Avatud Hv1 prootonikanali allostevahelise liidese küsitlus allosteeriliselt ühendatud sondiga

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com. Teie kasutatav brauseri versioon toetab CSS-i piiratud ulatuses. Parima kasutuskogemuse tagamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja lülitada). Seni aga veenduge, et jätkuvat tuge, kuvame saidi ilma stiilide ja JavaScriptita. Hv1 pingega juhitav prootonikanal on dimeerne kompleks, mis koosneb kahest pingetundlikust domeenist (VSD), millest igaüks sisaldab piiratud prootonite läbitungimise rada. Dimerisatsiooni juhib tsütoplasma keerdunud mähisdomeen. Üleminek suletud olekust teadaolevalt esineb mõlema VSD avatud olek koostöös; selle aluseks olevad mehhanismid on aga vähe teada. Allosteerilistes protsessides mängivad allosteerilistes protsessides võtmerolli allüksustevahelised liidesed; kuid avatud Hv1 kanalites ei ole selliseid liideseid tuvastatud. Siin demonstreerime, et 2-guanidinotiasooli derivaadid blokeerivad koostöös kahte Hv1 VSD-d ja kasutavad ühte neist ühenditest avatud subühikute vahelise allosteerilise sidestuse andjana. Leidsime, et ekstratsellulaarne VSD esimese transmembraanse fragmendi ots moodustab allüksustevahelise liidese, mis vahendab sidumissaitide vahelist sidet, samas kui mähisega domeen ei ole selles protsessis otseselt seotud. Samuti leidsime kindlaid tõendeid selle kohta, et kanali prootoniselektiivne filter kontrollib blokeerijate sidumise koostööd . Pingepõhised prootonikanalid mängivad olulist rolli mitmesugustes organismides, alates fütoplanktonist kuni inimesteni1.Enamikus rakkudes vahendavad need kanalid prootonite väljavoolu prootonmembraanilt ja reguleerivad NADPH oksüdaasi aktiivsust. Ainus teadaolev pingega seotud prootonikanal inimestel on Hv1, mis on HVCN1 geeni produkt2,3.Hv1 (teise nimega VSOP) mängib rolli B-rakkude proliferatsioonis4, reaktiivsete hapnikuliikide tootmises kaasasündinud immuunsüsteemi poolt5,6,7,8, spermarakkudes. hingamisteede pinnavedeliku liikuvus9 ja pH reguleerimine10. See kanal osaleb mitmes üleekspresseeritud vähitüüpides, nagu B-rakulised pahaloomulised kasvajad4,11 ning rinna- ja jämesoolevähk12,13.Leidti, et Hv1 liigne aktiivsus suurendab vähirakkude metastaatilise potentsiaali 11, 12. Ajus ekspresseerub Hv1. mikrogliia poolt ja on näidatud, et selle aktiivsus süvendab isheemilise insuldi mudelites ajukahjustusi. Hv1 valk sisaldab pingetundlikku domeeni (VSD), mis koosneb neljast transmembraansest segmendist, mida nimetatakse S1 kuni S414. VSD sarnaneb pingest sõltuvate Na+, K+ ja Ca2+ kanalite ning pingetundlike fosfataaside vastavate domeenidega, nagu CiVSP alates Ciona gutis15.Nendes teistes valkudes on S4 C-ots kinnitatud efektormooduli, pooride domeeni või ensüümi külge. Hv1 puhul on S4 seotud coiled-coil domeeniga (CCD), mis asub membraani tsütoplasmaatilisel küljel .Kanal on dimeerne kompleks, mis koosneb kahest VSD-st, millest kumbki sisaldab piiratud prootonite läbimise rada16, 17, 18. Leiti, et need kaks Hv1 subühikut avanevad koostöös19, 20, 21, 22, mis viitab allosteerilisele sidestusele ja allüksustevahelisele interaktsioonile. Tähtis roll väravaprotsessis. Pooli mähise domeeni allüksuste vaheline liides on täpselt määratletud, kuna kahe isoleeritud domeeni kristallstruktuurid on saadaval22, 23. Teisest küljest ei ole VSD-de vaheline liides membraanis Hv1-CiVSP kimäärse valgu kristallstruktuur ei anna selle liidese kohta teavet, kuna kristalliseerunud kanalikompleksi trimeerne korraldus võib tuleneda natiivse Hv1 CCD asendamisest pärmi leutsiini tõmblukuga GCN424. Hiljutises Hv1 kanali allüksuste korralduse uuringus jõuti järeldusele, et kaks S4 spiraali siirduvad CCD-sse ilma sekundaarse struktuuri tõsiste häireteta, mille tulemuseks on pikad heeliksid, mis algavad membraanist ja ulatuvad tsütoplasmasse. Tsüsteiini ristsidumise analüüsi põhjal selles uuringus tehakse ettepanek, et Hv1 VSD-d võtaksid üksteisega ühendust piki S4 segmenti.Teised uuringud on aga pakkunud välja alternatiivsed liidesed VSD-de vahel. Nende liideste hulka kuuluvad S1 segmendid 17, 21, 26 ja S2 segmendi 21 välisotsad. Vastuolu võimalik põhjus Nende uuringute tulemused näitavad, et VSD-de vahelist allosteerilist sidumist uuriti seoses väravaprotsessiga, mis sõltub suletud ja avatud olekust, ning VSD-de vaheline liides võib konformatsiooni erinevates olekumuutustes erineda. Siin leidsime, et 2-guanidinotiasool inhibeerib Hv1 kanaleid, seondudes sünergistlikult kahe avatud VSD-ga, ja kasutasime ühte ühendit, 2-guanidinobensotiasooli (GBTA), et uurida avatud olekus allüksuste vahelist interaktsiooni. Avastasime, et GBTA seondumiskõverat saab hästi kirjeldada kvantitatiivse mudeliga, milles inhibiitori sidumine ühe alaühikuga suurendab külgneva subühiku seondumisafiinsust. Samuti leidsime, et jäägid D112, selektiivsusfiltrid kanalid 27, 28 ja osa guanidiini derivaadi sidumissaidist 29 kontrollivad GBTA sidumise kooperatiivsust. Näitame, et kooperatiivne sidumine säilib Hv1 dimeeris, kus CCD eraldub S4 segmendist, mis viitab sellele, et CCD-s allüksustevaheline liides ei puutu otseselt kokku vahendavad allosteerilist sidestust GBTA-sidumissaitide vahel. Seevastu leiame, et S1 fragment on osa subühikute vahelisest liidesest ja pakume välja külgnevate VSD-de paigutuse nii, et S4 heeliksi rakuväline ots on dimeeri keskpunktist eemal, et võimaldada S1 fragment olema avatud olekus. Hv1 väikesemolekulilised inhibiitorid on kasulikud vähivastaste ravimite ja neuroprotektiivsete ainetena. Kuid siiani on vähesed ühendid suutnud inhibeerida kanalit30, 31, 32, 33. Nende hulgas on 2-guanidinobensimidasool (2GBI, ühend [1] joonisel fig. 1a) ja selle derivaadid blokeerivad VSD29,32 prootonite läbitungimist läbi kanali. Arvatakse, et selliste ühendite seondumine toimub kahes avatud subühikus sõltumatult. 2-guanidinobensotiasool (GBTA, ühend [2] joonisel 1a). Varem on näidatud, et see inhibeerib Hv1 peaaegu sama tõhusalt kui 2GBI, kui seda testiti kontsentratsioonil 200 μM (joonis 1b). Uurisime teisi tiasooli derivaate ja leidsime, et mõned neist inhibeerivad kanalit sarnase või tugevama toimega kui GBTA (joonis 1 ja lisa). tekst).Määrasime nelja tiasooli derivaadi (GBTA ja ühendid [3], [6] ja [11], joonis 1c) kontsentratsiooni-vastuse kõverad ja leidsime, et need olid järsemad kui 2GBI omad. Hilli koefitsiendid (h) tiasooli derivaatide sisaldus oli vahemikus 1,109 ± 0,040 kuni 1,306 ± 0,033 (joonis fig. 1c ja täiendav joonis 1). Seevastu 2GBI Hilli koefitsient oli 0,975 ± 0,024 29, joonis 2a ja täiendav joonis 1). Hilli koefitsient üle 1 näitab sidumiskooperatiivsust. Kuna igal Hv1 alaühikul on oma inhibiitor- sidumissait,29,32, põhjendasime, et tiasooli derivaadi sidumine ühe alaühikuga võib suurendada teise inhibiitormolekuli seondumist külgneva alaühikuga. GBTA oli kõrgeima Hilli koefitsiendiga testühend. Seetõttu valisime selle ühendi täiendavalt uurige sidumissünergia mehhanismi ja kasutasime 2GBI-d negatiivse kontrollina. a) Testühendid: [1] Võrdlus Hv1 inhibiitor 2-guanidinobensimidasool (2GBI).[2] 2-guanidinobensotiasool (GBTA), [3] (5-trifluorometüül-1,3-bensotiasool-2-üül)guanidiin, [4]nafto[1,2-d][1,3]tiasool-2-üül -guanidiin, [5](4-metüül-1,3-tiasool-2-üül)guanidiin, [6](5-bromo-4-metüül-1,3-tiasool-2-üül)guanidiin, [7] famotidiin, [8] 2-guanidino-5-metüül-1,3-tiasool-4-karboksüülhappe etüülester, [9] 2-guanidino-4-metüületüül-1,3-tiasool-5-karboksülaat, [10 ](2-guanidino-4-metüül-1,3-tiasool-5-üül)etüülatsetaat, [11]1-[4-(4-klorofenüül)-1,3-tiasool-2-üül]guanidiin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksüfenüül)-1,3-tiasool-2-üül]guanidiin. (b) Inimese Hv1 aktiivsuse inhibeerimine näidatud guanidinotiasoolide ja võrdlusühendi 2GBI poolt (sinised-rohelised tulbad) .Hv1 prootonivoolud mõõdeti Xenopus ootsüütide seest-välja naastudes vastusena depolarisatsioonile hoidepotentsiaalilt -80 mV kuni +120 mV. Iga inhibiitor lisati vanni kontsentratsioonis 200 µM.pHi = pHo = 6,0 .Andmed on keskmised ± SEM (n≥4).(c) Inimese Hv1 kontsentratsioonist sõltuv inhibeerimine ühendite [2], [3], [6] ja [11] poolt. Iga punkt tähistab keskmist inhibeerimist ± SD 3 15 mõõtmiseni. See joon on Hilli sobivus, mida kasutatakse täiendavas tabelis 1 esitatud näivate Kd väärtuste saamiseks. Hilli koefitsiendid määrati lisajoonisel 1 esitatud sobivuste põhjal: h (1) = 0,975 ± 0,024 h (2) = 1,306 ± 0,024 h (2) 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (vt meetodid). (a, b) Ühendid 2GBI ja GBTA inhibeerisid dimeerset ja monomeerset Hv1 kontsentratsioonist sõltuval viisil. Iga punkt tähistab 3–8 mõõtmise keskmist inhibeerimist ± SD ja kõver on Hilli sobivus. Hilli koefitsiendid (h) on näidatud sisestatud histogrammid määrati lisajoonistel 3 ja 4 esitatud sobivuste põhjal. Punktis (a) näidatud GBTA kontsentratsioonireaktsioon on sama, mis joonisel 1c. Nähtavaid Kd väärtusi vaadake täiendavast tabelist 1. (c) GBTA kooperatiivne sidumine dimeerse Hv1-ga. Pidev must joon tähistab valemi (6) sobitamist eksperimentaalsete andmetega, mis kirjeldab punktis d näidatud sidumismudelit. Katkendjooned märgistusega Sub 1 ja Sub 2 tähistavad bimolekulaarset seost - vastavalt esimese ja teise seondumissündmuse dissotsiatsioonitasakaalu kõverad (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; alam 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Hv1 ploki pakutud mehhanismi skemaatiline diagramm.GBTA puhul suurendab ühe avatud subühikuga seondumine külgneva avatud subühiku afiinsust (Kd2 0,05, joonis 5d, i). ). Teisest küljest vähendas mutatsioon D123A märkimisväärselt GBTA Hilli koefitsienti (p 0,05/14). Kuna laengu neutraliseerimine positsioonis 123 mõlemal allüksusel põhjustas tugeva muutuse GBTA sidumiskoostöös, samas kui mõlema alaühiku laengu ümberpööramisel oli vaid väike mõju, laiendasime analüüsi nii, et see hõlmaks ainult ühte laengu inversioonikanaliga alaühikut. genereeris Hv1-seotud dimeere D123R asendusega C-terminaalses subühikus (joonis 5b) ja mõõtis kontsentratsiooni-vastuse inhibeerimist GBTA ja 2GBI poolt. Leidsime, et GBTA WT-D123R kanalitega seondumise Hilli koefitsient oli oluliselt kõrgem. metsiktüüpi Hv1 (p 0,05). Samuti leidsime, et βME puudumisel oli GBTA D112E I127C Hv1 dimeeriga seondumise Hilli koefitsient oluliselt kõrgem kui redutseerivate ainete juuresolekul mõõdetud koefitsient (joonis 6e ja täiendav joonis 4), mis tähendab, et D112E mutatsioon ei kaotanud GBTA sidumise kooperatiivsuse suurenemist, mis tulenes tsüsteiini 127 ristsidumisest. 2GBI D112E, I127C Hv1 dimeeridega seondumise Hilli koefitsienti ei mõjutanud oluliselt ka mutatsioon D112E (joonis 1). 6d ja täiendav joonis 3). Kokkuvõttes näitavad need leiud, et GBTA seondumist suurendab külgnevate Hv1 alaühikute S1 fragmentide välisotste interaktsioon atraktiivsete elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu või asendatud tsüsteiinide vahel kovalentsete sidemete moodustumise kaudu. Kuigi atraktiivsete elektrostaatiliste interaktsioonide mõju koostöövõimele saab kaotada mutatsiooniga D112E, ei saa kovalentsete sidemete mõju. Uurides guanidiini derivaatide Hv1 kanalitega sidumiseks saadaolevat keemilist ruumi, leidsime, et 2-guanidinotiasoolidel nagu GBTA on järsem sõltuvus kontsentratsioonist kui 2-guanidinobensimidasoolidel (joonis 1c). GBTA mõlema dimeersega seondumise Hilli koefitsiendi analüüs ja monomeersed kanalid (joonis 2a, b) ja dimeerne kanal, milles üks subühik oli eelnevalt inhibiitoriga seotud (joonis 4), viisid meid järeldusele, et Hv1 inhibeerimine GBTA poolt Toime on sünergistlik protsess ja kahes alaühikus olevate ühendite seondumiskohad on allosteeriliselt seotud. Avastus, et GBTA seondub avatud kanaliga, nagu eelnevalt näidatud seotud ühendi 2GBI32 puhul, viitab sellele, et allosteerilist sidestust saab konkreetselt hinnata avatud olekus. Meie kooperatiivne sidumismudel suutis kvantitatiivselt kirjeldada Hv1 pärssimist GBTA poolt (joonis 2C) ja selgitada 2GBI ja GBTA erinevaid mõjusid kanali sabavoolude lagunemisele pärast membraani repolarisatsiooni, mis toetab meie sidumisprotsessi tõlgendamist. Maksimaalne künka koefitsient, mida saab saavutada kahe sidumiskohaga allosteerilises valgus (näiteks HV1), on 2. Mõõdeti GBTA-d, et siduda HV1 metsiktüüp koefitsiendiga 1,31, mis suurenes HV1 I127C-s 1,88-ni. Sünergistlik vaba energia, erinevus madalaima ja kõrgeima afiinsuskohtade siduvate vabade energiate vahel (vt meetodid), oli HV1 metsiktüüpi ja 2,7 kcal/mooli korral 1,3 kcal/mooli. hapnikust hemoglobiinist on kõige kuulsam ja hästi uuritud näide koostööprotsessist38. Inimese hemoglobiini (nelja allosteeriliselt ühendatud sidumiskohaga tetramer) jaoks on mäekoefitsient vahemikus 2,5-3,0, väärtused vahemikus 1,26 kuni 3,64 kuni 3,64 KCAL/MOL, sõltuvalt katsetingimustest38.Tus globaalse energeetika osas ei erine GBTA -ga seondumise HV1 -ga seonduvus oluliselt sellest, kui O2 seondub hemoglobiiniga, kui kaalutakse kahes süsteemis erinevate valgu alaühikute arvu. Meie sünergiamudelis põhjustab GBTA molekulide seondumine ühe subühikuga külgneva subühiku sidumise afiinsuse suurenemist. Arvame protsessi, mille käigus seondumiskeskkonna ümberkorraldamine tuleneb esimesest sidumissündmusest (indutseeritud sobivat) Subühikute interaktsioonide muutused. Vastuses nendele muutustele muudavad külgnevad alaühikud nende sidumissaite, mille tulemuseks on tihedam GBTA sidumine. Selle protsessi vähendamine on S1 aspartaat D112 vastutav seondumissaidi ümberkorraldamise eest, mis on seotud suurenenud seondumisafiinsusega.D1112.D112 varem näidati, et see kuulub HV1 prootoni läbilaske raja osaks ja toimib selektiivsuse filtrina27,28. Meie tulemused näitavad, et kahe HV1 alaühiku selektiivsuse filtrid on avatud olekus allosteeriliselt ühendatud. Joonis 7A näitab GBTA sidumissaidi ligikaudset asukohta ja jääkide D112, D123, K125 ja I127 asukohta HV1 VSD -l põhineva skeemi korral. HV1-CIVSP kimääri kristallstruktuuril. S1 rakuvälise otsaga seotud allosteerilise sidumise jaoks on näidatud mustade nooltega. (A) HV1 vsd.-skeem. Põhinedes HV1-CIVSP kimääri kristallstruktuuril, osutuvad spiraalsed segmendid silindriliseks. Selles konfiguratsioonis sulandub S4 segmendi sisemine ots CCD-ga (pole näidatud). Seotud GBTA ennustatud asukohad on näidatud hallide ovaalidena. Nooled tähistavad kahe külgneva alaühiku sidumiskohtade allosteeriliste ühendamisega seotud radu. Uuritud S1 jääkide positsioonid on tähistatud värviliste sfääridega. B) HV1 alaühikute skemaatiline illustratsioon, mis on paigutatud paigutatud HV1 alaühikute kohta kahes erinevas dimeeri konfiguratsioonis, nagu on näha membraanitasandi rakuvälisest küljest. Vasakul paneelil moodustatakse dimeeri liidese S4 spiraali abil. Kahe VSDS -i 20 kraadi päripäeva membraanitasapinnaga risti asetseva telje ümber. Kahe S4 heeliksi (kriipshetked) välimiste otste eraldamine annab paremal näidatud paigutuse. Selle konfiguratsiooni korral on jäägid D123 ja I127 külgnevatest alaühikutest lastakse lähedale tulla. c) CivSP VSD skemaatiline esitus 4G80 kristallstruktuuris leiduvas dimeeri konfiguratsioonis vastab CivSP -s asuv P140 positsioonile D123 HV1 -s. Meie tulemused näitavad, et jäägi 123 (123d/123d või 123R/123R) vaheline tõrjuv elektrostaatiline interaktsioon on seotud GBTA-ga siduva koostöövõimega "normaalse" tasemega avatud olekus ja nihutab interaktsiooni tõrkest meelitamiseks (123d/123R) , Suurenenud koostöö (joonis 5G). Eeldatakse, et tõrjuva interaktsiooni eemaldamine alaniini asendamisega tooks kaasa ka suurenenud koostööd. Kuid iHKUKS täheldati 123A/123A dimeeri koostöö vähenemist (joonis 5E). Üks võimalik Selgitus on, et hüdrofoobsete jääkide paigutamise destabiliseeriv toime hüdrofiilsesse keskkonda võib kaaluda üles stabiliseeriv toime, mis on tingitud D123 jääkide tõrjuvate interaktsioonide kõrvaldamisest, mille tulemuseks on seondumise üldine vähenemine. Ciona Gutis CI-HV1 positsioon D171 (vastab D123-le inimese HV1-s) suureneb aktiveerimisel, toetades arvamust, et D123 asub avatud olekus hüdrofiilses keskkonnas. HV1 kanalite värav toimub teadaolevalt mitme ülemineku kaudu19,20,26,39,40,41 .qiu jt26 leidsid, et membraani depolarisatsiooni korral läbib CI-HV1 pingeandur konformatsioonilise muutuse, mis jätab kanali aktiveeritud, kuid endiselt suletud aktiivsusega, kuid endiselt suletud. , millele järgnes selge üleminek, mis põhjustab prootonite avamist juhtivust mõlemas subühiku rajal. Pingeanduri konformatsioonilist muutust jälgiti pingeklambri fluorestsentsi abil ja leiti, et teist üleminekut häiris valikuliselt positsiooni D171 mutatsiooniga. Fluorestsentssignaali häirimine on kooskõlas elektrostaatiliste interaktsioonide olemasoluga külgnevate alaühikute D171 jääkide vahel mingil hetkel piki konformatsioonimuutuse reaktsiooni koordinaate. See tõlgendus on kooskõlas meie järeldusega, et D123 jääk interakteerub avatud olekus avatud olekuga. ja vahendab allosteerilist sidumist GBTA sidumissaitide vahel. Fujiwara jt25 tegid ettepaneku, et tsütoplasmaatilise mähise-mähise domeeni dimeeri liides ulatub membraanile, et see sisaldaks kahte S4 heeliks (joonis 7B, vasak paneel). Kogu VSD ja S4 spiraali ja CCD -d ühendava piirkonna funktsionaalne analüüs. Transmembraanse pH gradiendi puudumisel nõuavad HV1 kanalid avamiseks märkimisväärset membraani depolarisatsiooni ja tsüsteiini ristsidestamine toimub tingimustes, kus kanal on valdavalt suletud. Seetõttu peegeldab tuvastatud S4-S4 liides tõenäoliselt riigivälise alaühiku konfiguratsiooni. Teised uuringud on leidnud tõendeid S1 ja S2 kaasamise kohta SUBUNIT-ivahelistes interaktsioonides Gating17,21,26 ajal, mis viitab sellele, et kanalid võivad kasutada erinevaid subühiku konfiguratsioone avatud ja avatud ja avatud alaühiku konfiguratsioonid ja avades ja erinevad alaühiku konfiguratsioonid. Suletud olekud, idee, mis on kooskõlas Mony jt järeldustega. S1 liigub 39 värava ajal. Siin näitame, et avatud olekus on S1 spiraali rakuvälised otsad piisavalt lähedal, et toetada otseseid elektrostaatilisi interaktsioone, mis vahendavad allosteerilist sidumist alaühikute vahel. Dimeeri konfiguratsioonis laiendatud S4-S4 interaktsioonidega on S1 heelikid liiga kaugel Peale üksteise otseselt suhtlemiseks. Kuid kahe VSD subühiku 20 ° päripäeva pöörlemine membraanitasapinnaga risti asetseva telje ümber koos kahe S4 heelika välimise otste eraldamisega andis S1-S1 konfiguratsiooni järjekindlalt Meie leidudega (joonis 7b, parem paneel). Soovitame seda kanalit avatud olekus. Ehkki arvatakse, et CivSP ensüüm toimib monomeerina, jäädvustatakse selle isoleeritud VSD kristallstruktuur dimeeri olekus. Selle dimeeri S1 heelikate välimised otsad on ruumiliselt lähestikku ja üldine konfiguratsioon on sarnane pakutud koosseisuga HV1 jaoks (joonis 7C). CivSP dimeeris oli külgneva alaühiku lähim jääk positsioonis 140 (joonis 7C). ja CivSP dimeerid viitavad sellele, et nende valkude VSD -del on sisemine kalduvus moodustada liidese, kus S1 rakuvälised otsad interakteeruvad. Hv1 oluline roll spermarakkude aktiveerimisel muudab selle kanali atraktiivse ravimi sihtmärgiks meeste viljakuse kontrollimiseks. Furthermore, Hv1 aktiveerimine mikroglias on näidatud, et see süvendab isheemilisest insuldist taastumist. Leiti, et HV1 aktiivsus on seotud madalamaga Rindade 12 või kolorektaalse vähiga patsientidel 13 ja arvatakse, et see aitab kaasa B-rakkude pahaloomulistele kasvajatele 11. Seetõttu võib HV1-le suunatud väikeste molekulravimite kasutamist kasutada neuroprotektiivsete ainetena või vähivastaste ravimitena. Avastus, mis guanidinotiasooli derivatsid võivad indutseerida konformatiivseid ümberkorraldusi. Avatud HV1 subühik, mis põhjustab seondumisafiinsust suurenenud, võib põhjustada tugevamate ravimite tekke, mis on suunatud HV1 kanalitele. Inimese HV1 saidi suunatud mutagenees viidi läbi standardsete PCR-tehnikate abil. HV1NCCIVSP konstruktis asendati HV1 jäägid 1-96 ja 228-273 jääkidega 1-113 ja 240-576 CIVSP18-ga. Ühe alaühiku C-otsa on seotud teise alaühiku N-otsaga GGSGGGSGSGSGGGGGLKERI kaudu. Erinevaid konstruktsioone sisaldavaid Pgemhe plasmiidid lineaariti NHE1 või SPH1 restriktsiooniensüümidega (Uus-Inglismaa Biolabs) ja RNA sünteesit. T7 MMessage mMachine transkriptsiooni komplekt (ambion) .1-3 päeva enne elektrofüsioloogilisi mõõtmisi süstiti CRNA ksenopuse munarakkudesse (50 nl raku kohta, 0,3–1,5 μg/μl). Etap V ja VI munarakud Xenopus Lavis (NASCO) olid saadud. Ökotsüütide bioteadusest. RNA -süstimise järgimine hoiti rakke ND96 söötmes, mis sisaldas 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM MGCl, 10 mM HEPES, 5 mM püruvaat, 100 μg/ml gentamiin, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-bensimidasool [1], 2-guanidino-bensotiasool [2], (4-metüül-1,3-tiazol-2-üül) guanidiin [5], (5-bromo-4-metüül-1,3 -Tiasool-2-üül) guanidiin) [6], etüül 2-guanidino-5-metüül-1,3-tiazole-4-karboksülaat [8], etüül 2-guanidino-4-metüül-1,3-tiasool- 5-karboksülaat [9] ja (2-guanidino-4-metüül-1,3-tiazol-5-yl) etüülatsetaat [10] olid pärit Sigma-Aldrich.famotidiinist [7] pärit MP biomeditsiinidest.1- [4 -(4-klorofenüül) -1,3-Thiazol-2-üül] guanidiin [11] ja 1- [4- (3,4-dimetoksüfenüül) -1,3- tiazol-2-yl] guanidiin [12] oli Matrix Scientificist. Need ühendid on müügil kõige kõrgema puhtusega. Need lahustati kuiva DMSO -s, et genereerida 100 mm lahus, mis seejärel lahjendati salvestuslahuses soovitud lõppkontsentratsioonil vähemalt 99% puhtus. 2-amino-4- (trifluorometüül) bensenetoolvesinikkloriidi (1,02 g, 4,5 mmol) suspensioonini 25 ml vesivesinikkloriidhapet (2,5 N) lisati tahket ditsüandimiid (380 mg, 4,5 mmol) ja tulemuslik heterogeenne segu) oli 4 -tunnise jõulise segamisega tagasijooksuga. Reaktsioonisegu jahutati toatemperatuurini ja neutraliseeriti 10N kaaliumhüdroksiidi järkjärgulise lisamisega. Valge sademeid moodustati filtreeriti, pesti külma veega (3x 50 ml), kuivatati ahjus (kuivatati (kuivatati ahjus (kuivatati ahjus ( 65 ° C) mitu tundi ja seejärel etüülatsetaadist/petrooleetrist ümber kristalliseeritud, et saada valge tahke aine (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (valgus 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7,25 (väga lai S, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (D , 1 h, j = 8,1 Hz) .13c NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (Q, J, J = 272 Hz), 126,1 (Q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.HRMS (ESI): m/z arvutatud väärtus.F9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, leitud, leitud 261.0416, leitud 261.0416 : 261.0419. Naftho [1,2-D] tiasool-2-amiin (300 mg, 1,5 mmol), sünteesiti vastavalt eelnevalt kirjeldatule, kuumutati õlivannis temperatuurini 200 ° C väikeses katseklaasis.300 mg (suur liigne) tsüanamiid ja 1,0 ml conc. kuni kuum ühend lisati vesinikkloriidhappe kiiresti ja segu hoiti õlivannis umbes 2 minutit, mille jooksul aurutati suurem osa veest. Seejärel jahutati reaktsioonisegu toatemperatuurini ja saadud tahkestatud materjali purustati väikesteks tükkideks ja pesti veega, et saada kahvatukollane amorfne tahke aine. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7,59 (T, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (T, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (D, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 Hz) .13C NMR (150) MHz, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169.1.hrms (ESI): m/z arvutatud väärtus.FOR C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , leitud: 243.0704. Prootonvoolud mõõdeti erinevaid konstruktsioone ekspresseerivate munarakkude sise- ja välistes plaastrites, kasutades AxoPatch 200B võimendit, mida juhib Axon Digidata 1440A (molekulaarsed seadmed) koos PCLAMP10 tarkvaraga.intratsellulaarsetel ja rakuvälistel lahustel on sama kompositsioon: 100 mm 2- (N-morfolino (N-Morpholino (N-morfolino ( ) etaansulfoonhape (MES), 30 mM tetraetüülammoonium (Tea) mesülaat, 5 mM teekloriid, 5 mM etüleenglükool-Bis (2-aminoetüleeritud) -N, N, N ', n'-tetraathape (EGTA), kohandatud pH 6,0 teehüdroksiidiga. Kõik mõõtmised viidi läbi temperatuuril 22 ± 2 ° C. ) ja päritolu 8.1 (originLab). Lahused, mis sisaldasid HV1 inhibiitori erinevaid kontsentratsioone ja mõnel juhul 10 mM βME-le viidi vanni gravitatsiooni abil kollektori kaudu, mis oli ühendatud VC-6 perfusiooniklapi süsteemiga (Warner Instr.), Mis läbiti PCLAMP tarkvara TTL (transistor- Transistori loogika) signaalid. Rapiidsed perfusioonikatsed viidi läbi mitme toruga perfusioonipliiatsi abil (automatiseeritud sci.) 360 μm läbimõõduga manustamisotsaga, mis oli paigaldatud plaastri pipeti ette. Kanalite inhibeerimine määrati isokronaalsete amperomeetriliste mõõtmetega lõpus lõpus asuva +120 mV depolariseeriv impulss.gv mõõtmised viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatud 18,20. Saba voolud registreeriti pärast depolarisatsiooni etappidel temperatuuril -40 mV erinevatel pingetel vahemikus -20 mV kuni +120 mV Kasutatakse voolu lagunemise korrigeerimiseks 18. GV -graafik sobib Boltzmanni võrrandiga: kanalite ja inhibiitorite erinevate kombinatsioonide näilised dissotsiatsioonikonstandid (KD) (täiendav tabel 1) määrati, sobitades inhibeerimise kontsentratsiooni sõltuvuse (keskmised %inhibiväärtused) Mäevõrrandiga: kus [I] on inhibiitori I ja H kontsentratsioon mäe koefitsient. Mäe koefitsiendi arvutamiseks on võrrand (2) ümber korraldatud järgmiselt: