj estis determinitaj kiel priskribite en la sekcio de Metodoj (vidu Suplementajn Figojn 3 kaj 4). Referencaj h-valoroj por Hv1 WT estas montritaj kiel strekitaj linioj. Asteriskoj indikas statistike signifajn diferencojn inter mutaciuloj kaj WT-pasejoj (p 0.05, Fig. 5d,i) ). Aliflanke, mutacio D123A signife reduktis la Hill-koeficienton de GBTA (p 0,05/14). Ĉar neŭtraligi la ŝarĝon ĉe la pozicio 123 sur ambaŭ subunuoj rezultigis fortan ŝanĝon en GBTA-liga kooperativo, dum inversigi la ŝarĝon sur ambaŭ subunuoj havis nur malgrandan efikon, ni etendis la analizon por inkluzivi nur unu subunuon kun la inversiga kanalo de ŝargo.Ni generis Hv1-ligitajn dimerojn kun D123R-anstataŭigo en la C-fina subunuo (Fig. 5b) kaj mezuris la koncentriĝ-respondan inhibicion de GBTA kaj 2GBI.Ni trovis, ke la Hill-koeficiento de GBTA-ligado al WT-D123R-kanaloj estis signife pli alta ol tio. de sovaĝa tipo Hv1 (p 0.05). Ni ankaŭ trovis, ke en foresto de βME, la Hill-koeficiento de GBTA liganta al la D112E I127C Hv1-dimero estis signife pli alta ol tiu mezurita en la ĉeesto de reduktantaj agentoj (Fig. 6e kaj Suplementa Fig. 4), implicante ke La D112E-mutacio. ne aboliciis la pliiĝon de GBTA-liga kooperativo rezultanta de la krucligo de cisteino 127.La Hill-koeficiento de 2GBI liganta al D112E, I127C Hv1-dimeroj ankaŭ ne estis signife tuŝita de la D112E-mutacio (Figuro 1).6d kaj Suplementa. Fig. 3). Kune, ĉi tiuj trovoj sugestas, ke GBTA-ligado estas plifortigita per la interagado inter la eksteraj finoj de S1-fragmentoj en apudaj Hv1-subunuoj per allogaj elektrostatikaj interagoj aŭ per la formado de kovalentaj ligoj inter anstataŭigitaj cisteinoj. Dum la efiko de allogaj elektrostatikaj interagoj sur kooperativo povas esti aboliciita per mutacio D112E, la efiko de kovalentaj ligoj ne povas. En nia esplorado de la kemia spaco disponebla por ligado de guanidino-derivaĵoj al Hv1-kanaloj, ni trovis, ke 2-guanidinotiazoles kiel GBTA havas pli krutan koncentriĝan dependecon ol 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). La Hill-koeficienta analizo de GBTA liganta al ambaŭ la dimero kaj monomeraj kanaloj (Fig. 2a,b) kaj al la dimera kanalo en kiu unu subunuo estis antaŭ-ligita al la inhibitoro (Fig. 4) igis nin konkludi, ke la inhibicio de Hv1 per GBTA La ago estas sinergia procezo, kaj la ligejoj de la kunmetaĵoj en la du subunuoj estas alostere kunligitaj.La malkovro, ke GBTA ligas al la malferma kanalo, kiel antaŭe montrite por la rilata kunmetaĵo 2GBI32, sugestas, ke alostera kuplado povas esti specife taksita en la malferma stato.Nia koopera ligmodelo kapablis kvante priskribi la inhibicion de HV1 per GBTA (Fig. 2C) kaj klarigi la malsamajn efikojn de 2GBI kaj GBTA sur la kadukiĝo de kanalaj vostaj fluoj post membrana repolarizo, kiu subtenas nian interpreton de la liganta procezo. La maksimuma monteta koeficiento atingebla en alosteria proteino kun du ligaj lokoj (kiel HV1) estas 2. Ni mezuris GBTA por ligi HV1-sovaĝan tipon kun koeficiento de 1.31, kiu pliiĝis al 1.88 en HV1 I127C. Sinergia libera energio, la diferenco inter la ligaj liberaj energioj de la plej malaltaj kaj plej altaj afinecaj lokoj (vidu metodojn), estis 1,3 kcal/mole kaze de HV1-sovaĝa tipo kaj 2,7 kcal/mole en la kazo de HV1 I127C. de oksigeno al hemoglobino estas la plej fama kaj bone studita ekzemplo de la kunlabora procezo38. por homa hemoglobino (tetramero kun kvar alosteraj kunigitaj ligaj lokoj), la monteta koeficiento varias de 2,5-3,0, kun valoroj kiuj iras de 1,26 ĝis 3.64 kcal/mol, depende de eksperimentaj kondiĉoj38. thus, koncerne tutmondan energion, la kunlaboro de GBTA -ligado al HV1 ne estas substance malsama al tiu de O2 -ligado al hemoglobino kiam oni konsideras la malsamajn nombrojn de proteinaj subunuoj en la du sistemoj. En nia sinergia modelo, la ligado de GBTA -molekuloj al unu subunuo rezultigas pliigon de la liganta afineco de la apuda subunuo. Ni antaŭvidas procezon en kiu reordigo de la liganta medio rezultanta de la unua liganta okazaĵo (induktita taŭgeco) kondukas Ŝanĝoj en la interagoj inter subunuoj. En respondo al ĉi tiuj ŝanĝoj, apudaj subunuoj ŝanĝas siajn ligajn lokojn, rezultigante pli streĉan GBTA -ligadon. Dum ĉi tiu procezo, la S1 -aspartato D112 respondecas pri la reordigo de la liganta loko asociita kun pliigita liganta afineco. D112 antaŭe estis montrita parto de la HV1 -protona permeada vojo kaj agi kiel selektema filtrilo27,28. Niaj rezultoj montras, ke selekteblecaj filtriloj en la du HV1 -subunuoj estas alosterie kunigitaj en la malferma stato. Sur la kristala strukturo de la HV1-CIVSP-chimimero.Suggestitaj direktoj por alosteria kuplado implikanta la eksterĉelan finon de S1 estas montritaj per nigraj sagoj. (A) Skemo de la HV1 VSD.Based sur la kristala strukturo de la HV1-CIVSP-chimimero, la helicaj segmentoj estas montritaj esti cilindraj. En ĉi tiu agordo, la interna fino de la S4-segmento kunfandiĝas kun la CCD (ne montrita). La antaŭviditaj lokoj de ligitaj GBTA estas montritaj kiel grizaj ovaloj. Black -sagoj indikas vojojn implikitajn en alosteriaj kuplado inter ligaj lokoj en du apudaj subunuoj. En du malsamaj dimraj agordoj kiel viditaj de la eksterĉela flanko de la membrana ebeno. Sur la maldekstra panelo, la dimer -interfaco estas formita de la S4 -helico. Apartigo de la eksteraj finoj de la du S4 -helicoj (streĉitaj sagoj), produktas la aranĝon montritan dekstre. En ĉi tiu agordo, restaĵoj D123 kaj I127 de apudaj subunuoj rajtas proksimiĝi. (C) Skema reprezentado de la CIVSP VSD en la dimer -agordo trovita en la 4G80 -kristala strukturo. Pozicio P140 en CIVSP respondas al pozicio D123 en HV1. Niaj rezultoj montras, ke la repuŝa elektrostatika interagado inter restaĵo 123 (123D/123D aŭ 123R/123R) estas asociita kun "normala" nivelo de GBTA-liganta kunlaboro en la malferma stato kaj ŝanĝas la interagadon de repuŝo al altirita (123D/123R) , pliigita kunlaboro (Fig. 5G). Oni atendas, ke forigo de la repuŝa interagado kun alanina anstataŭigo ankaŭ kondukus al pliigita kunlaboro. Tamen, malpliigo de kunlaboro de la 123a/123a dimero estis observita (Fig. 5E). Klarigo estas, ke la malstabiliga efiko de metado de hidrofobaj restaĵoj en hidrofila medio povas superi la stabiligan efikon pro la elimino de repuŝaj interagoj inter D123 -restaĵoj, rezultigante totalan redukton de liganta kunlaboro. Pozicio D171 de Ciona Gutis CI-HV1 (responda al D123 en homa HV1) estas pliigita post aktivigo, subtenante la nocion ke D123 situas en hidrofila medio en la malferma stato. Kalkulado de HV1-kanaloj estas konata per multoblaj transiroj19,20,26,39,40,41.qiu et al26 trovis, ke post membrana depolarigo, la tensia sensilo de CI-HV1 spertas konforman ŝanĝon, kiu lasas la kanalon aktivigita sed ankoraŭ fermita , sekvita de aparta transiro, kiu kaŭzas, ke protonoj malfermas kondukadon en ambaŭ subunuoj. La perturbo de la fluoreska signalo konformas al la ĉeesto de elektrostatikaj interagoj inter la D171 -restaĵoj de apudaj subunuoj en iu momento laŭ la reagaj koordinatoj de la konforma ŝanĝo. Ĉi tiu interpreto konformas al nia konstato, ke la D123 -restaĵo elektrostatike interaktas en la malferma stato kaj mediacias alosterian kupladon inter GBTA -ligaj retejoj. Fujiwara et al25 proponis, ke la dimer-interfaco de la citoplasma bobena-bobena domajno etendiĝu en la membranon por enhavi du S4-helicojn (Fig. 7B, maldekstra panelo). La tuta VSD kaj funkcia analizo de la regiono liganta la S4 -helicon kaj la CCD.In la foreston de transmembrana pH -gradiento, HV1 -kanaloj postulas konsiderindan membran depolarigon por malfermiĝi, kaj cisteina interligo okazas en kondiĉoj, kie la kanalo estas ĉefe fermita. Sekve, la detektita S4-S4-interfaco probable reflektas la eksterŝtatan subunuan agordon. Aliaj studoj trovis evidentecon por la implikiĝo de S1 kaj S2 en intersubunaj interagoj dum Gating17,21,26 sugestante, ke kanaloj povas adopti malsamajn subunajn agordojn en la malferma kaj Fermitaj ŝtatoj, ideo konforma al la trovoj de Mony et al. S1 moviĝas 39 dum enradikiĝo. Ĉi tie, ni montras, ke en la malferma stato, la eksterĉelaj finoj de la S1-helico estas sufiĉe proksimaj por subteni rektajn elektrostatikajn interagojn, kiuj mediacias alosterian kupladon inter subunuoj. En la dimer-agordo kun etenditaj S4-S4-interagoj, la S1-helicoj estas tro malproksimaj Krom unu la alian por interagi rekte. Tamen, 20 ° en la horloĝa rotacio de la du VSD-subunuoj ĉirkaŭ akso perpendikle al la membrana ebeno, kombinita kun la disiĝo de la eksteraj finoj de la du S4 Kun niaj trovoj (Fig. 7B, dekstra panelo). Ni rekomendas ĉi tiun agordon por la kanalo en la malferma stato. Kvankam oni pensas, ke la enzimo CIVSP funkcias kiel monomero, la kristala strukturo de ĝia izolita VSD estas kaptita en dimer -stato. Por HV1 (Fig. 7c). En la civsp -dimero, la plej proksima restaĵo de la apuda subunuo estis prolino ĉe pozicio 140 (Fig. 7C). Interese, p140 en CIVSP respondas al pozicio D123 en HV1.La simileco en subunita agordo inter HV1 Kaj CIVSP -dimeroj sugestas, ke la VSD -oj de ĉi tiuj proteinoj havas intrinsekan tendencon formi interfacon, kie la eksterĉelaj finoj de S1 interagas. La esenca rolo de HV1 en sperma ĉela aktivado igas ĉi tiun kanalon alloga drogcelo por la kontrolo de vira fekundeco.Furthermore, aktivigo de HV1 en microglia pruviĝis plimalbonigi resaniĝon de iskemia streko. Plibonigita HV1 en pacientoj kun mamo 12 aŭ kolora kancero 13 kaj oni pensas, ke ĝi kontribuas al malignoj de B-ĉeloj 11. Tial, malgrandaj molekulaj drogoj celantaj HV1 povas esti uzataj kiel neuroprotektaj agentoj aŭ kontraŭkanceraj terapioj. Malferma HV1 -subunuo, kondukanta al pliigita liganta afineco, povas konduki al la disvolviĝo de pli potencaj drogoj celantaj HV1 -kanalojn. Site-direktita mutagenezo de homa HV1 estis farita uzante normajn PCR-teknikojn. En la konstruo HV1NCCIVSP, restaĵoj 1-96 kaj 228-273 de HV1 estis anstataŭigitaj per restaĵoj 1-113 kaj 240-576 de CIVSP18.in la HV1-ligita dimer, La C-finaĵo de unu subunuo estas ligita al la N-finaĵo de la dua subunuo per la ligilo GGSGGSGGSGGGSGG. T7 MMessage Mmachine Transskriba Kit (Ambion) .1-3 tagojn antaŭ elektrofisiologiaj mezuradoj, CRNA estis injektita en Xenopus-oocitojn (50 nl per ĉelo, 0,3-1,5 μg/μL) Ekocita bioscienco. Sekvanta RNA -injekto, ĉeloj estis konservitaj en ND96 -mezo enhavanta 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM piruvato, 100 μg/mL gentamicino, pH 7,2 18 ° C . 2-Guanidino-Benzimidazole [1], 2-Guanidino-Benzotiazole [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidino [5], (5-bromo-4 -metil-1,3 -tiazol-2-il) guanidino) [6], etila 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboxilato [8], etila 2-guanidino-4- metil-1,3-tiazol- 5-karboxilato [9] kaj (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) etila acetato [10] estis de Sigma-Aldrich.Famotidino [7] estis de MP Biomedicalics.1- [4 -(4-klorofenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidino [11] kaj 1- [4- (3,4-dimetoxifenil) -1,3- tiazol-2-il] guanidino [12] estis De matrico scienca. Ĉi tiuj komponaĵoj estas el la plej alta pureco komerce haveblaj. Ili estis solvitaj en seka DMSO por generi solvon de 100 mm, kiu tiam estis diluita en la registra solvo ĉe la dezirata fina koncentriĝo. Komponaĵoj 3 kaj 4 estis sintezitaj sube kun Almenaŭ 99% pureco. To a suspension of 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) in 25 mL of aqueous hydrochloric acid (2.5 N) was added solid dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol), and the resulting heterogeneous mixture estis refluita per vigla agitado dum 4 horoj. La reakcia miksaĵo estis malvarmetigita al ĉambra temperaturo kaj neŭtraligita per laŭgrada aldono de 10N -kalia hidroksido. La blanka precipitaĵo formita estis filtrita, lavita kun malvarma akvo (3 × 50 ml), sekigita en forno ( 65 ° C) dum pluraj horoj, kaj tiam rekristaligita el etila acetato/petrolo -etero por doni blankan solidon (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (lumo 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7.25 (tre larĝaj S, 4 H), 7.40 (D, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (S, 1 H), 7.92 (D , 1 H, J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114.2 (D, J = 3.5 Hz), 117.5 (D, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (Q, J = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): M/Z Kalkulita valoro.FOR C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, trovita : 261.0419. Nafto [1,2-D] tiazol-2-amino (300 mg, 1,5 mmol), sintezita kiel antaŭe priskribita, estis varmigita ĝis 200 ° C en oleo-bano en malgranda provtubo.300 mg (granda eksceso) cianamido kaj 1,0 ml conc. Al la varma komponaĵo estis aldonita hidroklorida acido rapide kaj la miksaĵo estis konservita en la oleo -bano dum ĉirkaŭ 2 minutoj, dum kiu la plej granda parto de la akvo forvaporiĝis. La reakcia miksaĵo tiam estis malvarmetigita al ĉambra temperaturo kaj la rezulta solidigita materialo estis rompita en malgrandajn pecojn kaj lavita per akvo por provizi palan flavan amorfan solidon. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (T, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (D, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z Kalkulita valoro. , trovita: 243.0704. Protonaj fluoj estis mezuritaj en internaj kaj eksteraj diakiloj de oocitoj esprimantaj malsamajn konstruojn uzante Axopatch 200B-amplifilon kontrolitan de Axon Digidata 1440A (Molekulaj Aparatoj) kun PCLAMP10-programaro. ) ethanesulfonika acido (MES), 30 mm tetraetilammonio (teo) mesylate, 5 mm te-klorido, 5 mm etilena glicol-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraacetika acido (egta), alĝustigita al pH 6,0 kun tea hidroksido. Ĉiuj mezuradoj estis faritaj je 22 ± 2 ° C. La pipeto havas aliran reziston de 1,5–4 MΩ. Aktualaj spuroj estis filtritaj je 1 kHz, samplitaj je 5 kHz kaj analizitaj kun Clampfit10.2 (Molekulaj Aparatoj ) kaj Origin8.1 (Originlab). Solvoj enhavantaj diversajn koncentriĝojn de HV1-inhibilo kaj en iuj kazoj 10 mM βME estis enkondukitaj en la banon per gravito tra dukto konektita al VC-6-perfuza valva sistemo (Warner Instr.), Pasinta tra la PCLAMP-programaro TTL (Transistoro- Transistora logiko) signaloj. Rapidaj perfuzaj eksperimentoj estis faritaj per plur-tuba perfuza krajono (aŭtomata scienco.) Kun 360 μm-diametra livera pinto muntita antaŭ diakilo. +120 mV depolarizanta pulson. Uzata por korekti por nuna kadukiĝo 18. La GV -grafeo konvenas al la ekvacio de Boltzmann: la ŝajnaj disigaj konstantoj (KD) por malsamaj kombinaĵoj de kanaloj kaj inhibidores (Suplementa Tabelo 1) estis determinitaj konvenante la koncentriĝan dependecon de inhibicio (mezume %inhib valoroj) Kun la monteta ekvacio: kie [i] estas la koncentriĝo de inhibilo i kaj h estas la monteta koeficiento. Por kalkuli la montetan koeficienton, ekvacio (2) estas reordigita kiel: