एलोस्टेरिकली युग्मित जांच के साथ खुले एचवी1 प्रोटॉन चैनल के इंटरसबयूनिट इंटरफ़ेस की पूछताछ

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तरीके से ब्लॉक करते हैं और खुले सबयूनिट के बीच एलोस्टेरिक युग्मन के लिए जांच के रूप में इन यौगिकों में से एक का उपयोग करते हैं। हमने पाया कि बाह्यकोशिकीय वीएसडी के पहले ट्रांसमेम्ब्रेन टुकड़े का अंत एक इंटरसबयूनिट इंटरफ़ेस बनाता है जो बाइंडिंग साइटों के बीच युग्मन में मध्यस्थता करता है, जबकि कॉइल्ड-कॉइल डोमेन सीधे इस प्रक्रिया में शामिल नहीं होता है। हमें इस बात के भी पुख्ता सबूत मिले हैं कि चैनल का प्रोटॉन-चयनात्मक फ़िल्टर अवरोधक-बाइंडिंग सहकारिता को नियंत्रित करता है। . वोल्टेज-गेटेड प्रोटॉन चैनल विभिन्न प्रकार के जीवों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, फाइटोप्लांकटन से लेकर मनुष्यों तक। अधिकांश कोशिकाओं में, ये चैनल प्रोटॉन झिल्ली से प्रोटॉन प्रवाह की मध्यस्थता करते हैं और एनएडीपीएच ऑक्सीडेज की गतिविधि को नियंत्रित करते हैं। मनुष्यों में एकमात्र ज्ञात वोल्टेज-गेटेड प्रोटॉन चैनल एचवी1 है, जो एचवीसीएन1 जीन2,3 का उत्पाद है। एचवी1 (उर्फ वीएसओपी) को बी कोशिका प्रसार4, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली5,6,7,8, शुक्राणु कोशिका द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन में भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है। वायुमार्ग सतह द्रव10 की गतिशीलता9 और पीएच विनियमन। यह चैनल कैंसर के कई प्रकारों में शामिल है, जैसे कि बी-सेल दुर्दमताएं4,11 और स्तन और कोलोरेक्टल कैंसर12,13। अत्यधिक एचवी1 गतिविधि कैंसर कोशिकाओं 11,12 की मेटास्टेटिक क्षमता को बढ़ाने के लिए पाई गई। मस्तिष्क में, एचवी1 को व्यक्त किया जाता है। माइक्रोग्लिया द्वारा, और इसकी गतिविधि को इस्केमिक स्ट्रोक के मॉडल में मस्तिष्क क्षति को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। Hv1 प्रोटीन में एक वोल्टेज-सेंसिंग डोमेन (VSD) होता है, जिसमें S1 से S414 नामक चार ट्रांसमेम्ब्रेन खंड होते हैं। VSD वोल्टेज-गेटेड Na+, K+ और Ca2+ चैनलों और वोल्टेज-संवेदनशील फॉस्फेटेस, जैसे CiVSP के संबंधित डोमेन जैसा दिखता है। सिओना गुटिस15। इन अन्य प्रोटीनों में, एस4 का सी-टर्मिनस एक प्रभावक मॉड्यूल, छिद्र डोमेन या एंजाइम से जुड़ा होता है। एचवी1 में, एस4 झिल्ली के साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर स्थित कॉइल्ड-कॉइल डोमेन (सीसीडी) से जुड़ा होता है। .चैनल एक डिमेरिक कॉम्प्लेक्स है जिसमें दो वीएसडी होते हैं, प्रत्येक में एक गेटेड प्रोटॉन पारगम्य मार्ग होता है16,17,18। ये दो एचवी1 सबयूनिट सहकारी रूप से 19,20,21,22 खुलते हुए पाए गए, जिससे पता चलता है कि एलोस्टेरिक युग्मन और अंतर-सबयूनिट इंटरैक्शन खेलते हैं गेटिंग प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका। कुंडलित कुंडल डोमेन के भीतर सबयूनिट्स के बीच इंटरफ़ेस अच्छी तरह से परिभाषित है क्योंकि दो पृथक डोमेन की क्रिस्टल संरचनाएं उपलब्ध हैं। दूसरी ओर, झिल्ली के भीतर वीएसडी के बीच इंटरफ़ेस नहीं है अच्छी तरह से समझा गया। Hv1-CiVSP काइमेरिक प्रोटीन की क्रिस्टल संरचना इस इंटरफ़ेस के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है, क्योंकि क्रिस्टलीकृत चैनल कॉम्प्लेक्स का ट्रिमेरिक संगठन यीस्ट ल्यूसीन जिपर GCN424 द्वारा मूल Hv1 CCD के प्रतिस्थापन के परिणामस्वरूप हो सकता है। एचवी1 चैनल के सबयूनिट संगठन के एक हालिया अध्ययन ने निष्कर्ष निकाला कि दो एस4 हेलिकॉप्टर माध्यमिक संरचना में गंभीर व्यवधान के बिना सीसीडी में संक्रमण करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप लंबे हेलिकॉप्टर बनते हैं जो झिल्ली से शुरू होते हैं और साइटोप्लाज्म में प्रोजेक्ट होते हैं। सिस्टीन क्रॉसलिंकिंग विश्लेषण के आधार पर, इस अध्ययन का प्रस्ताव है कि एचवी1 वीएसडी एस4 खंड के साथ एक-दूसरे से संपर्क करते हैं। हालांकि, अन्य अध्ययनों ने वीएसडी के बीच वैकल्पिक इंटरफेस का प्रस्ताव दिया है। इन इंटरफेस में एस1 खंड 17, 21, 26 और एस2 खंड 21 के बाहरी छोर शामिल हैं। विरोधाभास का एक संभावित कारण इन अध्ययनों का परिणाम यह है कि वीएसडी के बीच एलोस्टेरिक युग्मन की जांच गेटिंग प्रक्रिया के संबंध में की गई थी, जो बंद और खुले राज्यों पर निर्भर करती है, और वीएसडी के बीच इंटरफ़ेस संरचना में विभिन्न राज्य परिवर्तनों में भिन्न हो सकता है। यहां, हमने पाया कि 2-गुआनिडिनोथियाज़ोल दो खुले वीएसडी से सहक्रियात्मक रूप से जुड़कर एचवी1 चैनलों को रोकता है, और खुली अवस्था में सबयूनिट्स के बीच बातचीत की जांच करने के लिए यौगिकों में से एक, 2-गुआनिडिनोबेंज़ोथियाज़ोल (जीबीटीए) का उपयोग किया। इंटरफ़ेस। हमने पाया कि जीबीटीए बाइंडिंग वक्र को एक मात्रात्मक मॉडल द्वारा अच्छी तरह से वर्णित किया जा सकता है जिसमें एक अवरोधक को एक सबयूनिट से बांधने से आसन्न सबयूनिट की बाइंडिंग आत्मीयता में वृद्धि होती है। हमने यह भी पाया कि अवशेष D112, चयनात्मकता फ़िल्टर के लिए चैनल 27, 28 और गुआनिडाइन डेरिवेटिव बाइंडिंग साइट 29 का हिस्सा जीबीटीए बाइंडिंग सहकारिता को नियंत्रित करता है। हम दिखाते हैं कि सहकारी बाइंडिंग एचवी1 डिमर में बनाए रखा जाता है, जहां सीसीडी एस4 सेगमेंट से अलग हो जाता है, यह सुझाव देता है कि सीसीडी में इंटरसबयूनिट इंटरफ़ेस सीधे नहीं होता है जीबीटीए-बाइंडिंग साइटों के बीच मध्यस्थता एलोस्टेरिक युग्मन। इसके विपरीत, हम पाते हैं कि एस 1 टुकड़ा सबयूनिट्स के बीच इंटरफेस का हिस्सा है और अनुमति देने के लिए डिमर के केंद्र से दूर एस 4 हेलिक्स के बाह्य कोशिकीय अंत के साथ आसन्न वीएसडी की व्यवस्था का प्रस्ताव करता है। S1 टुकड़ा खुली अवस्था में होना चाहिए। Hv1 के छोटे अणु अवरोधक कैंसर रोधी दवाओं और न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों के रूप में उपयोगी हैं। हालाँकि, आज तक, कुछ यौगिक चैनल 30,31,32,33 को बाधित करने में सक्षम हैं। उनमें से, 2-गुआनिडिनोबेंज़िमिडाज़ोल (2GBI, यौगिक [1] चित्र में) .1ए) और इसके डेरिवेटिव को चैनल के माध्यम से प्रोटॉन के वीएसडी29,32 प्रवेश को अवरुद्ध करने के लिए पाया गया। ऐसा माना जाता है कि ऐसे यौगिकों का बंधन दो खुले सबयूनिटों में स्वतंत्र रूप से होता है। 2-गुआनिडिनोबेंजोथियाज़ोल (चित्रा 1ए में जीबीटीए, यौगिक [2]) था। पहले दिखाया गया था कि 200 μM (चित्र 1बी) की सांद्रता पर परीक्षण करने पर एचवी1 लगभग 2GBI जितना प्रभावी रूप से बाधित होता है। हमने अन्य थियाज़ोल डेरिवेटिव की जांच की और पाया कि उनमें से कुछ ने GBTA (चित्र 1 और अनुपूरक) की तुलना में समान या अधिक क्षमता के साथ चैनल को बाधित किया है। पाठ)।हमने चार थियाज़ोल डेरिवेटिव (जीबीटीए और यौगिक [3], [6] और [11], चित्र 1 सी) की एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र निर्धारित की और पाया कि वे 2 जीबीआई की तुलना में अधिक तीव्र थे। हिल गुणांक (एच) थियाज़ोल डेरिवेटिव की रेंज 1.109 ± 0.040 से 1.306 ± 0.033 तक थी (चित्र)। 1सी और अनुपूरक चित्र 1)। इसके विपरीत, 2जीबीआई के लिए हिल गुणांक 0.975 ± 0.024 29 था, चित्र 2ए और अनुपूरक चित्र 1)। बाइंडिंग साइट, 29,32 हमने तर्क दिया कि थियाज़ोल व्युत्पन्न को एक सबयूनिट से बांधने से दूसरे अवरोधक अणु का आसन्न सबयूनिट से बंधन बढ़ सकता है। जीबीटीए उच्चतम हिल गुणांक वाला परीक्षण यौगिक था। इसलिए, हमने इस यौगिक को चुना बाइंडिंग तालमेल के तंत्र का आगे अध्ययन करें और संदर्भ नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 2GBI का उपयोग करें। (ए) परीक्षण यौगिक: [1] संदर्भ एचवी1 अवरोधक 2-गुआनिडिनो-बेंज़िमिडाज़ोल (2जीबीआई)।[2] 2-गुआनिडिनो-बेंजोथियाज़ोल (जीबीटीए), [3] (5-ट्राइफ्लोरोमिथाइल-1,3-बेंजोथियाज़ोल-2-वाईएल)गुआनिडाइन, [4] नेफ्थो[1,2-डी][1, 3] थियाज़ोल-2-वाईएल -गुआनिडाइन, [5](4-मिथाइल-1,3-थियाज़ोल-2-वाईएल)गुआनिडाइन, [6](5-ब्रोमो-4-मिथाइल-1,3-थियाज़ोल-2-वाईएल)गुआनिडाइन, [7] फैमोटिडाइन, [8] 2-गुआनिडिनो-5-मिथाइल-1,3-थियाज़ोल-4-कार्बोक्जिलिक एसिड एथिल एस्टर, [9] 2-गुआनिडिनो-4-मिथाइल एथिल-1,3-थियाज़ोल-5-कार्बोक्सिलेट, [10 ](2-गुआनिडिनो-4-मिथाइल-1,3-थियाज़ोल-5-वाईएल)एथिल एसीटेट, [11]1-[4-(4-क्लोरोफेनिल)-1,3-थियाज़ोल-2-वाईएल]गुआनिडाइन, [ 12]1-[4-(3,4-डाइमेथॉक्सीफेनिल)-1,3-थियाज़ोल-2-वाईएल]गुआनिडाइन। (बी) संकेतित गुआनिडिनोथियाज़ोल और संदर्भ यौगिक 2जीबीआई (नीली-हरी पट्टियाँ) द्वारा मानव एचवी1 गतिविधि का निषेध। .Hv1 प्रोटॉन धाराओं को -80 mV से +120 mV की धारण क्षमता से विध्रुवण के जवाब में ज़ेनोपस oocytes के अंदर-बाहर सजीले टुकड़े में मापा गया था। प्रत्येक अवरोधक को 200 μM की एकाग्रता पर स्नान में जोड़ा गया था। pHi = pHo = 6.0 .डेटा का मतलब ±SEM (n≥4) है। (सी) यौगिकों [2], [3], [6] और [11] द्वारा मानव एचवी1 का एकाग्रता-निर्भर निषेध। प्रत्येक बिंदु 3 के माध्य निषेध ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है। 15 माप तक. लाइन एक हिल फिट है जिसका उपयोग अनुपूरक तालिका 1 में रिपोर्ट किए गए स्पष्ट केडी मान प्राप्त करने के लिए किया जाता है। हिल गुणांक अनुपूरक चित्र 1 में रिपोर्ट किए गए फिट से निर्धारित किए गए थे: एच (1) = 0.975 ± 0.024 एच (2) = 1.306 ± 0.033, एच(3) = 1.25 ± 0.07, एच(6) = 1.109 ± 0.040, एच (11) = 1.179 ± 0.036 (तरीके देखें)। (ए,बी) यौगिक 2जीबीआई और जीबीटीए एकाग्रता-निर्भर तरीके से डिमेरिक और मोनोमेरिक एचवी1 को रोकते हैं। प्रत्येक बिंदु 3 से 8 मापों के औसत निषेध ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है और वक्र एक हिल फिट है। हिल गुणांक (एच) में दिखाया गया है इनसेट हिस्टोग्राम अनुपूरक चित्र 3 और 4 में रिपोर्ट किए गए फिट से निर्धारित किए गए थे। (ए) में दिखाए गए जीबीटीए की एकाग्रता प्रतिक्रिया चित्र 1 सी के समान है। स्पष्ट केडी मूल्यों के लिए पूरक तालिका 1 देखें। (सी) की मॉडलिंग जीबीटीए की डिमेरिक एचवी1 के लिए सहकारी बाइंडिंग। ठोस काली रेखा समीकरण (6) द्वारा प्रयोगात्मक डेटा के लिए फिट का प्रतिनिधित्व करती है, जो (डी) में दिखाए गए बाइंडिंग मॉडल का वर्णन करती है। सब 1 और सब 2 लेबल वाली धराशायी लाइनें द्विआणविक एसोसिएशन का प्रतिनिधित्व करती हैं - पहले और दूसरे बंधनकारी घटनाओं के पृथक्करण संतुलन वक्र, क्रमशः (उप 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; उप 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(डी) एचवी1 ब्लॉक के प्रस्तावित तंत्र का योजनाबद्ध आरेख। जीबीटीए के मामले में, एक खुले सबयूनिट से जुड़ने से आसन्न खुले सबयूनिट (केडी2 Hv1 चैनलों को उनके N- और C-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक डोमेन को Ciona Intestinalis वोल्टेज-संवेदनशील फॉस्फेट CiVSP (Hv1NCCiVSP)18,34 के संगत भागों से प्रतिस्थापित करके मोनोमेराइज़ किया जा सकता है। हमने GBTA और 2GBI द्वारा मोनोमेरिक Hv1 के निषेध की एकाग्रता निर्भरता को मापा और उनकी तुलना डिमेरिक चैनल (जंगली-प्रकार) निषेध (छवि 2 ए, बी) से की गई। हमने पाया कि दो यौगिकों के बीच बाध्यकारी सहयोगात्मकता में अंतर मोनोमेरिक एचवी 1 में समाप्त हो गया था, इस स्पष्टीकरण का समर्थन करते हुए कि जीबीटीए को एक सबयूनिट से बांधने से वृद्धि होती है। अवरोधक के लिए अन्य सबयूनिट की आत्मीयता। हमने तर्क दिया कि जीबीटीए को एक एचवी1 सबयूनिट से बांधने से बाइंडिंग साइट (फिट35 को प्रेरित करना) की पुनर्व्यवस्था हो सकती है, जो आसन्न सबयूनिट की खाली बाइंडिंग साइट की पुनर्व्यवस्था को ट्रिगर करेगी, जिससे बाइंडिंग में वृद्धि होगी। आत्मीयता। चैनल के लिए GBTA के सहकारी बंधन का मात्रात्मक वर्णन करने के लिए, हमने एक मॉडल का उपयोग किया जिसमें या तो सबयूनिट एक पृथक्करण स्थिरांक Kd1 (चित्र 2c, उप 1, OO+ B ⇆ BO*) के साथ द्विआण्विक प्रतिक्रिया के बाद पहले अवरोधक अणु को बांध सकता है। बाइंडिंग के कारण चैनल एक ऐसी स्थिति अपना लेता है जिसमें शेष खाली सबयूनिट पृथक्करण स्थिरांक Kd2 के साथ एक अद्वितीय द्विआण्विक प्रतिक्रिया के बाद अवरोधक से बंध जाते हैं, जहां Kd2 0.05) की कमी पाई, जो सुझाव देता है कि इसके बावजूद। दो सबयूनिट एक साथ महत्वपूर्ण हैं, लेकिन सीसीडी जीबीटीए बाइंडिंग साइटों के बीच इंटरसबयूनिट एलोस्टेरिक युग्मन में सीधे मध्यस्थता नहीं करता है। (ए) एस4 के आंतरिक छोर पर ट्राइग्लिसिन उत्परिवर्तन के साथ एचवी1 डिमर का योजनाबद्ध आरेख, साइटोप्लाज्मिक कॉइल्ड-कॉइल डोमेन (नीले तीर) द्वारा मध्यस्थ इंटरसबयूनिट युग्मन को बाधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। (बी) एचवी1 डिमर और लिगेशन डिमर का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व संकेतित उत्परिवर्तन, सबयूनिट्स (नीले तीर) के बीच युग्मन में शामिल एस 1 टुकड़ों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। (सी-एच) 2 जीबीआई (सियान) और जीबीटीए (गहरा लाल) संकेतित निर्माणों को एकाग्रता-निर्भर तरीके से रोकते हैं। प्रत्येक बिंदु औसत निषेध का प्रतिनिधित्व करता है ± 3 से 10 मापों का एसडी। वक्र एक हिल फिट था जिसका उपयोग स्पष्ट केडी मान प्राप्त करने के लिए किया जाता था (पूरक तालिका 1 देखें)। प्रक्षेपित हिस्टोग्राम में हिल गुणांक विधि अनुभाग में वर्णित अनुसार निर्धारित किए गए थे (पूरक चित्र 3 और 4 देखें)। एचवी1 डब्ल्यूटी को धराशायी रेखाओं के रूप में दिखाया गया है। तारांकन उत्परिवर्ती और डब्ल्यूटी मार्ग के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (पी 0.05, चित्र 5 डी, आई) की तुलना में किसी भी अवरोधक के हिल गुणांक में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं किया। ). दूसरी ओर, उत्परिवर्तन D123A ने GBTA (p 0.05/14)। चूंकि दोनों सबयूनिटों पर स्थिति 123 पर चार्ज को बेअसर करने के परिणामस्वरूप जीबीटीए बाइंडिंग सहकारिता में एक मजबूत बदलाव आया, जबकि दोनों सबयूनिटों पर चार्ज को उलटने से केवल एक छोटा सा प्रभाव पड़ा, हमने चार्ज के व्युत्क्रम चैनल के साथ केवल एक सबयूनिट को शामिल करने के लिए विश्लेषण को बढ़ाया। हम सी-टर्मिनल सबयूनिट (चित्र 5बी) में डी123आर प्रतिस्थापन के साथ एचवी1-लिंक्ड डिमर उत्पन्न किया और जीबीटीए और 2जीबीआई द्वारा एकाग्रता-प्रतिक्रिया अवरोध को मापा। हमने पाया कि डब्ल्यूटी-डी123आर चैनलों के लिए जीबीटीए बाइंडिंग का हिल गुणांक उससे काफी अधिक था। वाइल्ड-टाइप एचवी1 (पी 0.05)। हमने यह भी पाया कि βME की अनुपस्थिति में, D112E I127C Hv1 डिमर के लिए GBTA बाइंडिंग का हिल गुणांक कम करने वाले एजेंटों (चित्र 6e और अनुपूरक चित्र 4) की उपस्थिति में मापे गए से काफी अधिक था, जिसका अर्थ है कि D112E उत्परिवर्तन सिस्टीन 127 के क्रॉस-लिंकिंग के परिणामस्वरूप जीबीटीए बाइंडिंग सहकारिता में वृद्धि को समाप्त नहीं किया गया। D112E, I127C Hv1 डिमर्स के लिए 2GBI बाइंडिंग का हिल गुणांक भी D112E उत्परिवर्तन (चित्र 1) से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं हुआ। 6d और अनुपूरक चित्र 3). एक साथ लेने पर, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि जीबीटीए बाइंडिंग को आकर्षक इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से आसन्न एचवी 1 सबयूनिट्स में एस 1 टुकड़ों के बाहरी सिरों के बीच बातचीत से बढ़ाया जाता है या साइटों के बीच प्रतिस्थापित सिस्टीन एलोस्टेरिक युग्मन के बीच सहसंयोजक बंधन के गठन के माध्यम से बढ़ाया जाता है और बाध्यकारी सहकारीता में परिणाम होता है। जबकि सहकारिता पर आकर्षक इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के प्रभाव को उत्परिवर्तन D112E द्वारा समाप्त किया जा सकता है, सहसंयोजक बांड के प्रभाव को समाप्त नहीं किया जा सकता है। गुआनिडाइन डेरिवेटिव को एचवी1 चैनलों से जोड़ने के लिए उपलब्ध रासायनिक स्थान की हमारी खोज में, हमने पाया कि जीबीटीए जैसे 2-गुआनिडिनोथियाज़ोल में 2-गुआनिडिनोबेंज़िमिडाज़ोल (छवि 1 सी) की तुलना में अधिक एकाग्रता निर्भरता है। दोनों डिमेरिक के लिए जीबीटीए बाइंडिंग का हिल गुणांक विश्लेषण और मोनोमेरिक चैनल (छवि 2 ए, बी) और डिमेरिक चैनल जिसमें एक सबयूनिट अवरोधक से पहले से बंधा हुआ था (छवि 4) ने हमें यह निष्कर्ष निकालने के लिए प्रेरित किया कि जीबीटीए द्वारा एचवी 1 का निषेध क्रिया एक सहक्रियात्मक प्रक्रिया है, और दो उपइकाइयों में यौगिकों की बाइंडिंग साइट्स को एलोस्टेरिक रूप से युग्मित किया गया है। यह खोज कि जीबीटीए खुले चैनल से जुड़ता है, जैसा कि पहले संबंधित यौगिक 2GBI32 के लिए दिखाया गया है, यह बताता है कि एलोस्टेरिक युग्मन का विशेष रूप से खुले राज्य में मूल्यांकन किया जा सकता है। हमारा सहकारी बाइंडिंग मॉडल GBTA द्वारा Hv1 के निषेध का मात्रात्मक वर्णन करने में सक्षम था (चित्र 2c) और झिल्ली पुनर्ध्रुवीकरण के बाद चैनल टेल धाराओं के क्षय पर 2GBI और GBTA के विभिन्न प्रभावों की व्याख्या करने में सक्षम था, जो बाइंडिंग प्रक्रिया की हमारी व्याख्या का समर्थन करता है। अधिकतम पहाड़ी गुणांक जो दो बाध्यकारी साइटों (जैसे HV1) के साथ एक ऑलस्टॉस्टिक प्रोटीन में प्राप्त किया जा सकता है। 2. हमने GBTA को 1.31 के गुणांक के साथ HV1 जंगली-प्रकार को बांधने के लिए मापा, जो HV1 I127c.the में 1.88 तक बढ़ गया। synergistic मुक्त ऊर्जा, सबसे कम और उच्चतम आत्मीयता साइटों की बाध्यकारी मुक्त ऊर्जाओं के बीच का अंतर (विधियाँ देखें), HV1 जंगली-प्रकार और 2.7 kcal/मोल के मामले में Hv1 i127c.the बाइंडिंग के मामले में 1.3 kcal/मोल था। हीमोग्लोबिन से ऑक्सीजन को सहयोगी प्रक्रिया 38 का सबसे प्रसिद्ध और अच्छी तरह से अध्ययन किया गया उदाहरण है। मानव हीमोग्लोबिन (चार ऑलस्टेरिक रूप से युग्मित बाइंडिंग साइटों के साथ एक टेट्रामर), पहाड़ी गुणांक 2.5-3.0 से, 1.26 से 3.64 तक के मानों के साथ। KCAL/mol, प्रायोगिक शर्तों के आधार पर 38.thus, वैश्विक ऊर्जावान के संदर्भ में, HV1 के लिए GBTA बाइंडिंग की सहकारिता O2 बाइंडिंग से हीमोग्लोबिन से काफी अलग नहीं है जब दो प्रणालियों में प्रोटीन सबयूनिट्स की विभिन्न संख्याओं पर विचार किया जाता है। हमारे सिनर्जी मॉडल में, GBTA अणुओं के बंधन में एक सबयूनिट के लिए आसन्न सबयूनिट की बाध्यकारी आत्मीयता में वृद्धि होती है। हम एक प्रक्रिया की कल्पना करते हैं, जिसमें पहली बाध्यकारी घटना (प्रेरित फिट) से उत्पन्न बाध्यकारी वातावरण का पुनर्व्यवस्थितता होती है। सबयूनिट्स के बीच बातचीत में परिवर्तन। इन परिवर्तनों की प्रतिक्रिया में, आसन्न सबयूनिट्स ने अपनी बाध्यकारी साइटों को बदल दिया, जिसके परिणामस्वरूप सख्त GBTA बाइंडिंग होती है। इस प्रक्रिया को देखते हुए, S1 aspartate D112 में वृद्धि हुई बाध्यकारी साइट के पुनर्व्यवस्थितता के लिए जिम्मेदार है। पहले HV1 प्रोटॉन पारगमन मार्ग का हिस्सा और चयनात्मकता Filter27,28 के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया था। हमारे परिणाम बताते हैं कि दो HV1 सबयूनिट्स में चयनात्मकता फ़िल्टर खुले राज्य में allosterically युग्मित हैं। HV1-CIVSP CHIMERA की क्रिस्टल संरचना पर। S1 के बाह्य अंत को शामिल करने वाले Allosteric युग्मन के लिए दिशा-निर्देशों को काले तीर के साथ दिखाया गया है। (ए) HV1-CIVSP चिमेरा के क्रिस्टल संरचना पर HV1 vsd.based के योजनाबद्ध, पेचदार खंडों को बेलनाकार दिखाया जाता है। इस कॉन्फ़िगरेशन में, S4 खंड का आंतरिक छोर CCD (दिखाया नहीं गया) के साथ विलय हो जाता है। बाध्य GBTA के अनुमानित स्थानों को ग्रे अंडाकार के रूप में दिखाया गया है। ब्लैक तीर दो आसन्न सबयूनिट्स में बाध्यकारी साइटों के बीच ऑलोस्टेरिक युग्मन में शामिल मार्गों को इंगित करते हैं। जांच किए गए S1 अवशेषों के पदों को रंगीन गोले के साथ चिह्नित किया जाता है। दो अलग -अलग डिमर कॉन्फ़िगरेशनों में, जैसा कि झिल्ली विमान के बाह्य पक्ष से देखा जाता है। बाएं पैनल पर, डिमर इंटरफ़ेस का गठन S4 हेलिक्स द्वारा किया जाता है। दो VSDs के 20 डिग्री के घड़ी में एक अक्ष के चारों ओर 20 डिग्री दक्षिणावर्त, झिल्ली विमान के साथ, साथ ही साथ, साथ दो S4 हेलिकॉप्टरों (धराशायी तीर) के बाहरी छोरों का पृथक्करण, दाईं ओर दिखाई गई व्यवस्था का उत्पादन करता है। इस कॉन्फ़िगरेशन में, आसन्न सबयूनिट्स से अवशेष D123 और I127 को एक साथ आने की अनुमति दी जाती है। (c) CIVSP VSD के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 4G80 क्रिस्टल संरचना में पाए गए डिमर कॉन्फ़िगरेशन में। CIVSP में P140 P140 HV1 में D123 की स्थिति से मेल खाती है। हमारे परिणाम बताते हैं कि अवशेष 123 (123d/123d या 123r/123r) के बीच प्रतिकारक इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन खुली स्थिति में GBTA- बाइंडिंग सहकारिता के "सामान्य" स्तर के साथ जुड़ा हुआ है और प्रतिकर्षण से लेकर आकर्षित (123d/123r) पर बातचीत को स्थानांतरित करता है (123d/123r) , बढ़ा हुआ सहयोग (छवि। 5 जी)। यह उम्मीद की जाती है कि एलेनिन प्रतिस्थापन के साथ प्रतिकारक बातचीत को हटाने से भी सहकारिता में वृद्धि होगी। हालांकि, 123 ए/123 ए डिमर की सहकारिता में कमी देखी गई (छवि 5 ई)। स्पष्टीकरण यह है कि एक हाइड्रोफिलिक वातावरण में हाइड्रोफोबिक अवशेषों को रखने का अस्थिर प्रभाव D123 अवशेषों के बीच प्रतिकारक बातचीत के उन्मूलन के कारण स्थिर प्रभाव को कम कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बाइंडिंग कोऑपरेटिविटी में समग्र कमी आई है। CIONA GUTIS CI-HV1 (मानव HV1 में D123 के अनुरूप) की स्थिति D171 सक्रियण पर बढ़ जाती है, इस धारणा का समर्थन करती है कि D123 खुले राज्य में एक हाइड्रोफिलिक वातावरण में स्थित है। HV1 चैनलों के गेटिंग को कई संक्रमणों के माध्यम से होने के लिए जाना जाता है। , एक अलग संक्रमण के बाद, जो दोनों सबयूनिट्स पथ में चालन को खोलने के लिए प्रोटॉन का कारण बनता है। वोल्टेज सेंसर के परिवर्तनकारी परिवर्तन की निगरानी वोल्टेज-क्लैंप प्रतिदीप्ति द्वारा की गई थी, और यह पाया गया कि दूसरा संक्रमण चुनिंदा रूप से स्थिति D171 पर उत्परिवर्तन से परेशान था। फ्लोरोसेंट सिग्नल की गड़बड़ी कुछ बिंदु पर आसन्न सबयूनिट्स के D171 अवशेषों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन की उपस्थिति के साथ संगत है, जो कि परिवर्तनकारी परिवर्तन की प्रतिक्रिया निर्देशांक के साथ कुछ बिंदु पर है। यह व्याख्या हमारी खोज के अनुरूप है कि D123 अवशेष इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से खुले राज्य में बातचीत करता है। और GBTA बाइंडिंग साइटों के बीच Allosteric युग्मन की मध्यस्थता करता है। फुजिवारा एट अल 25 ने प्रस्तावित किया कि साइटोप्लाज्मिक कॉइल्ड-कॉइल डोमेन का डिमर इंटरफ़ेस दो एस 4 हेलिकॉप्टरों (छवि। 7 बी, लेफ्ट पैनल) को शामिल करने के लिए झिल्ली में फैली हुई है। इस इंटरसुब्यूनिट इंटरैक्शन का मॉडल सिस्टीन क्रॉस-लिंकिंग विश्लेषण पर आधारित है। S4 हेलिक्स और CCD.in को जोड़ने वाले क्षेत्र का संपूर्ण VSD और कार्यात्मक विश्लेषण एक ट्रांसमेम्ब्रेनर पीएच ग्रेडिएंट की अनुपस्थिति, HV1 चैनलों को खोलने के लिए काफी झिल्ली विध्रुवण की आवश्यकता होती है, और सिस्टीन क्रॉसलिंकिंग उन परिस्थितियों में होता है जहां चैनल मुख्य रूप से बंद होता है। इसलिए, पता चला S4-S4 इंटरफ़ेस की संभावना ऑफ-स्टेट सबयूनिट कॉन्फ़िगरेशन को दर्शाती है। अन्य अध्ययनों ने गेटिंग 17,21,26 के दौरान इंटरसुब्यूनिट इंटरैक्शन में S1 और S2 की भागीदारी के लिए सबूत पाए हैं, जिसमें सुझाव दिया गया है कि चैनल खुले में अलग-अलग सबयूनिट कॉन्फ़िगरेशन अपना सकते हैं और बंद राज्यों, एक विचार मोनी एट अल के निष्कर्षों के अनुरूप है। गेटिंग के दौरान S1 39 चलता है। यहां, हम दिखाते हैं कि, खुली स्थिति में, S1 हेलिक्स के बाह्य छोर प्रत्यक्ष इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हैं, जो सबयूनिट्स के बीच ऑलस्टेरिक युग्मन को मध्यस्थता करते हैं। सीधे बातचीत करने के लिए एक-दूसरे के अलावा। फिर भी, झिल्ली विमान के लंबवत एक अक्ष के चारों ओर दो वीएसडी सबयूनिट्स के 20 ° दक्षिणावर्त रोटेशन, दो S4 हेलिकॉप्टरों के बाहरी छोरों के पृथक्करण के साथ, S1-S1 कॉन्फ़िगरेशन सुसंगत उपज हमारे निष्कर्षों के साथ (छवि 7 बी, राइट पैनल)। हम खुले राज्य में चैनल के लिए इस कॉन्फ़िगरेशन की सलाह देते हैं। यद्यपि CIVSP एंजाइम को एक मोनोमर के रूप में कार्य करने के लिए माना जाता है, इसके पृथक वीएसडी की क्रिस्टल संरचना को एक डिमर स्थिति में कैप्चर किया जाता है। इस डिमर में एस 1 हेलिकॉप्टरों के बाहरी सिरे स्थानिक रूप से एक साथ बंद हैं, और समग्र विन्यास प्रस्तावित के समान है। HV1 (छवि। 7C) के लिए। CIVSP डिमर में, आसन्न सबयूनिट से निकटतम अवशेष स्थिति 140 (छवि। 7C) पर प्रोलिन था। और CIVSP डिमर्स का सुझाव है कि इन प्रोटीनों के वीएसडी में एक इंटरफ़ेस बनाने के लिए एक आंतरिक प्रवृत्ति होती है जहां एस 1 के बाह्य अंत में बातचीत होती है। शुक्राणु सेल सक्रियण में HV1 की आवश्यक भूमिका इस चैनल को पुरुष प्रजनन क्षमता के नियंत्रण के लिए एक आकर्षक दवा लक्ष्य बनाती है। स्तन 12 या कोलोरेक्टल कैंसर 13 के रोगियों में अस्तित्व और बी-सेल दुर्भावनाओं में योगदान करने के लिए माना जाता है। इसके अलावा, एचवी 1 को लक्षित करने वाले छोटे अणु दवाओं को न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों या एंटीकैंसर थेरेप्यूटिक्स के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह खोज कि ग्वानिडिनोथियाज़ोल डेरिवेटिव्स को सृजन करने वाले पुनर्वितरणों को प्रेरित कर सकते हैं। ओपन एचवी 1 सबयूनिट, जो बाध्यकारी आत्मीयता में वृद्धि के लिए अग्रणी है, एचवी 1 चैनलों को लक्षित करने वाली अधिक शक्तिशाली दवाओं के विकास को जन्म दे सकता है। मानव HV1 के साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन को मानक PCR तकनीकों का उपयोग करके किया गया था। HV1NCCIVSP निर्माण में, HV1 के 1-96 और 228-273 के अवशेष 1-113 और 240-576 Civsp18 के अवशेषों द्वारा प्रतिस्थापित किए गए थे। एक सबयूनिट के सी-टर्मिनस को ggsggsggsgsgsggsggggggggggggggggggggggggggsgg लिंकर के माध्यम से दूसरे सबयूनिट के एन-टर्मिनस से जोड़ा जाता है। विभिन्न निर्माणों वाले pgemhe प्लास्मिड्स को NHE1 या SPH1 प्रतिबंध एंजाइम (न्यूलैंड बायोलैब्स) के साथ रैखिक किया गया था और आरएनए सिंथेसिस को प्रदर्शन किया गया था और T7 mmessage mmachine प्रतिलेखन किट (Ambion) .1-3 दिन पहले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप से पहले, CRNA को xenopus oocytes (50 nl प्रति सेल, 0.3-1.5 μg/μl) में इंजेक्ट किया गया था। इकोसाइट बायोसाइंस से। आरएनए इंजेक्शन को बढ़ावा देने से, कोशिकाओं को ND96 माध्यम में 96 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 1.8 मिमी CaCl, 1 मिमी MGCL, 10 मिमी HEPES, 5 मिमी पाइरूवेट, 100 μg/ml जेंटामाइमिन, ph 7.2 18 ° C को बनाए रखा गया था। . 2-गुआनिडिनो-बेंजिमिडाज़ोल [1], 2-गुआनिडिनो-बेंजोथियाज़ोल [2], (4-मिथाइल-1,3-थियाज़ोल -2-वाईएल) गुआनिडीन [5], (5-ब्रोमो-4 -मेथाइल -1,3 -thiazol-2-yl) guanidine) [6], एथिल 2-गुआनिडिनो-5-मिथाइल-1,3-थियाज़ोल-4-कार्बोक्सिलेट [8], एथिल 2-गुआनिडिनो-4- मिथाइल-1,3-थियाज़ोल- 5-कार्बोक्सिलेट [9] और (2-गुआनिडिनो-4-मिथाइल-1,3-थियाज़ोल-5-वाईएल) एथिल एसीटेट [10] सिग्मा-एल्ड्रिच से थे। फामोटिडीन [7] एमपी बायोमेडिकल से था। -(4-क्लोरोफेनिल) -1,3-थियाज़ोल-2-yl] गुआनिडीन [11] और 1- [4- (3,4-डाइमिथोक्सीफेनिल) -1,3- थियाज़ोल -2-वाईएल] गुआनिडीन [12] मैट्रिक्स वैज्ञानिक से। ये यौगिक उच्चतम शुद्धता के रूप में उपलब्ध हैं। कम से कम 99% शुद्धता। जलीय हाइड्रोक्लोरिक एसिड (2.5 एन) के 25 मिलीलीटर में 2-एमिनो-4- (ट्राइफ्लोरोरोमेथाइल) बेंज़ेनेथिओल हाइड्रोक्लोराइड (1.02 ग्राम, 4.5 मिमीोल) के निलंबन के लिए ठोस सुस्त (380 मिलीग्राम, 4.5 एमएमओएल), और परिणामी विषम 4 घंटे के लिए जोरदार सरगर्मी के साथ भाड़ा किया गया था। प्रतिक्रिया मिश्रण को कमरे के तापमान पर ठंडा किया गया था और 10N पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के क्रमिक जोड़ द्वारा बेअसर कर दिया गया था। गठित सफेद अवक्षेप को फ़िल्टर किया गया था, ठंडे पानी (3 × 50 एमएल) से धोया गया था, एक ओवन में सूख गया (3 × 50 मिलीलीटर) 65 डिग्री सेल्सियस) कई घंटों के लिए, और फिर एक सफेद ठोस (500 मिलीग्राम, 48 %) देने के लिए एथिल एसीटेट/पेट्रोलियम ईथर से पुनरावृत्ति; सांसद 221-222 ° C (प्रकाश 225-226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7.25 (बहुत व्यापक S, 4 H), 7.40 (D, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (S, 1 H), 7.92 (D (D (D (S, 1 H), 7.92 (D । = 272 हर्ट्ज), 126.1 (क्यू, जे = 272 हर्ट्ज) = 31.6 हर्ट्ज), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ईएसआई): एम/जेड गणना मूल्य। : 261.0419। नेफथो [1,2-डी] थियाज़ोल -2-एमाइन (300 मिलीग्राम, 1.5 मिमीोल), पहले से वर्णित के रूप में संश्लेषित किया गया था, एक छोटे परीक्षण ट्यूब में एक तेल स्नान में 200 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया था। 1.0 मिलीलीटर conc.to गर्म यौगिक को तेजी से हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ा गया था और मिश्रण को लगभग 2 मिनट के लिए तेल स्नान में रखा गया था, इस दौरान अधिकांश पानी वाष्पित हो गया। प्रतिक्रिया मिश्रण को फिर कमरे के तापमान और परिणामस्वरूप ठोस सामग्री के लिए ठंडा किया गया। छोटे टुकड़ों में टूट गया था और पानी से धोया गया था ताकि एक पीला पीला अनाकार ठोस प्रदान किया जा सके। (38 मिलीग्राम, 10%) एमपी 246-250 डिग्री सेल्सियस; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (T, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (D, 1 H H) । MHz, DMSO-D6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): m/z परिकलित मान। , पाया: 243.0704। प्रोटॉन धाराओं को oocytes के आंतरिक और बाहरी पैच में मापा गया था, जो एक एक्सोपैच 200 बी एम्पलीफायर का उपयोग करके विभिन्न निर्माणों को व्यक्त करते हैं, जो कि एक एक्सॉन डिजीडटा 1440 ए (आणविक उपकरणों) द्वारा नियंत्रित किया गया था। ) इथेनसुल्फ़ोनिक एसिड (एमईएस), 30 मिमी टेट्रैथाइलमोनियम (टीईए) मेसिलेट, 5 मिमी चाय क्लोराइड, 5 मिमी एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (2-एमिनोइथाइल)-एन, एन, एन, एन ', एन'-टेट्रैसेटिक एसिड (ईजीटीए), समायोजित किया गया। चाय हाइड्रॉक्साइड के साथ पीएच 6.0। सभी माप 22 ° 2 ° C. पर किए गए थे ) और मूल 8.1 (OrizLab)। HV1 अवरोधक के विभिन्न सांद्रता वाले समाधान और कुछ मामलों में 10 मिमी ofme को गुरुत्वाकर्षण द्वारा स्नान में एक वीसी -6 परफ्यूजन वाल्व सिस्टम (वार्नर इंस्ट्रक्शन) से जुड़े कई गुना के माध्यम से पेश किया गया था, जो कि PCLAMP सॉफ्टवेयर TTL (ट्रांजिस्टर-- ट्रांजिस्टर- के माध्यम से पारित किया गया था- ट्रांजिस्टर लॉजिक) सिग्नल। रैपिड परफ्यूजन प्रयोगों को एक मल्टी-ट्यूब परफ्यूजन पेंसिल (स्वचालित विज्ञान) का उपयोग करके किया गया था। एक पैच विंदुक के सामने 360 माइक्रोन व्यास वितरण टिप के साथ। +120 mV depolarizing pulse.gv मापों को पहले वर्णित किया गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया था। वर्तमान क्षय 18 के लिए सही करने के लिए उपयोग किया जाता है। जीवी ग्राफ बोल्ट्जमैन समीकरण को फिट करता है: चैनलों और अवरोधकों के विभिन्न संयोजनों के लिए स्पष्ट पृथक्करण स्थिरांक (केडी) (पूरक तालिका 1) को निषेध (औसत %अवरोध मान) की एकाग्रता निर्भरता को फिट करके निर्धारित किया गया था। पहाड़ी समीकरण के साथ: जहां [i] अवरोधक I और H की एकाग्रता है, पहाड़ी गुणांक है। पहाड़ी गुणांक की गणना करें, समीकरण (2) के रूप में पुनर्व्यवस्थित किया गया है: