Avoimen Hv1-protonikanavan alayksiköiden välisen rajapinnan kysely allosteerisesti kytketyllä koettimella

Kiitos vierailustasi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee rajoitetusti CSS:ää. Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan Internet Explorerista). Sillä välin varmistaaksesi jatkuva tuki, näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä. Hv1-jänniteportti protonikanava on dimeerinen kompleksi, joka koostuu kahdesta jännitteentunnistusalueesta (VSD), joista kukin sisältää avainnetun protoniläpäisyreitin. Dimerisaatiota ohjaa sytoplasman kierrekeladomeeni. Siirtyminen suljetusta tilasta avoimen tilan molemmissa VSD:issä tiedetään esiintyvän yhteistoiminnallisesti; taustalla olevista mekanismeista tiedetään kuitenkin vähän. Alayksiköiden välisillä rajapinnoilla on keskeinen rooli allosteerisissa prosesseissa; tällaisia ​​rajapintoja ei kuitenkaan ole tunnistettu avoimissa Hv1-kanavissa. Tässä osoitamme, että 2-guanidinotiatsolijohdannaiset estävät kaksi Hv1 VSD:tä yhteistoiminnallisesti ja käyttävät yhtä näistä yhdisteistä koettimena allosteeriselle kytkennälle avoimien alayksiköiden välillä. Havaitsimme, että solunulkoinen solu VSD:n ensimmäisen transmembraanifragmentin loppu muodostaa alayksiköiden välisen rajapinnan, joka välittää sitoutumiskohtien välistä kytkentää, kun taas käämitysalue ei ole suoraan mukana tässä prosessissa. Löysimme myös vahvaa näyttöä siitä, että kanavan protoniselektiivinen suodatin ohjaa salpaajaa sitovaa yhteistoimintaa . Jänniteohjatuilla protonikanavilla on tärkeä rooli monissa organismeissa, kasviplanktonista ihmisiin1.Useimmissa soluissa nämä kanavat välittävät protonien ulosvirtausta protonikalvosta ja säätelevät NADPH-oksidaasin aktiivisuutta. Ainoa tunnettu jänniteohjattu protonikanava ihmisissä on Hv1, joka on HVCN1-geenin tuote2,3.Hv1:llä (alias VSOP) on osoitettu olevan rooli B-solujen lisääntymisessä4, synnynnäisen immuunijärjestelmän reaktiivisten happilajien tuotannossa5,6,7,8, siittiösolussa. hengitysteiden pintanesteen motiliteetti9 ja pH:n säätely10. Tämä kanava on osallisena useissa Yli-ilmentyneissä syöpätyypeissä, kuten B-solujen pahanlaatuisissa kasvaimissa4,11 sekä rinta- ja paksusuolensyövissä12,13.Liikallisen Hv1-aktiivisuuden havaittiin lisäävän syöpäsolujen metastaattista potentiaalia 11, 12. Aivoissa Hv1 ekspressoituu mikroglia, ja sen toiminnan on osoitettu pahentavan aivovaurioita iskeemisen aivohalvauksen malleissa. Hv1-proteiini sisältää jännitteen tunnistavan domeenin (VSD), joka koostuu neljästä transmembraanisegmentistä, joita kutsutaan nimellä S1 - S414. VSD muistuttaa vastaavia jänniteohjattujen Na+-, K+- ja Ca2+-kanavien ja jänniteherkkien fosfataasien domeeneja, kuten CiVSP:tä. Ciona gutis15.Näissä muissa proteiineissa S4:n C-pää on kiinnittynyt efektorimoduuliin, huokosdomeeniin tai entsyymiin. Hv1:ssä S4 on kytketty kalvon sytoplasmisella puolella sijaitsevaan coiled-coil-domeeniin (CCD). Kanava on dimeerinen kompleksi, joka koostuu kahdesta VSD:stä, joista kumpikin sisältää aidatun protoniläpäisyreitin16, 17, 18. Näiden kahden Hv1-alayksikön havaittiin avautuvan yhteistyössä19, 20, 21, 22, mikä viittaa siihen, että allosteerinen kytkentä ja alayksiköiden välinen vuorovaikutus toimivat tärkeä rooli avainnusprosessissa. Aliyksiköiden välinen rajapinta kelatun käämialueen sisällä on hyvin määritelty, koska kahden eristetyn domeenin kiderakenteet ovat käytettävissä22, 23. Toisaalta kalvon sisällä olevien VSD:iden välinen rajapinta ei ole Kimeerisen Hv1-CiVSP-proteiinin kiderakenne ei anna tietoa tästä rajapinnasta, koska kiteytyneen kanavakompleksin trimeerinen organisaatio voi johtua natiivi Hv1 CCD:n korvaamisesta hiivan leusiinivetoketjulla GCN424. Hiljattain tehty tutkimus Hv1-kanavan alayksikköorganisaatiosta päätteli, että kaksi S4-kierukkaa siirtyy CCD:hen ilman vakavaa sekundaarirakenteen häiriötä, mikä johtaa pitkiin kierteisiin, jotka alkavat kalvosta ja työntyvät sytoplasmaan.Kysteiinin silloitusanalyysin perusteella, tässä tutkimuksessa ehdotetaan, että Hv1 VSD:t ovat yhteydessä toisiinsa pitkin S4-segmenttiä. Muut tutkimukset ovat kuitenkin ehdottaneet vaihtoehtoisia rajapintoja VSD:iden välillä. Näihin rajapintoihin kuuluvat S1-segmentit 17, 21, 26 ja S2-segmentin 21 ulkopäät. Mahdollinen syy ristiriitaisuuteen. Näiden tutkimusten tuloksena on, että VSD:iden välistä allosteerista kytkentää tarkasteltiin suhteessa avainnusprosessiin, joka riippuu suljetusta ja avoimesta tilasta, ja VSD:iden välinen rajapinta voi vaihdella konformaation eri tilamuutoksissa. Tässä havaitsimme, että 2-guanidinotiatsoli estää Hv1-kanavia sitoutumalla synergistisesti kahteen avoimeen VSD:hen, ja käytimme yhtä yhdisteistä, 2-guanidinobentsotiatsolia (GBTA), tutkimaan vuorovaikutusta alayksiköiden välillä avoimessa tilassa. Havaitsimme, että GBTA-sitoutumiskäyrä voidaan kuvata hyvin kvantitatiivisella mallilla, jossa inhibiittorin sitoutuminen yhteen alayksikköön johtaa viereisen alayksikön sitoutumisaffiniteetin lisääntymiseen. Havaitsimme myös, että tähteet D112, selektiivisyyssuodattimet kanava 27, 28 ja osa guanidiinijohdannaisen sitoutumiskohdasta 29 säätelevät GBTA:n sitoutumista. Osoitamme, että yhteistoiminnallinen sitoutuminen säilyy Hv1-dimeerissä, jossa CCD eroaa S4-segmentistä, mikä viittaa siihen, että CCD:n alayksiköiden välinen rajapinta ei ole suoraan yhteydessä välittää allosteerista kytkentää GBTA:ta sitovien kohtien välillä. Sitä vastoin havaitsemme, että S1-fragmentti on osa alayksiköiden välistä rajapintaa ja ehdotamme vierekkäisten VSD:iden järjestelyä siten, että S4-heliksin solunulkoinen pää on poispäin dimeerin keskustasta mahdollistaakseen S1-fragmentin olevan avoimessa tilassa. Hv1:n pienimolekyyliset inhibiittorit ovat käyttökelpoisia syöpälääkkeinä ja hermostoa suojaavina aineina. Tähän mennessä vain harvat yhdisteet ovat kuitenkin kyenneet estämään kanavaa30, 31, 32, 33. Niiden joukossa on 2-guanidinobentsimidatsoli (2GBI, yhdiste [1] kuvassa 1). 1a) ja sen johdannaisten havaittiin estävän protonien VSD29,32-läpäisyä kanavan läpi. Tällaisten yhdisteiden sitoutumisen uskotaan tapahtuvan itsenäisesti kahdessa avoimessa alayksikössä. 2-guanidinobentsotiatsoli (GBTA, yhdiste [2] kuvassa 1a) oli. joiden on aiemmin osoitettu inhiboivan Hv1:tä lähes yhtä tehokkaasti kuin 2GBI:ta testattaessa 200 μM:n pitoisuudella (kuva 1b). Tutkimme muita tiatsolijohdannaisia ​​ja havaitsimme, että jotkin niistä inhiboivat kanavaa samalla tai tehokkaammalla teholla kuin GBTA (kuva 1 ja täydennys). teksti).Määritimme neljän tiatsolijohdannaisen (GBTA ja yhdisteet [3], [6] ja [11], kuva 1c) pitoisuusvastekäyrät ja havaitsimme, että ne olivat jyrkempiä kuin 2GBI:n. Hill-kertoimet (h) tiatsolijohdannaisten määrä vaihteli välillä 1,109 ± 0,040 - 1,306 ± 0,033 (kuva 1). 1c ja täydentävä kuva 1). Sitä vastoin Hill-kerroin 2GBI:lle oli 0,975 ± 0,024 29, kuva 2a ja täydentävä kuva 1). Hill-kerroin, joka on yli 1, osoittaa sitoutumisyhteistyötä. Koska jokaisella Hv1-alayksiköllä on oma estäjä- sitoutumiskohta,29,32, päätimme, että tiatsolijohdannaisen sitoutuminen yhteen alayksikköön voisi tehostaa toisen inhibiittorimolekyylin sitoutumista viereiseen alayksikköön. GBTA oli testiyhdiste, jolla oli korkein Hill-kerroin. Siksi valitsimme tämän yhdisteen tutkii edelleen sitoutumissynergian mekanismia ja käytti 2GBI:tä vertailuna negatiivisena kontrollina. (a) Testiyhdisteet: [1] Vertailu-Hv1-estäjä 2-guanidinobentsimidatsoli (2GBI).[2] 2-guanidinobentsotiatsoli (GBTA), [3] (5-trifluorimetyyli-1,3-bentsotiatsol-2-yyli)guanidiini, [4]nafto[1,2-d][1,3]tiatsol-2-yyli -guanidiini, [5](4-metyyli-1,3-tiatsol-2-yyli)guanidiini, [6](5-bromi-4-metyyli-1,3-tiatsol-2-yyli)guanidiini, [7] famotidiini, [8] 2-guanidino-5-metyyli-1,3-tiatsoli-4-karboksyylihapon etyyliesteri, [9] 2-guanidino-4-metyylietyyli-1,3-tiatsoli-5-karboksylaatti, [10 ](2-guanidino-4-metyyli-1,3-tiatsol-5-yyli)etyyliasetaatti, [11]1-[4-(4-kloorifenyyli)-1,3-tiatsol-2-yyli]guanidiini, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenyyli)-1,3-tiatsol-2-yyli]guanidiini.(b) Ihmisen Hv1-aktiivisuuden esto osoitetuilla guanidinotiatsolilla ja vertailuyhdisteellä 2GBI (sinivihreät palkit) .Hv1-protonivirrat mitattiin Xenopus-oosyyttien sisältä ulospäin olevista plakeista vasteena depolarisaatiolle pitopotentiaalista -80 mV arvoon +120 mV. Kutakin inhibiittoria lisättiin hauteeseen pitoisuutena 200 µM.pHi = pHo = 6,0 .Tiedot ovat keskiarvo±SEM (n≥4).(c) Konsentraatiosta riippuvainen ihmisen Hv1:n esto yhdisteillä [2], [3], [6] ja [11]. Jokainen piste edustaa 3:n keskimääräistä estoa ± SD. 15 mittaukseen asti. Viiva on Hill-sovitus, jota käytetään lisätaulukossa 1 ilmoitettujen näennäisten Kd-arvojen saamiseksi. Hill-kertoimet määritettiin lisäkuvassa 1 raportoiduista sovituksista: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,024 h(2) 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (katso menetelmät). (a,b) Yhdisteet 2GBI ja GBTA estivät dimeeristä ja monomeeristä Hv1:tä pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Jokainen piste edustaa 3-8 mittauksen keskimääräistä estoa ± SD ja käyrä on Hill-sovitus. Hill-kertoimet (h) esitetään inset histogrammit määritettiin lisäkuvissa 3 ja 4 raportoiduista sovituksista. Kohdassa (a) esitetty GBTA:n pitoisuusvaste on sama kuin kuvassa 1c. Katso lisätaulukosta 1 näennäiset Kd-arvot.(c) GBTA:n yhteistoiminnallinen sitoutuminen dimeeriseen Hv1:een. Kiinteä musta viiva edustaa sopivuutta kokeellisiin tietoihin yhtälöllä (6), joka kuvaa kohdassa (d) esitettyä sitoutumismallia. Katkoviivat, jotka on merkitty Sub 1:llä ja Sub 2:lla, edustavat bimolekulaarista assosiaatiota - ensimmäisen ja toisen sitoutumistapahtuman dissosiaatiotasapainokäyrät, vastaavasti (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Ala 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Kaaviokaavio ehdotetusta Hv1-lohkon mekanismista. GBTA:n tapauksessa sitoutuminen yhteen avoimeen alayksikköön lisää viereisen avoimen alayksikön affiniteettia (Kd2 0,05) laskun GBTA:n GGG-kanaviin sitoutumisen Hill-kertoimessa villityyppiin verrattuna (kuvio 5c), mikä viittaa siihen, että huolimatta sen roolista GGG-kanaviin sitoutumisessa. kaksi alayksikköä yhdessä tärkeitä, mutta CCD ei välitä suoraan alayksiköiden välistä allosteerista kytkentää GBTA:n sitoutumiskohtien välillä. (a) Kaaviokaavio Hv1-dimeeristä, jossa on triglysiinimutaatio S4:n sisäpäässä, joka on suunniteltu katkaisemaan sytoplasman kierredomeenin välittämä alayksikköjen välinen kytkentä (siniset nuolet). (b) Kaavioesitys Hv1-dimeeristä ja ligaatiodimeeristä osoitetut mutaatiot, jotka on suunniteltu testaamaan alayksiköiden väliseen kytkentään osallistuvia S1-fragmentteja (siniset nuolet). (c–h) 2GBI (syaani) ja GBTA (tummanpunainen) estävät osoitettuja rakenteita pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Jokainen piste edustaa keskimääräistä estoa ± SD 3 - 10 mittausta. Käyrä oli Hill-sovitus, jota käytettiin näennäisten Kd-arvojen saamiseksi (katso lisätaulukko 1). Interpoloitujen histogrammien Hill-kertoimet määritettiin Menetelmät-osiossa kuvatulla tavalla (katso lisäkuvat 3 ja 4). Vertailuh-arvot Hv1 WT on esitetty katkoviivoina. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja mutanttien ja WT-siirrosten välillä (p 0,05, kuva 5d,i). ). Toisaalta mutaatio D123A vähensi merkittävästi GBTA:n Hill-kerrointa (p 0,05/14). Koska varauksen neutralointi kohdassa 123 molemmissa alayksiköissä johti vahvaan muutokseen GBTA:n sitoutumisyhteistoiminnassa, kun taas varauksen kääntämisellä molemmissa alayksiköissä oli vain pieni vaikutus, laajensimme analyysiä koskemaan vain yhtä alayksikköä, jossa oli varauksen inversiokanava. loi Hv1-kytkettyjä dimeerejä, joissa oli D123R-substituutio C-terminaalisessa alayksikössä (kuva 5b) ja mittasi GBTA:n ja 2GBI:n aiheuttaman konsentraatio-vasteen eston. Havaitsimme, että GBTA:n WT-D123R-kanaviin sitoutumisen Hill-kerroin oli merkittävästi suurempi kuin vastaava. villityypin Hv1 (p 0,05). Havaitsimme myös, että βME:n puuttuessa GBTA:n D112E I127C Hv1 -dimeeriin sitoutumisen Hill-kerroin oli merkittävästi korkeampi kuin pelkistimien läsnä ollessa mitattu (kuva 6e ja täydentävä kuva 4), mikä viittaa siihen, että D112E-mutaatio ei poistanut kysteiini 127:n ristisitoutumisesta johtuvaa GBTA-sitoutumisyhteistyön lisääntymistä. D112E-mutaatio ei myöskään vaikuttanut merkittävästi Hill-kertoimeen 2GBI:n sitoutumisessa D112E-, I127C Hv1 -dimeereihin (kuva 1). 6d ja Supplementary kuva 3). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että GBTA-sitoutumista tehostaa vierekkäisten Hv1-alayksiköiden S1-fragmenttien ulkopäiden välinen vuorovaikutus houkuttelevien sähköstaattisten vuorovaikutusten kautta tai substituoitujen kysteiinien välisten kovalenttisten sidosten muodostumisen kautta. Allosteerinen kytkentä paikkojen välillä lisääntyy ja johtaa sitoutumisyhteistyöhön. Vaikka houkuttelevien sähköstaattisten vuorovaikutusten vaikutus yhteistyöhön voidaan poistaa mutaatiolla D112E, kovalenttisten sidosten vaikutusta ei voi tehdä. Tutkiessamme kemiallista tilaa, joka on käytettävissä guanidiinijohdannaisten sitoutumiselle Hv1-kanaviin, havaitsimme, että 2-guanidinotiatsolilla, kuten GBTA:lla, on jyrkempi pitoisuusriippuvuus kuin 2-guanidinobentsimidatsolilla (kuvio 1c). Hill-kerroinanalyysi GBTA:sta sitoutumisesta molempiin dimeerisiin ja monomeeriset kanavat (kuvat 2a, b) ja dimeerinen kanava, jossa yksi alayksikkö oli esisidottu inhibiittoriin (kuva 4), johtivat siihen johtopäätökseen, että GBTA:n aiheuttama Hv1:n esto Vaikutus on synergistinen prosessi, ja yhdisteiden sitoutumiskohdat kahdessa alayksikössä on kytketty allosteerisesti. Havainto, että GBTA sitoutuu avoimeen kanavaan, kuten aiemmin osoitettiin samankaltaiselle yhdisteelle 2GBI32, viittaa siihen, että allosteerinen kytkentä voidaan arvioida spesifisesti avoimessa tilassa. Yhteistoiminnallinen sitoutumismallimme pystyi kuvaamaan kvantitatiivisesti HV1: n estämistä GBTA: lla (kuva 2C) ja selittämään 2GBI: n ja GBTA: n erilaiset vaikutukset kanavavirtojen rappeutumiseen kalvon repolarisaation jälkeen, mikä tukee tulkintaa sitoutumisprosessista. Suurin mäkikerroin, joka voidaan saavuttaa allosteerisessa proteiinissa, jolla on kaksi sitoutumiskohtaa (kuten HV1), on 2. mitataan GBTA sitoakseen HV1-villityypin kertoimella 1,31, joka nousi 1,88: een HV1 I127C: ssä. Synergistinen vapaa energia, ero pienimpien ja korkeimpien affiniteettipaikkojen sitoutumisen vapaan energian välillä (katso menetelmät), oli 1,3 kcal/mooli HV1-villityypin ja 2,7 kcal/moolin tapauksessa HV1 I127C: n tapauksessa. happea hemoglobiiniin on tunnetuin ja hyvin tutkittu esimerkki yhteistyöprosessista38. Ihmisen hemoglobiinille (tetrameeri, jossa on neljä allosterisesti kytkettyä sitoutumiskohtaa), mäkikerroin vaihtelee välillä 2,5-3,0, arvojen välillä 1,26-3,644 KCAL/MOL, kokeellisista olosuhteista riippuen38.Tämä globaalin energian suhteen GBTA: n sitoutumisen yhteistyö HV1: een ei ole olennaisesti erilainen kuin O2: n sitoutuminen hemoglobiiniin, kun otetaan huomioon erilaiset proteiinien alayksiköt kahdessa järjestelmässä. Synergiamallissamme GBTA -molekyylien sitoutuminen yhdelle alayksikölle johtaa viereisen alayksikön sitoutumisaffiniteetin lisääntymiseen. Kuvittelemme prosessia, jossa ensimmäisestä sitoutumistapahtumasta (indusoitu sopivuus) johtuvan sitoutumisympäristön uudelleenjärjestely johtaa uudelleen Muutokset alayksiköiden välisissä vuorovaikutuksissa. Vasteen näihin muutoksiin vierekkäiset alayksiköt muuttavat sitoutumiskohtiaan, mikä johtaa tiukempaan GBTA -sitoutumiseen. Tämän prosessin S1 -aspartaatti D112 on vastuussa lisääntyneeseen sitoutumisaffiniteettiin liittyvän sitoutumiskohdan uudelleenjärjestelystä.D112 Aikaisemmin osoitettiin olevan osa HV1 -protonin läpäisyreittiä ja toimivan selektiivisyyssuodattimena27,28. Tuloksemme osoittavat, että selektiivisyyssuodattimet kahdessa HV1 -alayksikössä on allosterisesti kytketty avoimeen tilaan. Kuvio 7A näyttää GBTA -sitoutumiskohdan likimääräisen sijainnin ja tähteiden D112, D123, K125 ja I127 sijainnin HV1 VSD -pohjaisen kaavion kanssa. HV1-CIVSP-kimeeran kiderakenteessa. Allosteerisen kytkennyksen ehdotukset S1: n solunulkoiseen päätä koskevat allosteeriset kytkentät esitetään mustilla nuolilla. (A) Kaavio HV1: stä VSD.pohjaisesti HV1-CIVSP-kimeeran kiderakenteeseen, kierteisten segmenttien on osoitettu olevan sylinterimäisiä.Täkin tämän konfiguraation, S4-segmentin sisäpää sulautuu CCD: n kanssa (ei esitetty). Sidotun GBTA: n ennustetut sijainnit on esitetty harmaina sotilaisina.Black -nuolet osoittavat allosteeriseen kytkemiseen liittyviä reittejä kahden vierekkäisen alayksikön sitoutumiskohtien välillä. Tutkittujen S1 -jäännösten sijainnit on merkitty värillisillä palloilla. (B) Kaavio HV1 Kahdessa eri dimeerikonfiguraatiossa, kuten näkyy kalvotason solunulkoisesta puolesta. Vasemman paneelin, dimeerirajapinta muodostuu S4 -helix. Kahden VSD: n 20 asteen rakoonpano akselin ympärillä kohtisuorassa kalvotasoon nähden, mukana, mukana Kahden S4 -heliksin (katkoviivaiset nuolet) ulkopäiden erottaminen tuottaa oikealla puolella esitetyn järjestelyn 4G80 -kiderakenteessa löydetyssä dimeerikonfiguraatiossa. CivSP: n asennus p140 vastaa asemaa D123 HV1: ssä. Tuloksemme osoittavat, että jäännöksen 123 (123d/123d tai 123R/123R) välinen vastenmielinen sähköstaattinen vuorovaikutus liittyy "normaaliin" GBTA: ta sitovan yhteisyhteistyön tasoon avoimessa tilassa ja siirtää vuorovaikutuksen torjunnasta houkuttelemaan (123d/123R) , lisääntynyt yhteistyö (kuvio 5G). On odotettavissa, että hylkivän vuorovaikutuksen poistaminen alaniinin substituutiolla johtaisi myös lisääntyneeseen yhteistyöhön. Kuitenkin havaittiin 123A/123A -dimeerin yhteistyöhön väheneminen (kuva 5E). Yksi mahdollinen mahdollinen Selitys on, että hydrofobisten tähteiden asettamisen horjuttava vaikutus hydrofiiliseen ympäristöön voi olla suurempi stabiloiva vaikutus johtuen D123 Ciona Gutis CI-Hv1: n sijainti D171 (vastaa D123: ta ihmisen HV1: ssä) lisääntyy aktivoinnin yhteydessä, mikä tukee ajatusta, että D123 sijaitsee hydrofiilisessä ympäristössä avoimessa tilassa. HV1-kanavien portin tiedetään tapahtuvan useiden siirtymien kautta19,20,26,39,40,41.qiu ym. , jota seurasi erillinen siirtymä, joka aiheuttaa protoneja avaamaan johtavuuden molemmissa alayksiköissä. Jänniteanturin konformaatiomuutosta tarkkailtiin jännitekannustin fluoresenssilla, ja havaittiin, että toinen siirtyminen hämärsi selektiivisesti mutaatiolla asennossa D171. Fluoresoivan signaalin häiriö on yhdenmukainen vierekkäisten alayksiköiden D171 -tähteiden välisten sähköstaattisten vuorovaikutusten kanssa jossain vaiheessa konformaatiomuutoksen reaktiokoordinaatit pitkin. Tämä tulkinta on yhdenmukainen havaintomme kanssa, että D123 ja välittää allosteerista kytkemistä GBTA -sitoutumiskohtien välillä. Fujiwara et al25 ehdottivat, että sytoplasmisen kelakelan domeenin dimeerirajapinta ulottuu kalvoon sisältämään kaksi S4-helikoita (kuva 7b, vasen paneeli). Tämän aluksien välisen vuorovaikutuksen malli perustuu kysteiinisidosanalyysiin, joka kattaa S4 -helixin ja CCD: n yhdistävän alueen koko VSD ja funktionaalinen analyysi transmembraanisen pH -gradientin puuttuessa HV1 -kanavat vaativat huomattavan kalvon depolarisaation avautumisen, ja kysteiinin silloittaminen tapahtuu olosuhteissa, joissa kanava on pääosin suljettu. Siksi havaittu S4-S4-rajapinta heijastaa todennäköisesti tilan ulkopuolisen alayksikön konfiguraatiota. Muut tutkimukset ovat löytäneet todisteita S1: n ja S2: n osallistumisesta intersunit-vuorovaikutuksiin Gating17,21,26: n aikana, mikä viittaa siihen, että kanavat voivat ottaa käyttöön erilaisia ​​alayksikön kokoonpanoja avoimessa ja Suljetut valtiot, idea, joka on yhdenmukainen Mony et al. S1 liikkuu 39 portin aikana. Tässä osoitamme, että avoimessa tilassa S1-helixin solunulkoiset päät ovat riittävän lähellä tukemaan suoria sähköstaattisia vuorovaikutuksia, jotka välittävät allosteerisia kytkimiä alayksiköiden välillä. Dimeerikonfiguraatioissa laajennetuilla S4-S4-vuorovaikutuksilla S1-helikit ovat liian kaukana Toistensa lisäksi vuorovaikutukseen suoraan. Kuitenkin 20 ° myötäpäivään kahden VSD-alayksikön kierto akselin ympärillä kohtisuorassa membraanitasossa yhdistettynä kahden S4-heliksien ulkopäiden erotteluun tuotti S1-S1-konfiguraation yhdenmukaisen Havaintojen kanssa (kuva 7B, oikea paneeli). Suosittelemme tätä konfiguraatiota kanavalle avoimessa tilassa. Vaikka civsp -entsyymin ajatellaan toimivan monomeerinä, sen eristetyn VSD: n kiderakenne on kaapattu dimeeritilaan. Tämän dimeerin S1 -heliksien ulkopäät ovat alueellisesti lähellä toisiaan, ja yleinen kokoonpano on samanlainen kuin ehdotettu HV1: lle (kuva 7C). CivSp -dimeerissä lähin jäännös viereisestä alayksiköstä oli proliini asennossa 140 (kuva 7c). Mielenkiintoista, p140 civSP: ssä vastaa asemaa D123 HV1.t. ja CIVSP -dimeerit viittaavat siihen, että näiden proteiinien VSD -levyillä on luontainen taipumus muodostaa rajapinta, jossa S1: n solunulkoiset päät ovat vuorovaikutuksessa. HV1: n olennaisen roolin siittiöiden solujen aktivaatiossa tekee tästä kanavasta houkuttelevan lääkehokion miesten hedelmällisyyden hallitsemiseksi. Lisäksi HV1: n aktivoinnin mikrogliassa on osoitettu heikentävän palautumista iskeemisestä aivohalvauksesta. HV1 Selviytyminen potilailla, joilla on rintoja 12 tai kolorektaalisyöpä 13, ja sen uskotaan edistävän B-solujen pahanlaatuisia kasvaimia 11. Siksi HV1: tä kohdistuvia pienimolekyylisiä lääkkeitä voidaan käyttää neuroprotektiivisina aineina tai syöpälääkkeinä. Avoin HV1 -alayksikkö, joka johtaa lisääntyneeseen sitoutumisaffiniteettiin, voi johtaa voimakkaampien HV1 -kanaviin kohdistuvien lääkkeiden kehittymiseen. Ihmisen HV1: n kohdennettu mutageneesi suoritettiin käyttämällä tavanomaisia ​​PCR-tekniikoita. HV1NCCIVSP-konstruktiossa, HV1: n tähteet 1-96 ja 228-273, korvattiin tähteillä 1-113 ja 240-576 CIVSP18.in HV1-linkitetyllä dimeerillä, 240-576. Yhden alayksikön C-pääte on kytketty toisen alayksikön N-päähän GGSGGGGSGSGGSGG-linkkerin kautta. PGEMHE-plasmidit, jotka sisälsivät erilaisia ​​rakenteita T7 MMESSAGE MMACHINE-transkriptiosarja (Ambion) .1-3 päivää ennen elektrofysiologisia mittauksia CRNA injektoitiin Xenopus-munasoluihin (50 nl solua kohti, 0,3-1,5 μg/μl). Virta V ja VI-oosyytti Xenopus Laevis (Nasco). Ekosyyttien biotiedettä. Seuraava RNA -injektio, solut pidettiin ND96 -elatusaineessa, joka sisälsi 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CACl, 1 mM mgcl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvaatti, 100 μg/ml gentamiinia, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-bentsimidatsoli [1], 2-guanidino-bentsotiatsoli [2], (4-metyyli-1,3-tiatsol-2-yyli) guanidiini [5], (5-bromi-4-metyyli-1,3 -atiatsol-2-yyli) guanidiini) [6], etyyli 2-guanidino-5-metyyli-1,3-tiatsoli-4-karboksylaatti [8], etyyli 2-guanidino-4-metyyli-1,3-tiatsoli- 5-karboksylaatti [9] ja (2-guanidino-4-metyyli-1,3-tiatsol-5-yyli) etyyliasetaatti [10] olivat Sigma-Aldrich.famotidiini [7] oli MP Biomedicals.1- [4 -(4-kloorifenyyli) -1,3-tiatsol-2-yyli] guanidiini [11] ja 1- [4- (3,4-dimetoksifenyyli) -1,3-tiatsol-2-yyli] Guanidiini [12] oli Matriisin tieteellisistä. Nämä yhdisteet ovat suurinta puhtautta kaupallisesti saatavana. Ne liuotettiin kuivaan DMSO: hon 100 mM: n varastoliuoksen tuottamiseksi, joka sitten laimennettiin tallennusliuoksessa halutussa lopullisessa konsentraatio.com -polmissa 3 ja 4 syntetisoitiin alla alla Ainakin 99% puhtaus. 2-amino-4- (trifluorimetyyli) bentsenetiolihydrokloridia (1,02 g, 4,5 mmol) suspensioon 25 ml: n vesipitoista hydrokloorihappoa (2,5 N) lisättiin kiinteää disandiamidia (380 mg, 4,5 mmol) ja saatuun heterogeeniseen seostoon refluksoitiin voimakkaasti sekoittamalla 4 tunnin ajan. Reaktioseos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja neutraloitiin lisäämällä asteittaista 10n kaliumhydroksidia. Muodostunut valkoinen sakka suodatettiin, pestiin kylmällä vedellä (3 x 50 ml), kuivattiin uunissa (uunissa (3 x 50 ml) 65 ° C) useita tunteja ja kiteytettiin sitten uudelleen etyyliasetaatista/öljyeetteristä valkoisen kiinteän aineen (500 mg, 48 %) antamiseksi; MP 221–222 ° C (valo 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7,25 (erittäin leveä S, 4 H), 7,40 (d, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (S, 1 H), 7,92 (D , 1 H, J = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114,2 (d, j = 3,5 Hz), 117,5 (d, j = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (Q, J J, J, J, J, = 272 Hz), 126,1 (Q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.Hrms (ESI): m/z laskettu arvo. C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, löydetty, löytynyt : 261.0419. Nafto [1,2-d] tiatsol-2-amiini (300 mg, 1,5 mmol), joka syntetisoitiin aiemmin kuvatulla tavalla, kuumennettiin 200 ° C: seen öljykylvyssä pienessä koeputkessa.300 mg (suuri ylimääräinen) syanamidi ja 1,0 ml kuumaa yhdistettä lisättiin suolahappoa nopeasti ja seosta pidettiin öljykylvyssä noin 2 minuutin ajan, jonka aikana suurin osa vedestä haihdutettiin. Reaktioseos jäähdytettiin sitten huoneenlämpötilaan ja tuloksena oleva kiinteä materiaali jaettiin pieniksi paloiksi ja pestiin vedellä vaaleankeltaisen amorfisen kiinteän aineen aikaansaamiseksi. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,66 (T, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,77 (D, 1 H, 1 H , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13C NMR (150 MHZ, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169.1.Hrms (ESI): M/Z Laskettu arvo. C12H11N4S (M + H) +: 243,06999999999999 , löydetty: 243.0704. Protonivirrat mitattiin munasolujen sisäisissä ja ulkoisissa laastarissa, jotka ekspressoivat erilaisia ​​rakenteita käyttämällä Axopatch 200B -vahvistinta, jota ohjataan akson digidata 1440a (molekyylilaitteilla) PCLAMP10-ohjelmistolla. ) etanesulfonihappo (MES), 30 mM tetraetyyliammonium (tee) mesylaatti, 5 mM teekloridi, 5 mM etyleeniglykol-bis (2-aminoetyyli) -n, n, n ', n'-tetraetikkahappo (EGTA), säädetty toiseen PH 6,0 teesydroksidilla. Kaikki mittaukset suoritettiin 22 ± 2 ° C: ssa. Pipetin pääsyvastus oli 1,5–4 MΩ. Virtajälkiä suodatettiin 1 kHz: llä, näytteistettiin 5 kHz: llä ja analysoitiin Clampit10.2: lla (molekyyliset laitteet ) ja alkuperä8.1 (OriginLab). Liuokset, jotka sisälsivät erilaisia ​​HV1-estäjän pitoisuuksia ja joissain tapauksissa 10 mM βME: n, tuotiin kylpyammeeseen painovoiman avulla jakoputken kautta, joka oli kytketty VC-6-perfuusioventtiilijärjestelmään (Warner Instr.), Joka kuljettiin PCLAMP-ohjelmiston TTL läpi (transistori- Transistorien logiikka) signaalit.Arapidi-perfuusiokokeet suoritettiin käyttämällä moniputken perfuusiokynää (automatisoiva sci.), Joiden halkaisijan halkaisija on asennettu 360 μm +120 mV depolarisoiva pulssi.GV -mittaukset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu18,20.TiAIL -virrat rekisteröitiin -40 mV: n lämpötilassa depolarisaatiovaiheiden jälkeen eri jännitteissä -20 mV: sta +120 mV: iin, ellei toisin mainita. Käytetään virran rappeutumisen korjaamiseen 18. GV -kuvaaja sopii Boltzmann -yhtälöön: Kanavien ja estäjien eri yhdistelmien näennäiset dissosiaatiovakiot (KD) määritettiin sovittamalla inhibition pitoisuusriippuvuus (keskimääräiset estävät arvot)) Hill -yhtälöllä: missä [i] on inhibiittorin I ja H pitoisuus, on mäkikerroin. Lasketa mäkikerroin, yhtälö (2) järjestetään uudelleen seuraavasti: