Ceasnachadh air an eadar-aghaidh eadar-roinneil den t-sianal proton Hv1 fosgailte le probe ceangailte ri allosterically

Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Chan eil mòran taic aig an tionndadh brobhsair a tha thu a’ cleachdadh airson CSS. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir dheth modh co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). San eadar-ama, gus dèanamh cinnteach taic leantainneach, seallaidh sinn an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript. Tha an sianal proton le bholtaids Hv1 na iom-fhillte dimeric anns a bheil dà raon mothachaidh bholtachd (VSDs), agus anns gach fear dhiubh tha slighe troimhe proton le gata. Tha dimerization fo smachd an àrainn coiled-coil cytoplasmic. tha fios gu bheil an stàit fhosgailte anns an dà VSD a 'tachairt gu co-obrachail; ge-tà, chan eil mòran fiosrachaidh mu na h-innealan bunaiteach.Tha prìomh àite aig eadar-aghaidh ann am pròiseasan allosteric; ge-tà, cha deach eadar-aghaidh mar sin a chomharrachadh ann an seanalan Hv1 fosgailte.An seo tha sinn a’ sealltainn gu bheil derivatives 2-guanidinothiazole a’ bacadh dà Hv1 VSD ann an dòigh cho-obrachail agus a’ cleachdadh aon de na todhar sin mar probe airson ceangal allosteric eadar fo-aonadan fosgailte. Tha deireadh a’ chiad chriomag transmembrane de VSD a’ cruthachadh eadar-aghaidh eadar-roinneil a bhios a’ meadhanachadh co-luachadh eadar làraich ceangail, ach chan eil an raon coiled-coil an sàs gu dìreach sa phròiseas seo. . Tha dreuchdan cudromach aig seanailean proton le bholtaids ann an grunn fhàs-bheairtean, bho phytoplancton gu daoine1.Anns a’ mhòr-chuid de cheallan, bidh na seanalan sin a’ meadhanachadh proton efflux bhon membran proton agus a’ riaghladh gnìomhachd NADPH oxidase. Thathas air sealltainn gu bheil Hv1, a tha mar thoradh air gine HVCN12,3.Hv1 (aka VSOP) a’ gabhail pàirt ann an iomadachadh cealla B4, cinneasachadh gnè ocsaidean reactive leis an t-siostam dìon dhùthchasach5,6,7,8, cealla sperm motility9 agus riaghladh pH de lionn uachdar slighe adhair10. Tha an sianal seo an sàs ann an grunn Overexpressed ann an seòrsaichean aillse leithid malignancies B-cell4,11 agus aillse broilleach is colorectal12,13.Chaidh gnìomhachd mòr Hv1 a lorg gus àrdachadh air comas meatastatach ceallan aillse 11, 12 .In an eanchainn, tha Hv1 air a chuir an cèill le microglia, agus thathas air sealltainn gu bheil a ghnìomhachd a’ dèanamh milleadh eanchainn nas miosa ann am modalan stròc ischemic. Anns a’ phròtain Hv1 tha raon mothachaidh bholtachd (VSD), anns a bheil ceithir earrannan transmembrane ris an canar S1 gu S414. Ciona gutis15.Anns na pròtanan eile seo, tha ceann-uidhe C S4 ceangailte ri modal buaidh, an àrainn pore no enzyme.In Hv1, tha S4 ceangailte ris an àrainn coiled-coil (CCD) a tha suidhichte air taobh cytoplasmic an membran. Tha an sianal na ionad dimeric air a dhèanamh suas de dhà VSD, gach fear le slighe troimhe proton le gata16,17,18.Chaidh an dà fho-aonad Hv1 seo fhosgladh gu co-obrachail19,20,21,22, a’ moladh gun robh ceangal allosteric agus eadar-obrachaidhean eadar-fo-aonadan a’ cluich Tha an eadar-aghaidh eadar na fo-aonadan taobh a-staigh an raon coiled coiled air a dheagh mhìneachadh leis gu bheil structaran criostail an dà raon iomallach rim faighinn22,23.Air an làimh eile, chan eil an eadar-aghaidh eadar VSDs taobh a-staigh an membran Chan eil structar criostail a 'phròtain chimeric Hv1-CiVSP a' toirt seachad fiosrachadh mun eadar-aghaidh seo, oir dh'fhaodadh eagrachadh trimeric an t-seanail criostalach a bhith mar thoradh air a bhith a 'cur an àite an Hv1 CCD dùthchasach le zipper leucine giosta GCN424. Cho-dhùin sgrùdadh o chionn ghoirid air buidheann subunit an t-seanail Hv1 gun robh dà helices S4 a’ gluasad a-steach don CCD gun dragh mòr air structar na h-àrd-sgoile, a’ leantainn gu helices fada a thòisicheas bhon membran agus a’ dol a-steach don cytoplasm. Tha an sgrùdadh seo a' moladh gum bi Hv1 VSDs a' conaltradh ri chèile air feadh earrann S4.Ach, tha sgrùdaidhean eile air eadar-aghaidh eile a mholadh eadar VSDs. is e toraidhean nan sgrùdaidhean sin gun deach sgrùdadh a dhèanamh air co-luachadh allosteric eadar VSDs a thaobh a’ phròiseas gheat, a tha an urra ris na stàitean dùinte agus fosgailte, agus faodaidh an eadar-aghaidh eadar VSDn atharrachadh ann an diofar atharrachaidhean stàite ann an co-chòrdadh. An seo, lorg sinn gu bheil 2-guanidinothiazole a’ cur bacadh air seanalan Hv1 le bhith a’ ceangal gu synergistigeach ri dà VSD fosgailte, agus a’ cleachdadh aon de na todhar, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), gus sgrùdadh a dhèanamh air an eadar-obrachadh eadar fo-aonadan anns an stàit fhosgailte. Fhuair sinn a-mach gum faod an lùb ceangail GBTA a bhith air a mhìneachadh gu math le modail cainneachdail anns a bheil ceangal neach-dìon ri aon fho-aonad a’ leantainn gu àrdachadh ann an dàimh ceangail an fho-aonad a tha faisg air làimh. Bidh sianal 27, 28 agus pàirt den làrach ceangail guanidine derivative 29 a’ cumail smachd air co-obrachadh ceangail GBTA.Tha sinn a’ sealltainn gu bheil ceangal co-obrachail air a chumail anns an dimer Hv1, far a bheil an CCD a’ sgaradh bhon roinn S4, a’ moladh nach eil an eadar-aghaidh eadar-roinneil anns an CCD a’ dèanamh gu dìreach An coimeas ri sin, tha sinn a’ faighinn a-mach gu bheil am criomag S1 mar phàirt den eadar-aghaidh eadar na fo-aonadan agus a’ moladh rèiteachadh de VSDs faisg air làimh le ceann extracellular an helix S4 air falbh bho mheadhan an dimer gus leigeil le a’ chriomag S1 a bhith ann an staid fhosgailte. Tha luchd-bacadh beag moileciuil de Hv1 feumail mar dhrogaichean anticancer agus riochdairean neuroprotective. . 1a) agus chaidh na toraidhean aige a lorg gus casg a chuir air VSD29,32 protonaichean tron ​​​​chanàl. a chaidh a dhearbhadh roimhe seo gus casg a chuir air Hv1 cha mhòr cho èifeachdach ri 2GBI nuair a chaidh a dhearbhadh aig dùmhlachd de 200 μM (Figear 1b). Rinn sinn sgrùdadh air derivatives thiazole eile agus lorg sinn gun do chuir cuid dhiubh bacadh air an t-sianal le comas coltach no nas motha na GBTA (Fig. 1 agus Leasachail). Cho-dhùin sinn na cromagan freagairt dùmhlachd de cheithir derivatives thiazole (GBTA agus todhar [3], [6] agus [11], Fig. 1c) agus lorg sinn gu robh iad nas cas na an fheadhainn aig co-èifeachdan 2GBI.The Hill (h) de derivatives thiazole eadar 1.109 ± 0.040 gu 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c agus Fig. 1 Leasachail). An coimeas ri sin, b' e co-èifeachd Hill airson 2GBI 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a agus Fig. 1 Leasachail). làrach ceangail, 29,32 rinn sinn reusanachadh gum faodadh ceangal toradh thiazole ri aon fho-aonad cur ri ceangal dàrna moileciuil bacaidh ris an subunit a bha faisg air làimh.GBTA b’ e an todhar deuchainn leis a’ cho-èifeachd Cnoc as àirde. Mar sin, thagh sinn an todhar seo gu tuilleadh sgrùdaidh air uidheamachd co-obrachadh ceangail agus cleachd 2GBI mar smachd àicheil iomraidh. (a) Stuthan deuchainn: [1] Iomradh Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d] [1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5] (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidine, [6] (5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl) guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4- (4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12] 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine.(b) A’ bacadh gnìomhachd Hv1 daonna leis na guanidinothiazoles comharraichte agus an todhar iomraidh 2GBI (bàraichean gorm-uaine) Chaidh sruthan proton .Hv1 a thomhas ann am clàran taobh a-staigh de Xenopus oocytes mar fhreagairt air dì-pholarachadh bho chomas gleidhidh de -80 mV gu +120 mV.Chaidh gach neach-dìon a chuir ris an amar aig dùmhlachd de 200 μM.pHi = pHo = 6.0 Tha .Data air a chiallachadh ± SEM (n≥4).(c) Bacadh Hv1 daonna a tha an urra ri dùmhlachd le coimeasgaidhean [2], [3], [6] agus [11]. gu 15 tomhas. Tha an loidhne freagarrach airson Cnoc a chaidh a chleachdadh gus na luachan Kd follaiseach a chaidh aithris ann an Clàr Leasachail 1 fhaighinn. Chaidh co-èifeachdan cnoc a dhearbhadh bho na h-innealan a chaidh aithris ann am Fig. 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (faic Dòighean). (a, b) Tha coimeasgaidhean 2GBI agus GBTA a’ bacadh Hv1 dimeric agus monomeric ann an dòigh a tha an urra ri dùmhlachd. chaidh na histograman inset a dhearbhadh bho na comharran a chaidh aithris ann am Figs Leasachail 3 agus 4. Tha freagairt dùmhlachd GBTA a chithear ann an (a) co-ionann ris an fhear ann am Fig. 1c.Faic Clàr Leasachail 1 airson luachan Kd a tha follaiseach.(c) Modaileadh de ceangal co-obrachail GBTA ri dimeric Hv1.Tha an loidhne dhubh chruaidh a’ riochdachadh iomchaidheachd an dàta deuchainneach le co-aontar (6), a tha a’ toirt cunntas air a’ mhodail ceangail a chithear ann an (d). -dissociation cromagan cothromachaidh den chiad agus an dàrna tachartas ceangail, fa leth (Fo 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Fo 2: BO * + B ⇄ B * O *, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Diagram sgeamach den uidheamachd a thathar a’ moladh airson bloc Hv1. Ann an cùis GBTA, tha ceangal ri aon fho-aonad fosgailte a’ meudachadh dàimh an fho-aonad fosgailte a tha faisg air làimh (Kd2 0.05, Fig. 5d,i). ). Air an làimh eile, lughdaich mùthadh D123A gu mòr an co-èifeachd Hill de GBTA (p 0.05/14). Leis gun do dh’ adhbhraich neodachadh a’ chosgais aig suidheachadh 123 air an dà fho-aonad atharrachadh làidir ann an co-obrachadh ceangail GBTA, fhad ‘s nach robh ach buaidh bheag aig a’ chosgais air an dà fho-aonad a thionndadh air ais, leudaich sinn am mion-sgrùdadh gus dìreach aon fho-aonad a ghabhail a-steach leis an t-sianal tionndaidh cosgais. gineadh dimers ceangailte Hv1 le ionadachadh D123R anns an fho-aonad C-terminal (Fig. 5b) agus thomhais an casg freagairt dùmhlachd le GBTA agus 2GBI. de sheòrsa fiadhaich Hv1 (p