Undersyk fan 'e yntersubunit-ynterface fan it iepen Hv1-protonkanaal mei in allosterysk keppele sonde

Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke blêder brûke (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útsette). Yn 'e tuskentiid, om te garandearjen trochgeande stipe, wy sille werjaan de side sûnder stilen en JavaScript. De Hv1 voltage-gated proton kanaal is in dimearysk kompleks besteande út twa voltage-sensing domeinen (VSDs), dy't elk befettet in gated proton permeation pathway.Dimerization wurdt regele troch de cytoplasmic coiled-coil domein. it is bekend dat de iepen steat yn beide VSD's koöperatyf foarkomt; der is lykwols net folle bekend oer de ûnderlizzende meganismen.Intersubunit-ynterfaces spylje in wichtige rol yn allosteryske prosessen; lykwols, sokke ynterfaces binne net identifisearre yn iepen Hv1 kanalen. Hjir litte wy sjen dat 2-guanidinothiazole derivaten blokkearje twa Hv1 VSDs op in koöperative wize en brûke ien fan dizze ferbiningen as in sonde foar allosteric coupling tusken iepen subunits. Wy fûnen dat de ekstrazellulêre ein fan it earste transmembrane fragmint fan VSD foarmet in yntersubunit ynterface dy't bemiddelet koppeling tusken binende sites, wylst de coiled-coil domein is net direkt belutsen by dit process.We ek fûn sterke bewiis dat it kanaal syn proton-selektyf filter kontrolearret blocker-binende koöperaasje . Voltage-gated proton kanalen spylje wichtige rollen yn in ferskaat oan organismen, fan fytoplankton oant minsken1.Yn de measte sellen, dizze kanalen bemiddelje proton efflux út it proton membraan en regelje de aktiviteit fan NADPH oxidase. is Hv1, dat is it produkt fan it HVCN1-gen2,3.Hv1 (aka VSOP) is oantoand in rol te spyljen yn B-selproliferaasje4, produksje fan reaktive soerstofsoarten troch it oanberne ymmúnsysteem5,6,7,8, spermazelle motility9 en pH-regeling fan luchtwei oerflak fluid10. Dit kanaal is belutsen by ferskate Overexpressed yn kankersoarten lykas B-cell malignancies4,11 en boarst- en kolorektale kankers12,13.Excessive Hv1-aktiviteit waard fûn om it metastatyske potinsjeel fan kankersellen te fergrutsjen 11, 12. Yn it harsens wurdt Hv1 útdrukt troch microglia, en har aktiviteit is oantoand om harsensskea te fergrutsjen yn modellen fan ischemyske beroerte. De Hv1 proteïne befettet in voltage-sensing domein (VSD), dat bestiet út fjouwer transmembrane segminten neamd S1 to S414. De VSD liket de oerienkommende domeinen fan voltage-gated Na+, K+ en Ca2+ kanalen en spanning-sensitive phosphatases, lykas CiVSP út Ciona gutis15.Yn dizze oare aaiwiten is de C-terminus fan S4 hechte oan in effektormodule, it poardomein of enzyme.Yn Hv1 is S4 keppele oan it coiled-coil-domein (CCD) dat leit oan de cytoplasmyske kant fan it membraan .It kanaal is in dimearysk kompleks besteande út twa VSD's, elk mei in gated protonpermeaasjepaad16,17,18.Dizze twa Hv1-subunits waarden fûn om koöperatyf te iepenjen19,20,21,22, wat suggerearret dat allosteryske koppeling en ynter-subunit-ynteraksjes spylje in wichtige rol yn it gating proses.De ynterface tusken de subunits binnen de coiled coil domein is goed definiearre omdat de kristal struktueren fan de twa isolearre domeinen binne beskikber22,23. Oan 'e oare kant, de ynterface tusken VSDs binnen it membraan is net goed begrepen. De kristalstruktuer fan it Hv1-CiVSP chimeryske proteïne jout gjin ynformaasje oer dizze ynterface, om't de trimearyske organisaasje fan it kristallisearre kanaalkompleks it resultaat kin fan it ferfangen fan 'e lânseigen Hv1 CCD troch de gistleucine-rits GCN424. In resinte stúdzje fan 'e subunit-organisaasje fan it Hv1-kanaal konkludearre dat twa S4-helices oergean yn' e CCD sûnder slimme fersteuring fan 'e sekundêre struktuer, wat resulteart yn lange helices dy't begjinne fan' e membraan en projektearje yn it cytoplasma. dizze stúdzje stelt foar dat Hv1 VSDs kontakt inoar lâns de S4 segment. Lykwols, oare stúdzjes hawwe foarsteld alternative ynterfaces tusken VSDs. Dizze ynterfaces befetsje S1 segminten 17, 21, 26 en de bûtenste einen fan S2 segment 21. In mooglike reden foar de tsjinstridige resultaten fan dizze stúdzjes is dat allosteric coupling tusken VSDs waard ûndersocht yn relaasje ta de gating proses, dat hinget ôf fan de sletten en iepen steaten, en de ynterface tusken VSDs kin fariearje yn ferskillende steat feroarings yn conformation. Hjir fûnen wy dat 2-guanidinothiazole Hv1-kanalen ynhibeart troch synergistysk te binen oan twa iepen VSD's, en brûkte ien fan 'e ferbiningen, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), om de ynteraksje tusken subunits yn' e iepen steat te ûndersiikjen. interface.Wy fûnen dat de GBTA binende kromme goed beskreaun wurde kin troch in kwantitatyf model wêryn bining fan in ynhibitor oan ien subunit resultearret yn in ferheging fan de binende affiniteit fan de neistlizzende subunit.We fûnen ek dat residuen D112, selektiviteit filters foar de kanaal 27, 28 en in part fan de guanidine derivative binende site 29 control GBTA binende koöperaasje. Wy litte sjen dat koöperative bining wurdt hanthavene yn de Hv1 dimer, dêr't de CCD skiedt fan de S4 segment, wat suggerearret dat de intersubunit ynterface yn de CCD net direkt bemiddelje allosteryske keppeling tusken GBTA-binende siden. Yn tsjinstelling fine wy ​​dat it S1-fragmint diel is fan 'e ynterface tusken de subunits en foarstelle in arranzjemint fan neistlizzende VSD's mei it ekstrazellulêre ein fan' e S4-helix fuort fan it sintrum fan 'e dimer om te tastean it S1-fragmint te wêzen yn 'e iepen steat. Lytse molekule-ynhibitoren fan Hv1 binne nuttich as antykanker-medisinen en neuroprotective aginten. Lykwols, oant no ta, in pear ferbiningen hawwe by steat west om inhibit it kanaal30,31,32,33.Under harren, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, ferbining [1] yn Fig. . earder sjen litten om Hv1 hast sa effektyf te remmen as 2GBI doe't testen op in konsintraasje fan 200 μM (figuer 1b). Wy ûndersochten oare thiazole-derivaten en fûnen dat guon fan harren it kanaal mei ferlykbere of gruttere krêft as GBTA (figuer 1 en oanfoljend) ynhibeare tekst).Wy hawwe de konsintraasje-antwurdkurven fan fjouwer thiazol-derivaten bepaald (GBTA en ferbiningen [3], [6] en [11], Fig. 1c) en fûnen dat se steiler wiene as dy fan 2GBI. De Hill-koëffisjinten (h) fan thiazole-derivaten farieare fan 1.109 ± 0.040 oant 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c en Oanfoljende Fig. 1). Yn tsjinstelling wie de Hill-koëffisjint foar 2GBI 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a en Oanfoljende Fig. binding site,29,32 wy redenearre dat de bining fan in thiazole derivative oan ien subunit koe ferbetterje de bining fan in twadde inhibitor molecule oan de neistlizzende subunit.GBTA wie de test ferbining mei de heechste Hill koëffisjint. fierder ûndersykje it meganisme fan binende synergy en brûkt 2GBI as in referinsje negative kontrôle. (a) Testferbiningen: [1] Referinsje Hv1-inhibitor 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazol (GBTA), [3] (5-trifluormethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] nafto[1,2-d][1, 3] thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-tiazol-2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazol-4-carboxylic acid ethylester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazol-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-tiazol-5-yl)etylacetat, [11]1-[4-(4-Chloorfenyl)-1,3-tiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine.(b) Remming fan minsklike Hv1-aktiviteit troch de oantsjutte guanidinothiazolen en de referinsjeferbining 2GBI (blau-griene balken) .Hv1 proton streamingen waarden metten yn binnen-out plaques fan Xenopus oocytes yn reaksje op depolarization fan in holding potinsjeel fan -80 mV to +120 mV. Elke inhibitor waard tafoege oan it bad op in konsintraasje fan 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Gegevens binne gemiddelde ± SEM (n≥4). (c) Konsintraasje-ôfhinklike remming fan minsklik Hv1 troch ferbiningen [2], [3], [6] en [11]. Elk punt stiet foar de gemiddelde remming ± SD fan 3 oan 15 mjittingen. De line is in Hill-fit brûkt om de skynbere Kd-wearden te krijen rapportearre yn Oanfoljende Tabel 1. Heuvelkoëffisjinten waarden bepaald út 'e fits rapporteare yn Oanfoljende Fig. 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (sjoch Metoaden). (a,b) Ferbinings 2GBI en GBTA remme dimearyske en monomere Hv1 op in konsintraasje-ôfhinklike manier. Elk punt stiet foar de gemiddelde ynhibysje ± SD fan 3 oant 8 mjittingen en de kromme is in Hill fit. de ynset histograms waarden bepaald út de fits rapportearre yn Oanfoljende Figueren 3 en 4. De konsintraasje antwurd fan GBTA werjûn yn (a) is itselde as dat yn Fig.. 1c.Sjoch Oanfoljende Tabel 1 foar skynbere Kd wearden. (c) Modeling fan de koöperative bining fan GBTA oan dimearyske Hv1. De bêst swarte line stiet foar de fit nei de eksperimintele gegevens troch fergeliking (6), dy't beskriuwt de binende model werjûn yn (d). -dissosjaasje lykwichtskurven fan respektivelik de earste en twadde binende eveneminten (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Skematysk diagram fan it foarstelde meganisme fan it Hv1-blok. Yn it gefal fan GBTA fergruttet binding oan ien iepen subunit de affiniteit fan 'e neistlizzende iepen subunit (Kd2 Om de koöperative bining fan GBTA oan it kanaal kwantitatyf te beskriuwen, brûkten wy in model wêryn beide subunit it earste ynhibitormolekule kin bine nei in bimolekulêre reaksje mei in dissosjaasjekonstante Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO * ). Bining feroarsaket it kanaal om in steat oan te nimmen wêryn de oerbleaune lege subunits bine oan de ynhibitor nei in unike bimolekulêre reaksje mei in dissosjaasjekonstante Kd2, wêrby't Kd2 Sadree't de twadde inhibitor molekule is bûn, beide subunits hawwe in dissociation konstante Kd2 (Fig. 2d). Kanaal ynhibysje waard mjitten ûnder depolarizing omstannichheden (+120 mV). Kanaal soarten mei ien iepen en ien sletten subunit (sjoch oergong CC ⇄ OC ⇄ OO yn Fig. 2d) waarden earder fûn om ûnder dizze betingsten negligibel by te dragen oan de Hv1-stream19,20 en dus waarden se net opnommen yn it binende model. De fêste swarte line yn figuer 2c is de fit fan 'e modelfergeliking oan' e eksperimintele konsintraasje-antwurd-kromme, wêrtroch in Kd1 fan ~290 μM en in Kd2 fan ~29 μM (Metoade-seksje, fergeliking (6)) opbringt. It model beskriuwt ek de bining fan 2GBI, dêr't Kd2 ≈ Kd1 = Kd (fig. 2d). Yn monomere Hv1 is der mar ien biningside en ien Kdm (O° + B ⇆ B°). Yn it gefal fan GBTA is Kdm om 54 hinne. μM, dy't mear liket op Kd1 as Kd2 (fig. 2d). Mei oare wurden, de binende side fan it monomeer is yn in konfiguraasje (O°) mear ferlykber mei de hege affiniteitstatus (BO*) as de leech- affinity state (OO) fan 'e dimer, nei alle gedachten troch it eliminearjen fan' e ynterface tusken subunits. Lykas earder werjûn foar 2GBI32, fûnen wy dat GBTA Hv1-streamen ûnderdrukt troch it kanaal te blokkearjen doe't it iepen wie ynstee fan troch it dreger te meitsjen om te iepenjen (oanfoljende Fig. 2a, b, d). yn reaksje op membraanrepolarisaasje, mar dit ferskynsel waard net beoardiele yn GBTA (Supplementary Fig. 2c). Yn 'e oanwêzigens fan Hv1-ynaktivaasje yn' e oanwêzigens fan 2GBI kinne de poarten yn elke subunit net slute oant de blocker de binende side ferlit (de " foot gate" meganisme), en 2GBI ûntbindt stadiger as de poarten ticht. As ien Hv1 subunit is ûntsluten en sletten, wylst de neistlizzende subunit bliuwt blokkearre, ûntbining fan de oerbleaune 2GBI molekulen wurdt stadiger (blocker capture). Lang libbene kanaal soarten mei mar ien blokkearre subunit fiert protoanen foarby foar it sluten en makket in wichtige bydrage oan 'e stadich ferfallende sturtstream. De fynst dat it ferfal fan Hv1-sturtstreamen net signifikant fertrage waard yn 'e oanwêzigens fan GBTA (Supplementary Fig. 2c) is yn oerienstimming mei in synergistyske binende meganisme foar dizze blocker (Fig. 2d). , de affiniteit fan 'e blocker nei de neistlizzende subunit sakket sa'n 10-fâld, it begeunstigjen fan it ûntbinende proses. Dit betsjut dat it twadde molekule fan GBTA in folle hegere kâns hat om te ûntrafeljen foardat it yn 'e kanaal fongen wurdt. Lang libjende kanaalsoarten dy't produsearje mar ien blokkearjende subunit wurde ferwachte te wêzen folle mear oerfloedich yn 'e oanwêzigens fan GBTA dan yn' e oanwêzigens fan 2GBI, resultearret yn flugger sturt hjoeddeistige ferfal. Om GBTA koöperatyf te binen mei beide Hv1 subunits, moatte de binende siden allosterysk keppele wurde. Elke binende side moat by steat wêze om: 1) in keatling fan eveneminten te triggerjen dy't kommunisearje mei neistlizzende subunits bûn oan 'e ynhibitor, en 2) bemiddeling fan de oergong fan lege-affiniteit nei hege-affiniteit binding.We redenearre dat as spesifike resten binnen de binende site bydroegen oan it koöperative proses, harren mutaasje moat feroarje de Hill koëffisjint fan de konsintraasje-antwurd kromme fan GBTA remming fan Hv1. Residues D112, F150 , S181 en R211 waarden earder sjen litten te wêzen diel fan 'e 2GBI29 binende omjouwing en wy hypoteze dat se likegoed wurde belutsen by GBTA bining (Fig. 3A). , en R211S (figuer 3) en fergelike harren Hill koeffizienten mei dy fan Hv1 wyld-type, mei help fan 2GBI as referinsje. Residue V109 is op itselde gesicht fan de S1 segment as D112 en hat ien ekstra helical beurt binnen de sel. V109 wie net belutsen by de bining fan 2GBI29, wy brûkten de V109A mutant as kontrôle (Fig. 3b). (a) Suggested Hv1 resten belutsen by guanidine derivative binding.Dashed blauwe krommes omlizzende earder foarstelde kant keatlingen dy't ynteraksje mei ferskillende dielen fan gearstalling 2GBI29. (bf) Konsintraasje-ôfhinklike remming fan de oantsjutte Hv1 mutanten troch ferbiningen 2GBI (cyaan) en GBTA ( donker read). Elk punt stiet foar de gemiddelde remming fan 3 oant 12 mjittingen ± SD V109 as in negative kontrôle. Curves binne Hill fits brûkt om skynbere Kd-wearden te krijen (sjoch oanfoljende tabel 1). De Hill-koëffisjinten (h) werjûn yn de ynsletten histogrammen waarden bepaald út 'e passingen rapporteare yn oanfoljende figen 3 en 4. Referinsje h-wearden foar Hv1 WT wurde werjûn as stippele rigels. Asterisks jouwe statistysk signifikante ferskillen oan tusken mutante en WT-passaazjes (p 0.05, Fig. 5d,i) ). Oan 'e oare kant fermindere mutaasje D123A de Hill-koëffisjint fan GBTA signifikant (p 0.05/14). Sûnt it neutralisearjen fan de lading op posysje 123 op beide subunits resultearre yn in sterke feroaring yn GBTA binende koöperaasje, wylst it omkearjen fan de lading op beide subunits mar in lyts effekt hie, wreide wy de analyse út om mar ien subunit op te nimmen mei it inversionskanaal fan lading. generearre Hv1-keppele dimers mei D123R-ferfanging yn 'e C-terminale subunit (Fig. 5b) en mjitten de konsintraasje-antwurd-ynhibysje troch GBTA en 2GBI. fan wyldtype Hv1 (p 0.05). Wy fûnen ek dat yn 'e ôfwêzigens fan βME, de Hill-koëffisjint fan GBTA binend oan' e D112E I127C Hv1 dimer wie signifikant heger as dat mjitten yn 'e oanwêzigens fan ferminderjende aginten (Fig. 6e en Oanfoljende Fig. 4), wat betsjuttet dat De D112E-mutaasje De ferheging fan GBTA-binende koöperaasje as gefolch fan 'e cross-linking fan cysteine ​​127 net ôfskaft. Fig. 3). Mei-elkoar suggerearje dizze befinings dat GBTA-bining wurdt fersterke troch de ynteraksje tusken de bûtenste einen fan S1-fragminten yn neistlizzende Hv1-subunits troch oantreklike elektrostatyske ynteraksjes of troch de foarming fan kovalente bannen tusken ferfongen cysteines Allosteryske keppeling tusken siden nimt ta en resultearret yn binende koöperaasje. Wylst it effekt fan oantreklike elektrostatyske ynteraksjes op koöperaasje kin wurde ôfskaft troch mutaasje D112E, kin it effekt fan kovalente obligaasjes net. Yn ús ferkenning fan de gemyske romte beskikber foar binding guanidine derivaten oan Hv1 kanalen, wy fûnen dat 2-guanidinothiazoles lykas GBTA hawwe in steiler konsintraasje ôfhinklikens as 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c). en monomere kanalen (Fig. 2a,b) en nei it dimearyske kanaal wêryn ien subunit foarôf ferbûn wie oan 'e ynhibitor (Fig. 4) liede ús om te konkludearjen dat de ynhibysje fan Hv1 troch GBTA De aksje is in synergistysk proses, en de binende siden fan de ferbiningen yn de twa subunits binne allosterically keppele.De ûntdekking dat GBTA bynt oan it iepen kanaal, lykas earder sjen litten foar de besibbe ferbining 2GBI32, suggerearret dat allosteric coupling kin spesifyk beoardiele wurde yn de iepen steat. Us koöperative binding model koe de ynhibysje fan HV1 fan HV1 troch GBTA (fig. 2c) beskriuwe en ferklearje de ferskillende effekten fan 2GBI en gbta op it ferfal fan kanaal sturt nei membraegeferferklearring, dy't ús ynterpretaasje fan it binend proses stipet. De maksimale heufficientaal dat kin wurde berikt yn in algosterlike proteïne mei twa binende siden (lykas HV1) is mjitten GBTA om HV1 wyld te binden mei in koëffisjint fan 1.31, wat ferhege nei 1.88 yn HV1 I12.The Synergistyske frije enerzjy, it ferskil tusken de bining fan 'e binde enerzjy fan' e leechste en heechste affiniteiten), wie 1.3 KCAL-type en 2,7 kCal / mol yn it gefal fan HV1 I127C.The Binding fan soerstof oant hemoglobine is it meast ferneamde foarbyld fan 'e gearwurkjende process38.ferminske hemoglobine (in tetramer mei fjouwer kears-siden), de heuvelkoade fan 2,5-3.0, mei wearden fariearjend fan 1,64 KCAL / Mol, ôfhinklik fan eksperiminteel betingsten38.thus, yn termen fan Glodeverheid fan GBTA fan GBTA nei HemoGLOBIN as de ferskillende nûmers yn 'e twa systemen wurde beskôge. Yn ús synergymodel, de bining fan GBTA-molekulen resultearret yn in ferheging fan 'e binding yn' e binding fan 'e oanswettende subunitaasje wêrtroch in oardering fan' e binde omjouwing út it earste binende barren (induzeare fit) liedt Feroaringen yn 'e ynteraksjes tusken Subunits.In reaksje op dizze wizigingen, neist har binende siden, resultearre dit proses dat dit proses is ferbûn mei ferhege binde binding affiniteit.D112 wie earder werjûn om diel te wêzen fan 'e Peathway fan HV1-proton beantwurding en om te hanneljen as selektiviteit filter.28. Us resultaten litte sjen dat selektivediviteit yn 'e twa HV1-subunits yn' e iepen state-koppeling is, lit de sawat lokaasje fan 'e GBTA-bining D112, D125 en I127 op in skematyske fan' e HV1 VSD-basearre Op 'e kristalstruktuer fan' e HV1-Civsp-chimera.sûndere rjochtingen foar allosterlike koppeling wêrby't it ekstracellulêre ein fan S1 wurdt toand mei swarte pylken. (a) skematyske fan 'e HV1 VSD.Based op' e kristale struktuer fan 'e HV1-Civsp-chimera wurdt toand om silindrysk te wêzen om cylindrysk te wêzen, it binnenste ein fan it s4-segment fuses mei de CCD (net toand). De foarsizzende lokaasjes fan BBTA's wurde toand as griis ovals.black-pylken oanjaan yn 'e iensume subels yn twa oanhâldende S1-resten wurde markearre mei kleurde sfearen. (B) Schematyske yllustraasje fan HV1-subunits regele yn twa ferskillende dimerkonfiguraasjes út 'e ekstrangulêre kant fan' e membraant fan it linkerpaniel wurde foarme troch de S4 Helix fan 'e twa vost 20 graden om in aksekwekt om' e membraanplan, begelaat troch Skieding fan 'e bûtenste ein fan' e twa S4-helpen), produsearret de ôfspraak oan 'e rjochterkant, resten D123 en I127 fan' e neistinoar binne tegearre te kommen. (C) skema fertsjinwurdiging fan 'e Civsp VSD Yn 'e Dimer-konfiguraasje fûn yn' e 4G80 Crystal Structure.POoShing P140 yn CivSP komt oerien mei posysje D123 yn HV1. Us resultaten litte sjen dat de repulslike elektrostatyske ynteraksje tusken de rest fan 123 (123R / 12r) is assosjeare mei in "normaal" nivo fan GBTA-binding yn 'e iepensteat en ferskoot de ynteraksje fan repulsjes om te oanlutsen (12D / 123R) , Fergrutte gearwurking (Fig. 5G). It wurdt ferwachte dat ferwidering fan 'e ferwidering fan' e repulsjoneel wurk dat ek soe liede ta ferhege, in fersmoarging fan 'e 123A / 123-dimer waard waarnommen (fig. 5e). Mogele Taljochting is dat it destabilisearjende effekt fan it pleatsen fan hydrophobyske omjouwing yn in hydophilyske omjouwing te pleatsen fanwegen it eliminearjen fan 'e ôfwiking yn in algemiene gearwurking yn' e binding fan 'e binding yn' e binding fan 'e binding yn' e bindiviteit en al.3 en al.39 Posysje D171 fan Ciona Gutis CI-HV1 (oerienkommende mei D123 yn Human HV1) wurdt ferhege troch aktivearring, it begryp fan it idee dat D123 yn in hydrophilyske omjouwing leit. Gating fan HV1-kanalen is bekend om te foarkommen troch meardere transitions19.4,26.39.21 fûn dat op membraan fan CI-HV1-feroaring dy't it kanaal is aktivearre, mar noch sluten , folge troch in ûnderskate oergong dy't prote feroarsaket om konklúzje te iepenjen yn beide subforaasjeferoaring fan 'e spanning-sinneskyn te behâlden troch Flubsis te kontrolearjen dat de twadde oergong selectived troch de mutaasje yn posysje. De perturbaasje fan 'e fluorescent sinjaal is konsistint mei de oanwêzigens fan elektrostatyske ynteraksjes tusken de reaksje-koördinaten fan' e reaksje fan 'e reaksje is konsekwint dat de D123-residostatysk ynteraksje hat yn' e iepen steat ynteraksje yn 'e iepen steat en mediates allosterlike koppeling tusken gbta-binende siden. Fujiwara et al25 foarsteld dat de Dimer-ynterface fan 'e Cytoplasmyske coiled-coil-domein útwreidet om twa S4-panielen te befetsjen (ôfb. Model fan dizze ynteraksje op Cysteine ​​Cross-Link-analyse De heule VSD- en funksjoneel analyse fan 'e streek fan' e S4 HELIX en de CDADIME fan in transmbraan PH Gradoliëe om te iepenjen, en cystein-crosslinking foarkomme ûnder betingsten wêr't it kanaal foaral is. Dêrom reflektearje de ûntdutsen S4-S4-interface wierskynlik de ôfbylde konfiguraasje fan Subunit-konfiguraasje foar de belutsenens fan S1 en S2 yn Gating17,2,2,26 ferskillende ferskillende subunit konfiguraasjes oannaam yn it iepen en Sluten steaten, in idee konsistint mei de befiningen fan 'e mony et al. S1 Moves 39 Tidens Gating. Hjir litte wy sjen dat, yn 'e iepen steat binne de ekstramulêre úteinen fan' e S1-helix tichtby stipe om Direkte ynteraksjes te stypjen dy't it dimer-konfiguraasje fan S4-S4-ynteraksjes barre fan S4-S4-ynteraksjes, de S1-helatten binne te fier apart fan elkoar om direkt te ynterakearjen.However, in rotaasje fan 20 °heid fan 'e twa VSD-sublêze nei it skieding fan' e bûtenkant fan 'e bûtenkant fan' e twa S4-helatsen, joech in S1-S1-konfiguraasje oplevere Mei ús befiningen (Fig. 7b, rjochts paniel). Wy advisearje dizze konfiguraasje foar it kanaal yn 'e iepen steat. Hoewol de CivSP-Enzym wurdt tocht om te funksjonearjen as monomer, wurdt de Crystal-struktuer fan 'e SD-steat fêstlein yn in dimer-einen fan' e S1 yn dizze SAM's binne spatele ticht byinoar, en de algemiene konfiguraasje is gelyk oan dat foarsteld foar HV1 (Fig. 7C). MEI de CIVSP DIMER, it tichtstbye oertreding út it neistlizzende subunit op posysje 140 (Fig. ynteressant yn CivSP komt op POSPORT D12 IN HV1.DE LANGALE KONFNIGURASJE en Civsp-dimers suggerearje dat de vsdes fan dizze proteïnen in yntrinsike oanstriid hawwe om in ynterface te foarmjen wêr't de ekstramellulêre úteinen fan S1 ynteraksje. De essensjele rol fan HV1 yn SPERM-sel-aktivaasje makket dit kanaal in oantreklik drugs-doelstelling foar de kontrôle fan manlike fregjen yn Matroglia. Fan ischement. Dútslân HV1-aktiviteit waard ferbûn oan Nederlanners Survival yn pasjinten mei boarst 12 of Kleurektale kanker 13 en wurdt tocht oan bydrage oan B-Cell Malignances, kin wurde brûkt as neistein dat Guanidinothiazole Derivaten in konformatoariumsynrjochting kinne oanjaan yn 'e Iepenje HV1 Subunit, liedend ta ferhege binende affiniteit, kin liede ta de ûntwikkeling fan mear potening drugs dy't target foar it doeljen fan HV1-kanalen. Site-regissearre Mutagenesis fan 'e minske HV1 waard útfierd mei standert PCR-techniken, Resinsjes 1-96 en 228-257 fan Civsp18.in de HV1-keppele dimer, De C-Terminus fan ien subunit is keppele oan 'e N-Terminus fan' e twadde subunit fia de GGSGGSGGGSGGSSGG SKINDE DE FERGESE KONLIKE BINNE BINNE BINNE BINNE (NEW ENZLY BIOLABS) EN RNA SYNTEHESSE WURDE MET DE T7 mmessage mmachine transkripsje kit (ambuction) .1-3 dagen foar elektrofysiologyske mjittingen waard yn 'e xenopus oocyten (50 nl per sel) ynjitten, 0,3-1-oocyten fan xenopus laevis (nasco) waarden krigen Fan ECOCYTE BIOSCIENSJE RNA-ynjeksje, waarden sellen ûnderhâlden yn ND96 Medium befette 96 mm, 1 MM MGCL, 5 MM Pyruvate, 5 MM Pyruvate, 100 μg / ML Gentamicin, PH 7.2 18 ° C . 2-Guanidino-Benzimidazole [1], 2-Guanidino-Benzothiazole [2], (4-Methyl-1,3-Thiazol-2-2-YL) guanidine [5], (5-Bromo-4 -MetyL-1,3 -Thiazol-2-YL) guanidine) [6], Ethyl 2-Guanidino-5-Methyl-1,3-Thiazole-4-Carboxyl 2-Guanidino-4- Methyl-1,3-Thiazole- 5-Carboxylate [9] en (2-Guanidino-4-Methyl-1,3-5-THAYZOL-5-THYL ACETATE [10] Wiene fan Sigma-Aldrich.famotine [7] Was fan MP biomedicals.1- [4] - (4-chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine [11] en 1- [(4- (3- (3- (3- (3- [(3- (3- [thiazol-2-yl] guanidine [12] wie fan Matrix Scientific. Dizze ferbiningen binne fan 'e heechste suveren fan' e heechste suver, waarden oplost yn droege DMSO om te generearjen yn 'e opname-oplossing by it winske definitive konsintraasje.Counds 3 en 4 wiene hjirûnder synthesized hjirûnder teminsten 99% suverens. Nei in skorsing fan 2-amino-4- (TrifluoRethyl) Benzenethiol hydrochloride (1.02 G, 4,5 mmol) waard solide Dicyandiamide (380 MG, 4.5 Mmol), en it resultearjende heterogene mingsel waard refluxed mei heftige roeren foar 4 oere. It reaksjemengsel waard ôfkuolle en neutraliseare troch stadige tafoeging fan 10n powipitele hylde, wosken mei kâld wetter (3 × 50 ml), droege yn in oven ( 65 ° C) foar ferskate oeren, en dan rekonstreare fan etrole-acetaat / petroleum ether om in wite solide te jaan (500 mg, 48%); MP 221-222 ° C (Ljocht 225-226 ° C) 45; 1h nmr (500 mhz, dmso-d6): δ [ppm] = 7.25 (heul breed s, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 hz), 7,73 (s, 1 h), 7.92 (D , 1 h, j = 8,1 hz) .13C nmr (200 mhz, dmso-d6): δ = 114,2 (d, j = d, j = 3,5 hz), 121,7, 124,6 (q, j = 272 HZ), 126.1 (Q, J = 272 Hz), 134.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 17.5. Hattrick (esi): m / z berekkene wearde (m + h) +: 261.0416, fûn : 261.0419. Naftho [1,2-d] thiazol-2-amine (300 mg, 1,5 mmol), synthesized lykas earder waard, waard ferwaarme oant 200 ° c yn in lytse test buis.300 mg (grutte oermjittigens) Cyanamide en 1.0 ml Conc. By de hot-ferbining waard hydrochloric soere tafoege en it mingsel waard sawat 2 minuten yn it oaljebad hâlden, waard it measte fan 'e reaksjetoleare dan ôfkuolle oant keamertemperatuer en it resultearjende solidesde materiaal Is yn lytse stikken brutsen en wosken mei wetter om in ljochte giele amorf te jaan solide. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1h NMR (500 mhz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 h, j = 8,6 hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 hz), 7,77 (D, 1 H , J = 8,6 HZ), 7.89 (D, 1 H, J = 8.6 HZ), 8.02 (D, 1 H, J = 8.35 (D, 1 H, J = 8.3 HZ) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119,9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 137.1, 148.7, 169.1.7, 162.1.7 (esi): m / z berekkene wearde .For c12h11n4s (M + H) +: 243.0699 , Fûn: 243.0704. Proton streamen waarden mjitten yn ynterne patroanen fan oocytes dy't ferskate konstrukten útdrukt mei in axon-ôfwiking) mei PCLamp10-software.Ornellêre en ekstrammulêre oplossingen hawwe deselde komposysje: 100 mm 2- (n-morfolino ) Ethanesulfonic acid (MM Tetraethylammonium (tee) mesylate, 5 mm thee chloride, 5 mm ethyleen glycol-bis (2-aminoethyl) -n, n, n ', n'-tetraacetic acid (egTa), oanpast pH 6.0 mei tee hydroxide.all-mjittingen waarden útfierd om 22 ± 2 ° C.De-pipet hat in tagongsrjochten fan 1,5-4 mω waarden filteren op 5 kHz en analysearre mei klemfit10.2 (Molekulêre apparaten ) en oarsprong8.1 (orizjinele). Oplossingen dy't ferskate konsintraasjes fan HV1-ynwenner befetsje en yn guon gefallen waarden yn it bad yn 'e bad troch in manifik trochbrocht troch in VC-6 perfusion-ynstruksjes (Warner-ynstrweare troch de PCLAMP SOFTWARE TTL (Transistor- Transistor logika) Signalsrapid-eksperziminten waarden útfierd mei in tip foar in multi-buizing (SCI-pipette-ynhibing waard bepaald troch Isochronale amperometryske mjittingen oan 'e ein fan' e +120 mv depolarizing pulse.gv-mjittingen waarden útfierd as earder beskreaune5.tail streamen op -40 mv nei ferskillende spanning, útsein as oars. De referinsjepuls foarôfgeand oan de testpuls is Wurdt brûkt om te korrigearjen foar hjoeddeistige ferfal 18.De GV-grafyk past by de boltzmann-fergeliking: de skynbere dissocinten fan kanalen en ynhibitors (oanfoljende tabel 1) waarden bepaald troch de konsintraasje ôfhinklikens (gemiddelde% ynhibwearden) Mei de heuvel fergeliking: wêr't [i] de konsintraasje is fan inhibitor is, en H is de heuvel cohefficient, berekkenje de heuvelkoëffisjint, fergeliking (2) wurdt opnij ynrjochte as: