Hv1 protoi kanal irekiaren subunitateen arteko interfazearen galdeketa alosterikoki akoplatutako zunda batekin

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena izateko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, ziurtatzeko laguntza jarraituz, gunea estilorik eta JavaScript gabe bistaratuko dugu. Hv1 tentsio bidezko protoi-kanala tentsio-sentsoreko bi domeinuz (VSD) osatutako konplexu dimeriko bat da, eta horietako bakoitzak protoiaren iragazpen-bide itxi bat dauka. bi VSDetan egoera irekia modu kooperatiboan gertatzen dela jakina da; hala ere, azpian dauden mekanismoei buruz ezer gutxi dakigu.Subunitateen arteko interfazeek funtsezko zeregina dute prozesu alosterikoetan; hala ere, horrelako interfazeak ez dira identifikatu Hv1 kanal irekietan. Hemen frogatzen dugu 2-guanidinotiazol deribatuek bi Hv1 VSD modu kooperatiboan blokeatzen dituztela eta konposatu horietako bat azpiunitate irekien arteko akoplamendu alosterikorako zunda gisa erabiltzen dutela. VSD-ren lehenengo transmintz zatiaren amaierak subunitateen arteko interfazea osatzen du, lotze guneen arteko akoplamendua bideratzen duena, eta bobinaren domeinuak ez du prozesu honetan zuzenean parte hartzen. Kanalaren protoi-selektiboaren iragazkiak blokeatzaileen arteko elkarlana kontrolatzen duela ere frogatu dugu. . Tentsio bidezko protoi-kanalek zeregin garrantzitsuak betetzen dituzte hainbat organismotan, fitoplanktonetik hasi eta gizakietara1.Zelula gehienetan, kanal hauek protoi-mintzetik protoi-efluxua bideratzen dute eta NADPH oxidasaren aktibitatea erregulatzen dute.Gizakietan tentsio-egoeran dagoen protoi-kanal bakarra ezagutzen da. Hv1 da, HVCN1 genearen produktua dena2,3.Hv1 (aka VSOP) B zelulen ugalketan4, berezko immunitate-sistemaren oxigeno-espezie erreaktiboak ekoiztea5,6,7,8, espermatozoideak 5,6,7,8. mugikortasuna9 eta arnasbideen gainazaleko fluidoaren pH erregulazioa10. Kanal honek hainbat minbizi-motatan parte hartzen du, hala nola, B zelulen gaiztoak4,11 eta bularreko eta kolore-ektaleko minbiziak12,13.Hv1 aktibitate gehiegizkoak minbizi-zelulen potentzial metastasia handitzen duela aurkitu zen 11, 12. Garunean, Hv1 adierazten da. mikrogliaren bidez, eta haren jarduerak garuneko kaltea areagotzen duela frogatu da trazu iskemikoaren ereduetan. Hv1 proteinak tentsio-sentsoreko domeinua (VSD) dauka, S1-tik S414ra deitzen diren lau transmintz-segmentuz osatua. VSDak tentsioko Na+, K+ eta Ca2+ kanalen eta tentsio-sentikorreko fosfatasen domeinuen antza du, hala nola CiVSP-tik. Ciona gutis15.Beste proteina hauetan, S4-ren C-muturra modulu efektore bati lotuta dago, poro-domeinu edo entzimarekin.Hv1-en, S4 mintzaren alde zitoplasmatikoan kokatuta dagoen bobina-bobina domeinuari (CCD) lotuta dago. .Kanala bi VSDz osatutako dimeriko konplexu bat da, bakoitzak protoiaren iragazpen-bide itxi bat dauka16,17,18. Bi Hv1 azpiunitate hauek kooperatiboki irekitzen aurkitu ziren19,20,21,22, akoplamendu alosterikoak eta azpiunitateen arteko elkarrekintzak jokatzen dutela iradokitzen du. rol garrantzitsua ate-prozesuan.Haribildutako bobinaren domeinuko azpiunitateen arteko interfazea ondo definituta dago, isolatutako bi domeinuen kristal-egiturak eskuragarri daudelako22,23.Bestalde, mintzaren barneko VSDen arteko interfazea ez da. ondo ulertuta.Hv1-CiVSP proteina kimerikoaren kristal-egiturak ez du interfaze honi buruzko informaziorik ematen, kristalizatutako kanal-konplexuaren antolakuntza trimerikoa izan baitaiteke Hv1 CCD jatorrizkoa GCN424 legamia leuzina kremailerarekin ordezkatzearen ondorioz. Hv1 kanalaren azpiunitate-antolaketari buruzko azken azterketa batek ondorioztatu zuen bi S4 helizeak CCDra igarotzen direla bigarren mailako egitura eten gabe, mintzetik abiatzen diren eta zitoplasman proiektatzen diren helize luzeak eraginez. ikerketa honek proposatzen du Hv1 VSDak elkarrekin harremanetan jartzea S4 segmentuan zehar. Hala ere, beste ikerketek VSDen arteko interfaze alternatiboak proposatu dituzte. Interfaze hauek S1 segmentuak 17, 21, 26 eta S2 segmentuaren kanpoko muturrak 21. gatazkaren arrazoi posible bat dira. Ikerketa horien emaitzek VSDen arteko akoplamendu alosterikoa aztertu zuten gating-prozesuari dagokionez, zeina egoera itxi eta irekien araberakoa dena, eta VSDen arteko interfazea konformazio-egoera-aldaketa desberdinetan alda daiteke. Hemen, 2-guanidinotiazolak Hv1 kanalak inhibitzen dituela ikusi genuen bi VSD irekiekin sinergikoki lotuz, eta konposatuetako bat erabili zuen, 2-guanidinobenzotiazolak (GBTA), egoera irekian dauden azpiunitateen arteko elkarrekintza aztertzeko. interfazea. Aurkitu dugu GBTA lotura-kurba ondo deskriba daitekeela eredu kuantitatibo baten bidez, non inhibitzaile bat azpiunitate bati lotzeak ondoko azpiunitatearen lotura-afinitatea handitzea eragiten duela. Gainera, D112 hondakinak, selektibitate-iragazkiak direla ikusi dugu. 27, 28 kanalak eta guanidina deribatuen lotze gunearen zati batek 29 kontrolatzen dute GBTA lotzeko kooperatibitatea. Hv1 dimeroan lotura kooperatiboa mantentzen dela erakusten dugu, non CCD-a S4 segmentutik bereizten den, CCD-ko subunitateen arteko interfazeak zuzenean ez duela iradokiz. GBTA lotzeko guneen arteko akoplamendu alosterikoaren bitartekaritza. Aitzitik, S1 zatia azpiunitateen arteko interfazearen parte dela aurkitzen dugu eta ondoko VSDen antolamendua proposatzen dugu, S4 helizearen zelulaz kanpoko muturra dimeroaren erditik urrunduz. S1 zatia egoera irekian egotea. Hv1-en molekula txikiko inhibitzaileak minbiziaren aurkako sendagai eta agente neurobabesle gisa erabilgarriak dira. Hala ere, orain arte, konposatu gutxik izan dute kanala inhibitzeko gai30,31,32,33.Haien artean, 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, konposatua [1] irudian). 1a) eta bere deribatuek VSD29,32 protoien iragazpena blokeatzen dutela aurkitu zuten.Horrelako konposatuen lotura modu independentean gertatzen dela uste da bi azpiunitate irekietan. Aurretik Hv1 inhibitzen zuela frogatu zen 2GBI bezain eraginkorra 200 μM-ko kontzentrazioan probatzen denean (1b irudia). Beste tiazol deribatu batzuk aztertu genituen eta haietako batzuek GBTA baino potentzia antzeko edo handiagoarekin kanala inhibitzen zutela ikusi genuen (1. irudia eta osagarria). testua).Lau tiazol deribaturen (GBTA eta konposatuak [3], [6] eta [11], 1c. irudia) kontzentrazio-erantzun-kurbak zehaztu ditugu eta 2GBIrenak baino maldatsuagoak zirela ikusi dugu.Hill koefizienteak (h) tiazolaren deribatuak 1,109 ± 0,040 eta 1,306 ± 0,033 bitartekoak ziren (Irudia. 1c eta 1. irudi osagarria).Aitzitik, 2GBIrako Hill koefizientea 0,975 ± 0,024 29 izan zen, 2a irudia eta 1. irudi osagarria).Hill koefizienteak 1etik gorako lotura-kooperitatea adierazten du.Hv1 azpiunitate bakoitzak bere inhibitzailea duelako- lotura gunea,29,32 arrazoitu genuen tiazol deribatu bat azpiunitate bati lotzeak bigarren molekula inhibitzaile baten ondoko azpiunitatearekin lotzea hobetu zezakeela.GBTA izan zen Hill koefiziente handiena zuen proba-konposatua. Horregatik, konposatu hau aukeratu genuen. gehiago aztertu lotzeko sinergiaren mekanismoa eta 2GBI erabili zuen erreferentzia kontrol negatibo gisa. (a) Proba-konposatuak: [1] Erreferentzia Hv1 inhibitzailea 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il) guanidina, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidina, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [7] famotidina, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboxiliko azido etil ester, [9] 2-guanidino-4-metil etil-1,3-tiazol-5-karboxilato, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil azetatoa, [11]1-[4-(4 -Klorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina .(b) Gizakiaren Hv1 jardueraren inhibizioa adierazitako guanidinotiazolek eta 2GBI erreferentziazko konposatuaren bidez (barra urdin-berdeak) .Hv1 protoi-korronteak Xenopus obozitoen barrutik kanpoko plaketan neurtu ziren -80 mV-tik +120 mV-ko euste-potentzial batetik despolarizazioari erantzunez.Inhibitzaile bakoitza 200 μM-ko kontzentrazioan gehitu zen.pHi = pHo = 6,0. .Datuak batez bestekoa ± SEM (n≥4) dira.(c) [2], [3], [6] eta [11] konposatuen bidez gizakiaren Hv1 kontzentrazio-menpeko inhibizioa. Puntu bakoitzak 3-ren batez besteko inhibizioa ± SD adierazten du. 15 neurketara. Lerroa 1. taula osagarrian adierazitako itxurazko Kd balioak lortzeko erabiltzen den Hill doikuntza da. Hill koefizienteak 1. irudi osagarrian adierazitako doikuntzetatik zehaztu ziren: h (1) = 0,975 ± 0,024 h (2) = 1,306 ± 0,024 0,033, h (3) = 1,25 ± 0,07, h (6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (ikus Metodoak). (a,b) 2GBI eta GBTA konposatuek Hv1 dimerikoa eta monomerikoa inhibitu zuten kontzentrazio-menpeko moduan. Puntu bakoitzak 3 eta 8 neurketen batez besteko inhibizioa ± SD adierazten du eta kurba Hill fit bat da. Hill koefizienteak (h) atalean erakusten dira. txertatutako histogramak 3. eta 4. irudi osagarrietan adierazitako doikuntzetatik zehaztu ziren. (a)-n agertzen den GBTAren kontzentrazio-erantzuna 1c irudikoaren berdina da.Ikus 1. taula osagarria itxurazko Kd balioetarako. (c) Modelizazioa. GBTA-ren lotura kooperatiboa Hv1 dimerikoarekin.Marra beltz solidoak datu esperimentaletarako egokitzapena adierazten du (6) ekuazioaren bidez, zeinak (d) erakusten duen lotura-eredua deskribatzen duena. Sub 1 eta Sub 2 etiketatutako lerro etenek elkarketa bimolekularra adierazten dute. -Lehenengo eta bigarren lotura-gertakarien disoziazio-oreka-kurbak, hurrenez hurren (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Hv1 blokearen proposatutako mekanismoaren diagrama eskematikoa.GBTAren kasuan, azpiunitate ireki bati lotzeak ondoko azpiunitate irekiaren afinitatea handitzen du (Kd2 0,05) Hill koefizientearen jaitsiera GGG kanalekin alderatuta (5c. irudia), iradokitzen du. bi azpiunitate elkarrekin garrantzitsuak, baina CCD-k ez du zuzenean bitartekaritza subunitateen arteko akoplamendu alosterikoa GBTA lotura guneen artean. (a) S4-ren barruko muturrean triglizina mutazio bat duen Hv1 dimeroaren diagrama eskematikoa bobina zitoplasmatikoen domeinuaren bitarteko subunitateen arteko akoplamendua hausteko diseinatuta (gezi urdinak). adierazitako mutazioak, azpiunitateen arteko akoplamenduan parte hartzen duten S1 zatiak probatzeko diseinatuta (gezi urdinak).(c–h) 2GBI (ziana) eta GBTA (gorri iluna) adierazitako konstrukzioak inhibitzen dituzte kontzentrazio-menpeko moduan. Puntu bakoitzak batez besteko inhibizioa adierazten du. ± SD 3 eta 10 neurketa. Kurba itxurazko Kd balioak lortzeko erabilitako Hill doikuntza izan zen (ikus 1. Taula osagarria). Histogrametan interpolatutako Hill koefizienteak Metodoak atalean deskribatutako moduan zehaztu ziren (ikus 3. eta 4. irudi osagarriak). Erreferentzia h balioak. Hv1 WT lerro eten gisa agertzen dira. Izartxoek mutanteen eta WT pasarteen arteko alde estatistiko esanguratsuak adierazten dituzte (p 0,05, 5d,i irud.) ). Bestalde, D123A mutazioak GBTAren Hill koefizientea nabarmen murriztu zuen (p 0,05/14). Bi azpiunitateetako 123. posizioan karga neutralizatzeak GBTA lotesleen kooperatibitatean aldaketa handia eragin zuenez, bi azpiunitateetako karga alderantzikatzeak eragin txikia izan zuen bitartean, analisia kargaren inbertsio-kanalarekin azpiunitate bakarra barne hartzeko zabaldu genuen. C-terminaleko azpiunitatean D123R ordezkapenarekin Hv1-loturiko dimeroak sortu zituen (5b. irudia) eta GBTA eta 2GBIren kontzentrazio-erantzunaren inhibizioa neurtu zuten. GBTAren Hill koefizientea WT-D123R kanalekin lotzeko Hill koefizientea hori baino nabarmen handiagoa zela ikusi genuen. Hv1 basatiaren (p 0,05). βME-rik ezean, D112E I127C Hv1 dimeroarekin lotzen den GBTAren Hill koefizientea agente erreduktoreen aurrean neurtutakoa baino nabarmen handiagoa zela (6e irudia eta 4. irudi osagarria), D112E mutazioa esan nahi du. ez zuen 127 zisteinaren gurutzaketaren ondoriozko GBTA lotespen-kooperatibitatearen hazkundea deuseztatu. 2GBI lotzearen Hill koefizientea D112E, I127C Hv1 dimeroekin ere ez zen D112E mutazioaren eragin handirik izan (1. irudia).6d eta osagarriak. 3. irudia). Batera hartuta, aurkikuntza hauek iradokitzen dute GBTAren lotura S1 zatien kanpoko muturren arteko elkarreraginaren ondorioz, ondoko Hv1 azpiunitateetan elkarrekintza elektrostatiko erakargarrien bidez edo ordezkatutako zisteinen arteko lotura kobalenteen eraketaren bidez, guneen arteko akoplamendu alosterikoa areagotu egiten da eta lotura-kooperatibitatea eragiten du. Elkarreragin elektrostatiko erakargarriek kooperatibitatean duten eragina D112E mutazioaren bidez ezabatu daitekeen arren, lotura kobalenteen eragina ezin da. Guanidina deribatuak Hv1 kanaletara lotzeko dagoen espazio kimikoa aztertzean, GBTA bezalako 2-guanidinotiazolek 2-guanidinobenzimidazolek baino kontzentrazio menpekotasun handiagoa dutela ikusi dugu (1c. irudia). eta kanal monomerikoak (2a,b. irud.) eta azpiunitate bat inhibitzaileari aurrez lotuta zegoen kanal dimerikoari (4. irudia) GBTAren Hv1 inhibizioa Ekintza prozesu sinergiko bat dela ondorioztatzera eraman gaitu. bi azpiunitateetako konposatuen lotze-guneak alosterikoki akoplatuta daude.GBTA kanal irekiarekin lotzen den aurkikuntzak, aurrez erlazionatutako 2GBI32 konposatuarentzat erakutsi bezala, iradokitzen du akoplamendu alosterikoa egoera irekian berariaz ebaluatu daitekeela.Gure lotura-eredu kooperatiboa. GBA-k HV1-en inhibitzea kuantitatiboki deskribatzeko gai izan zen (2C. irudia) eta 2GBIren eta GBTAren eragin desberdinak azaltzen ditu kanalaren isats korronteen gainbehera mintz-erreprodukzioaren ondoren, lotzeko prozesuaren interpretazioa onartzen duena. Bi gune lotesleekin (adibidez, HV1) proteina alosteriko batean lor daitekeen gehienezko mendiaren koefizientea da. GBTA neurtu da HV1 mota 1,31 koefiziente batekin, eta 1,88 igo da HV1 i127c-n. Energia aske sinergikoa, afinitate txikieneko eta altuenen energia askeak lotesleen arteko aldea (ikus metodoak), 1,3 kcal / mole izan zen HV1 Wild motako eta 2,7 kcal / mole, HV1 i127c.-ren kasuan, Lotura Oxigenoa hemoglobinarentzat lankidetza prozesuaren adibide ospetsuena eta ondo aztertutako adibidea da. KCAL / MOL, baldintza esperimentalen arabera38.Horen arabera, energetiko globalei dagokienez, GBTA-ko kooperatibitatea HV1-ri lotesleak ez dira funtsezkoak 3 hemoglobinarekin lotesleak. Gure sinergiako ereduan, GBTA molekulen azpimultzo batek azpimultzoen arteko lotura areagotzen du aldameneko azpimultzoen afinitateari dagokionez. Gertaketa bat egiteko prozesua berrantolatzeko (induzitu gabeko gertaera) sortutako ingurune loteslea berrantolatzeko Aldaketa horien arteko elkarreraginen aldaketek aldaketak aldatzen dituzte aldaketei erantzuteko. aldez aurretik HV1 protoi-penadaren bidearen parte dela erakutsi zen eta selektibitatearen iragazkia27,28 bezala jarduteko. Gure emaitzek IKERAko bi azpiko biztanleen iragazkiek erakusten dute. Figure 7a-k GBTA Loturako gunea gutxi gorabeherako kokapena erakusten du eta D112, D123, K125 eta I127 hondakinen kokapena HV1 VSD-ren oinarritutako eskematikoan HV1-CivSP Chimera-ren kristal egituran. S1 extracellular muturra sartuta dagoen akoplamendu alosterikoetarako jarraibideak jarri dira geziak beltzez. (a) HV1 VSD.-ren eskema HV1-Civsp Chimera-ren kristal egituran, segmentu helikalak zilindrikoak direla erakusten da. Konfigurazio hau da, S4 segmentuaren barnealdea CCDarekin bat egiten da (ez da erakusten). GBTA lotzen duten grafikoen aurreikusitako kokapenak, ondoko bi azpi-azpiataletan dauden akoplamendu alosterikoetan parte hartzen duten bideak adierazten dira. Ikertutako S1 hondakinen posizioak koloretako esparruekin markatuta daude. (B) HV1 azpitaldeen ilustrazio eskema Ezkerreko panelaren bi dimer-konfigurazio desberdinetan. Ezkerreko panela ikusita, Dimer interfazea S4 helix.Rotation-ek osatzen du bi VSDS 20 graduko erloju erlojuaren erlojuaren arabera mintz-hegazkinaren perpendikularraren inguruan. Bi S4 helburuen kanpoaldeko muturrak (marradun geziak) bereiztea, eskuineko moduan agertzen da. Konfigurazio hau, D123 eta I127 hondakinak ondoko azpiataletatik elkartzea da. (C) CivSP VSD-ren irudikapen eskematikoa 4G80 Crystal Egituran aurkitutako dimerraren konfigurazioan. P140 P140-n D123 posizioari dagokio HV1-n. Emaitzak erakusten du 123 (123D / 123D edo 123r / 123r hondakinen arteko elkarreragin elektrostatiko errejulazioa GBTA / 123R / 123r-en arteko lotura "normalarekin" lotuta egotea egoera irekian eta elkarrekintza errepresentaziotik erakarriz (123d / 123r) , lankidetza areagotzea (5G. irudia). Espero da alanine ordezkapenarekin elkarreraginik gabeko elkarreragina kentzeak kooperatibitatea areagotzea ekarriko lukeela. Hala ere, 123a / 123a dimerraren kooperatibitatearen beherakada (5. irudia). Ahal da. posible da. Azalpena zera da: D123 hondakinen arteko hidrofoboen hondamendiak egiteak eragindako efektu egonkortzaileak iraun dezakeela. CIONA GUTIS CI-HV1-ren D171 posizioa (D123-ri dagokion Giza HV1-ri dagokiona) aktibatuta dago, D123 egoera irekiko ingurune hidrofiliko batean kokatuta dagoen nozioa onartzen du. IGV1 kanalen gatina da trantsizio anitzen bidez gertatzen dela19,20,26,39,40,41.Qiu ET Al26-k mintz depolarizazioan aurkitu zuenean, CI-HV1-ren tentsio-sentsoreak aldaketaren bat egiten du kanala aktibatuta uzten duen baina oraindik itxita , ondoren, protoak bi azpiataletan eroankorra irekitzea eragiten duen trantsizio bereizgarria da. Tentsio-sentsorearen aldaketa konformazionala tentsio-pinza fluoreszentziaren bidez kontrolatu zen, eta bigarren trantsizioa Mutazioaren arabera irudia hauteman zen D171 posizioan selektiboa izan zela. Seinale fluoreszentearen perturbazioa bat dator aldaketaren araberako D171 hondakinen arteko interakzio elekturstatikoen presentziarekin, aldaketaren araberako erreakzioen koordenadek. eta Gbta lotzeko guneen arteko akoplamendu alosterikoa medikatzen du. Fujiwara eta Al25-ek proposatu zuen cytoplasmiko-bobina domeinuaren interfaze dimeroak mintzara hedatzen direla bi S4 helic-a edukitzeko (7b. Irudia, ezkerreko panela). Intersubunit interakzio honen eredua Cysteine ​​Cross-Lotura azterketan oinarritzen da S4 helize eta CCD.in eskualdearen azterketa funtzional osoa Transmembrane PH gradiente baten faltan, HV1 kanalek mintz depolarizazio handia behar dute irekitzeko, eta Cysteine ​​Croslinking kanala nagusiki itxita dagoen baldintzetan gertatzen da. Hori dela eta, detektatutako S4-S4 interfazeak estatuko azpikonponazio konfigurazioa islatzen du. Beste ikerketek aurkitu dute S1 eta S2 intersubunit interakzioetan interakzioan interakzioan inplikatzeko. Gating17,21,26-k iradokiz gero, kanalek azpi-konfigurazio ezberdinak har ditzakete irekita eta Itxitako estatuak, ideia bat koherente da, Mony et al-en aurkikuntzekin. S1ek 39 mugitzen ditu gatinean zehar. Hemen, S1 helizearen muturreko muturrak nahikoa hurbil daude S1 Helix-en lotura elektrostatiko zuzenak babesteko azpimultzoen arteko lotura altersatikoa bitartekatzen duten zuzeneko interakzioak laguntzeko. Elkarrengandik bereizteko zuzenean elkarreragiteko. Membrane hegazkinaren araberako bi VSD azpitaldearen inguruan, 20 ° erloju erloju-erloju erloju-erloju erloju-erloju-erlojuaren inguruan, bi S4 helburuen kanpoko muturrak bereizteko konbinatuta, S1-S1 konfigurazio koherentea izan da. Gure aurkikuntzekin (7b irudia, eskuineko panela). Konfigurazio hau gomendatzen dugu kanalerako Estatu Irekian. CivSP entzima monomero gisa funtzionatzea pentsatzen den arren, bere VSD isolatuaren egitura dimer estatu batean harrapatzen da. Dimer honetako S1 helbursen kanpoko muturrak oso gertu daude, eta konfigurazio orokorra proposatutako antzekoa da HV1-rako (7C. irudia). eta CivSP dimers-ek iradokitzen du proteina horien VSDek interfaze bat osatzeko berezko joera izatea S1-en muturreko muturrak elkarreragiten dituztela. Espero-zelulen aktibazioan HV1-ren funtsezko eginkizuna da. Jarraian, Microgliako HV1-en HV1 aktibatzea erakutsi da Microglian. HV1 jarduera txikiagoa izan dela erakutsi da. 1 bularreko minbizia edo koloreko minbizia duten pazienteetan biziraupena da. HV1-k zuzendutako Molekula txikien drogak egiten ditu. Horregatik, eragile neuroprotektiboak edo anticancer terapeutiko gisa erabil daitezke. Aurkikuntzak Guanidinothias deribatiboek adostasun-berrantolamenduak eragin ditzakete Open HV1 azpiatala, afinitate loteslea areagotzeak, HV1 kanaletara zuzendutako droga potentzialagoak garatzea ekar dezake. Giza HV1-eko mutagenesia zuzendutakoa da. HV1NCCIVSP eraikuntza estandarra erabiliz egin zen. Subunit baten C-Terminus bigarren azpitaldearen N-Termino-rekin lotuta dago GGSGGSGGSGSGGGGGG-ren bidez. Pgemhe plasmidak, hainbat eraikuntza barne, NHE1 edo SPH1 murrizketa entzimarekin (New England Biolabs) eta RNA sintesia egin ziren T7 MMASAGE MMACHINE transkripzio-kit (anbioa). Neurri elektrofisiologikoak baino lehen, CRNA Xenopus ookituetan injektatu zen (zelula bakoitzeko 50 nl, 0,3-1,5 μg / μl). Venopus laevis (NASCO) Ecocyte Bioscience-tik. Jarraitu RNA injekzioan, 96 mm-ko NACL, 2 mm kcl, 1,8 mm kcl, 1 mm mg mgcl, 10 mm-ko hepa, 100 μg / ml gentamicin, ph 7μg / ml gentamicin, ph 7μg 18 ° . 2-Guanidino-Benzimidazole [1], 2-Guanidino-benzotiazole [2], (4-metil-1,3-thiazol-2-yl) Guanidine [5], (5 Bromo-4 -methyl-1,3 -hiazol-2 yl) Guanidine) [6], Ethyl 2-Guanidino-5-methyl-1,3-tiazole-4-carboxylate [8], Etil 2-Guanidino-4- methyl-1,3-tiazole- 5-CarBoxylate [9] eta (2-Guanidino-4-methyl-1,3-tiazol-5 yl) etil azetatoa [10] Sigma-Aldrich-enak ziren. [7] MP Biomedicals-ena zen.1- [4 - (4-klorofenil) -1,3-tiazol-2-yl] Guanidine [11] eta 1- [4- (3,4-dimetoxyphenyl) -1,3- thiazol-2-yl] Guanidine [12] Matrix Scientific-etik konposatuak eskuragarri daude. gutxienez% 99 garbitasuna. 2 amino-4- (Trifluoromethyl) benzenethiol hidrokloruroa (1,5 g, 4,5 mm) etetea (azido hidrokloriko urriaren 25 ml) gehitu da dicyandiamida solidoa (380 mg, 4,5 mmol), eta emaitza heterogeneoa sortu zen 4 orduz irabiatuz erretratu zen. 65 ° C) zenbait orduz, eta gero berriro birziklatu azetato etiletik / petrolio eter batetik solido zuri bat emateko (500 mg,% 48); MP 221-222 ° C (225-226 ° C-ko argia) 45; 1h nmr (500 mhz, dmso-d6): δ [PPM] = 7,25 (oso zabalak s, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (D , 1 h, j = 8.1 hz) .13c nmr (200 mhz, dmso-d6): δ = 114,2 (d, j = 3,5 hz), 117,5 (D, j = 3,5 hz), 121.7, 124,6 (q, j = 272 Hz), 126,1 (Q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,4,1,4, 152,1,1,4, 152,1,1,1,1,4, 152,1, 175.5.5.5.5.5.AZ-CALTARIOA (M + H) +: 261.0416 +: 261.0416, aurkitu da : 261.0419. Naftokuntza [1,2-D] Thiazol-2-Amina (300 mg, 1,5 mmol), aurrez deskribatu bezala sintetizatuta, 200 ºC-ko berotu zen petrolio bainu batean proba txikiko hodi batean (gehiegizkoa) zianamida txiki batean 1,0 ml Conc.to azido hotdroklorikoa azkar gehitu zen eta nahasketa olio-bainuan mantendu zen 2 minutuz, eta denbora horretan ur gehienak lurruntzen ziren. Erreakzio nahasketa hoztu egin zen giro-tenperaturara eta ondorioz sortutako material solidifikatua pieza txikietan zatitu eta urarekin garbitu zen solido amorfo zurbil bat emateko. (38 mg,% 10) MP 246-250 ° C MP; 1h nmr (500 mhz, dmso-d6, d2o): δ [PPM] = 7,59 (T, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (T, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h , J = 8,6 hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 hz) .13C NMR (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122.7, 123,7, 123,6, 123,6, 126,6, 127,1, 127,1, 126,1, 127,1, 127,7, 127,7, 127,7, 128,7, 127,7, 127,7, 129,7, 129,7, 129,7, 129.1.AZ-C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , aurkitutakoak: 243.0704. Protoi korronteak eraikuntza desberdinak adierazten zituzten Axonatch 200B anplifikadorearen barneko eta kanpoko adabakietan, Axon DigiData 1440A-k (gailu molekularrak) Pclamp10 softwarearekin kontrolatuta. Eraikuntza eta kanpoko irtenbideak konposizio bera dute: 100 mm 2- (N-Morfolino) ) azido etanesulfonikoa (MES), 30 mm-ko tetraethylammonium (te) mesilatoa, 5 mm-ko tea kloruroa, 5 mm Etileno glikola-bis (2 aminoethyl) -n, n, n ', n'-tetraacetic azido (EGTA), egokitua PH 6.0 tea hidroxidoa. Neurketak 22 ºC 2 ºC-tan egin ziren. ) eta jatorria8.1 (OriginLab). HV1 inhibitzailearen hainbat kontzentrazio dituzten soluzioak eta zenbait kasutan, grabitatearen arabera sartu ziren, VC-6 perfusio-balbularen sistemarekin (Warner Instr.), Pclamp Software TTL (Transistor-) gainditu zen. Transistore logika) Seinaleak.rapid perfusio esperimentuak egin ziren hodi anitzeko perfusio arkatza erabiliz (SCI automatizatua) 360 μm-ko diametroa entregatzeko punta batekin adabaki pipeta baten aurrean muntatuta .Channel inhibizioa isokronikoko neurketa amperometrikoen bidez zehaztu zen amaieran +120 MV Pulse.GV neurketak aurretik deskribatu ziren18,20.18.10.tail-korronteak -40 mv-tan erregistratu ziren -40 MV-tan, tentsio desberdinetan -20 MV-tik +120 MV-tik bestela adierazi ezean. Proba pultsua da. Egungo desintegraziorako 18. GV grafikoetarako zuzentzeko erabiltzen da. Kanal eta inhibitzaileen konbinazio desberdinetarako (KD) itxurazko disoziazio konstanteak (KD) (1. taula osagarria) zehaztu ziren inhibizioaren menpekotasuna (batez besteko inhib balioak) Mendi-ekuazioarekin: nora [i] nik eta h inhibitzailearen kontzentrazioa da muinoko koefizientea. Hill koefizientea kalkulatzeko, ekuazioa (2) berrantolatu da: