Ispitivanje međupodjediničnog sučelja otvorenog protonskog kanala Hv1 s alosterički spregnutom sondom

Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način rada kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako biste osigurali nastavak podrške, web mjesto ćemo prikazati bez stilova i JavaScripta. Naponski protonski kanal Hv1 dimerni je kompleks koji se sastoji od dvije domene osjetljive na napon (VSD), od kojih svaka sadrži put propusnosti zatvorenog protona. Dimerizaciju kontrolira citoplazmatska namotana domena. Prijelaz iz zatvorenog stanja u poznato je da se otvoreno stanje u oba VSD-a pojavljuje kooperativno; međutim, malo se zna o temeljnim mehanizmima. Međupodjedinična sučelja igraju ključnu ulogu u alosteričkim procesima; međutim, takva sučelja nisu identificirana u otvorenim Hv1 kanalima. Ovdje pokazujemo da derivati ​​2-gvanidinotiazola blokiraju dva Hv1 VSD-a na kooperativan način i koriste jedan od ovih spojeva kao sondu za alosterično spajanje između otvorenih podjedinica. Otkrili smo da izvanstanični kraj prvog transmembranskog fragmenta VSD-a tvori međupodjedinično sučelje koje posreduje u povezivanju između veznih mjesta, dok domena zavojnice nije izravno uključena u ovaj proces. Također smo pronašli čvrste dokaze da proton-selektivni filtar kanala kontrolira kooperativnost vezanja blokatora . Naponski protonski kanali igraju važnu ulogu u raznim organizmima, od fitoplanktona do ljudi1. U većini stanica ti kanali posreduju pri istjecanju protona iz protonske membrane i reguliraju aktivnost NADPH oksidaze. Jedini poznati naponski protonski kanal kod ljudi je Hv1, koji je proizvod gena HVCN1 2,3. Pokazalo se da Hv1 (aka VSOP) ima ulogu u proliferaciji B stanica4, proizvodnji reaktivnih vrsta kisika od strane urođenog imunološkog sustava5,6,7,8, spermijskih stanica motilitet9 i regulacija pH površinske tekućine dišnih putova10. Ovaj kanal je uključen u nekoliko prekomjerno izraženih tipova raka kao što su maligne bolesti B-stanica4,11 i karcinom dojke i debelog crijeva12,13. Utvrđeno je da prekomjerna aktivnost Hv1 povećava metastatski potencijal stanica raka 11,12. U mozgu se Hv1 eksprimira mikroglijom, a pokazalo se da njegova aktivnost pogoršava oštećenje mozga u modelima ishemijskog moždanog udara. Protein Hv1 sadrži domenu osjetljivu na napon (VSD), koja se sastoji od četiri transmembranska segmenta nazvana S1 do S414. VSD nalikuje odgovarajućim domenama naponskih Na+, K+ i Ca2+ kanala i naponski osjetljivih fosfataza, kao što je CiVSP iz Ciona gutis15. U ovim drugim proteinima, C-završetak S4 je vezan za efektorski modul, domenu pora ili enzim. U Hv1, S4 je povezan s domenom zavojnice (CCD) koja se nalazi na citoplazmatskoj strani membrane. .Kanal je dimerni kompleks koji se sastoji od dva VSD-a, od kojih svaki sadrži zatvorenu stazu protonske permeacije16,17,18. Utvrđeno je da se ove dvije Hv1 podjedinice otvaraju kooperativno19,20,21,22, što sugerira da igraju alosteričko spajanje i interakcije između podjedinica važnu ulogu u procesu usmjeravanja. Sučelje između podjedinica unutar namotane domene zavojnice je dobro definirano jer su kristalne strukture dviju izoliranih domena dostupne22,23. S druge strane, sučelje između VSD-ova unutar membrane nije dobro razumio. Kristalna struktura himernog proteina Hv1-CiVSP ne pruža informacije o ovom međusklopu, budući da trimerna organizacija kompleksa kristaliziranog kanala može biti rezultat zamjene izvornog Hv1 CCD patentnim zatvaračem leucina kvasca GCN424. Nedavna studija o organizaciji podjedinice kanala Hv1 zaključila je da dvije spirale S4 prelaze u CCD bez ozbiljnih poremećaja sekundarne strukture, što rezultira dugim spiralama koje polaze od membrane i strše u citoplazmu. Na temelju analize cisteinskog umrežavanja, ova studija predlaže da Hv1 VSD-ovi kontaktiraju jedan s drugim duž S4 segmenta. Međutim, druge studije su predložile alternativna sučelja između VSD-a. Ova sučelja uključuju S1 segmente 17, 21, 26 i vanjske krajeve S2 segmenta 21. Mogući razlog za sukob Rezultati ovih studija su da je alosterično spajanje između VSD-ova ispitano u odnosu na proces usmjeravanja, koji ovisi o zatvorenim i otvorenim stanjima, a sučelje između VSD-ova može varirati u različitim promjenama stanja u konformaciji. Ovdje smo otkrili da 2-gvanidinotiazol inhibira Hv1 kanale sinergističkim vezanjem na dva otvorena VSD-a i upotrijebili smo jedan od spojeva, 2-gvanidinobenzotiazol (GBTA), da ispitamo interakciju između podjedinica u otvorenom stanju. otkrili smo da se krivulja vezanja GBTA može dobro opisati kvantitativnim modelom u kojem vezanje inhibitora na jednu podjedinicu rezultira povećanjem afiniteta vezanja susjedne podjedinice. Također smo otkrili da ostaci D112, selektivnost filtriraju za kanal 27, 28 i dio veznog mjesta derivata gvanidina 29 kontroliraju kooperativnost vezanja GBTA. Pokazali smo da se kooperativno vezanje održava u dimeru Hv1, gdje se CCD odvaja od segmenta S4, sugerirajući da međupodjedinično sučelje u CCD-u ne djeluje izravno na posreduje u alosteričnom povezivanju između GBTA-vezujućih mjesta. Nasuprot tome, nalazimo da je S1 fragment dio sučelja između podjedinica i predlažemo raspored susjednih VSD-ova s ​​izvanstaničnim krajem S4 spirale udaljenim od središta dimera kako bi se omogućilo da fragment S1 bude u otvorenom stanju. Inhibitori Hv1 malih molekula korisni su kao lijekovi protiv raka i neuroprotektivna sredstva. Međutim, do danas je nekoliko spojeva uspjelo inhibirati kanal30,31,32,33. Među njima, 2-gvanidinobenzimidazol (2GBI, spoj [1] na slici 1a) i njegovi derivati ​​blokiraju prolazak protona VSD29,32 kroz kanal. Smatra se da se vezanje takvih spojeva odvija neovisno u dvije otvorene podjedinice. 2-gvanidinobenzotiazol (GBTA, spoj [2] na slici 1a) bio je ranije je pokazano da inhibira Hv1 gotovo jednako učinkovito kao 2GBI kada je testiran u koncentraciji od 200 μM (Slika 1b). Ispitali smo druge derivate tiazola i otkrili da neki od njih inhibiraju kanal sa sličnom ili većom snagom od GBTA (Slika 1 i Dodatna tekst). Odredili smo krivulje odziva koncentracije četiriju derivata tiazola (GBTA i spojeva [3], [6] i [11], slika 1c) i otkrili da su strmije od onih za 2GBI. Hillovi koeficijenti (h) derivata tiazola kretao se od 1,109 ± 0,040 do 1,306 ± 0,033 (Sl. 1c i dopunska slika 1). Nasuprot tome, Hillov koeficijent za 2GBI bio je 0,975 ± 0,024 29, slika 2a i dopunska slika 1). Hillov koeficijent iznad 1 ukazuje na kooperativnost vezanja. Budući da svaka Hv1 podjedinica ima vlastiti inhibitor- veznog mjesta,29,32 zaključili smo da bi vezanje derivata tiazola na jednu podjedinicu moglo poboljšati vezanje druge molekule inhibitora na susjednu podjedinicu. GBTA je bio testni spoj s najvećim Hillovim koeficijentom. Stoga smo odabrali ovaj spoj za dalje proučavali mehanizam sinergije vezanja i koristili 2GBI kao referentnu negativnu kontrolu. (a) Ispitivani spojevi: [1] Referentni Hv1 inhibitor 2-gvanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-gvanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)gvanidin, [4] nafto[1,2-d][1,3] tiazol-2-il -gvanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)gvanidin, [6](5-brom-4-metil-1,3-tiazol-2-il)gvanidin, [7] famotidin, [8] 2-gvanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-etil ester karboksilne kiseline, [9] 2-gvanidino-4-metil etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10 ](2-gvanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil acetat, [11]1-[4-(4-klorfenil)-1,3-tiazol-2-il]gvanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]gvanidin. (b) Inhibicija ljudske Hv1 aktivnosti naznačenim gvanidinotiazolima i referentnim spojem 2GBI (plavo-zelene trake) .Hv1 protonske struje mjerene su u plakovima oocita Xenopus okrenutim prema unutra kao odgovor na depolarizaciju od potencijala zadržavanja od -80 mV do +120 mV. Svaki inhibitor je dodan u kupku u koncentraciji od 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Podaci su srednji ±SEM (n≥4).(c) Inhibicija ljudskog Hv1 ovisna o koncentraciji spojevima [2], [3], [6] i [11]. Svaka točka predstavlja srednju vrijednost inhibicije ± SD od 3 do 15 mjerenja. Linija je Hill fit koji se koristi za dobivanje prividnih Kd vrijednosti navedenih u Dodatnoj tablici 1. Hillovi koeficijenti su određeni iz fitova navedenih u Dodatnoj slici 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (vidi Metode). (a,b) Spojevi 2GBI i GBTA inhibirali su dimerni i monomerni Hv1 na način ovisan o koncentraciji. Svaka točka predstavlja srednju inhibiciju ± SD od 3 do 8 mjerenja, a krivulja je Hill fit. Hillovi koeficijenti (h) prikazani u umetnuti histogrami određeni su iz prilagodbi navedenih u Dodatnim slikama 3 i 4. Koncentracijski odziv GBTA prikazan na (a) isti je kao onaj na slici 1c. Vidi dodatnu tablicu 1 za prividne vrijednosti Kd. (c) Modeliranje kooperativno vezanje GBTA na dimerni Hv1. Puna crna linija predstavlja prilagodbu eksperimentalnim podacima jednadžbom (6), koja opisuje model vezanja prikazan u (d). Isprekidane linije označene Sub 1 i Sub 2 predstavljaju bimolekularnu povezanost - krivulje ravnoteže disocijacije prvog i drugog događaja vezanja (Pod1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Pod2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Shematski dijagram predloženog mehanizma Hv1 bloka. U slučaju GBTA, vezanje na jednu otvorenu podjedinicu povećava afinitet susjedne otvorene podjedinice (Kd2 0,05) smanjenje Hillovog koeficijenta vezanja GBTA na GGG kanale u usporedbi s divljim tipom (Sl. 5c), što sugerira da unatoč njegovoj ulozi u održavanju dvije podjedinice zajedno važne, ali CCD ne posreduje izravno među podjediničnim alosteričnim spajanjem između GBTA veznih mjesta. (a) Shematski dijagram Hv1 dimera s mutacijom triglicina na unutarnjem kraju S4 dizajniranom da prekine međupodjedinično spajanje posredovano citoplazmatskom namotanom domenom (plave strelice). (b) Shematski prikaz Hv1 dimera i ligacijskih dimera s naznačene mutacije, osmišljene za testiranje fragmenata S1 uključenih u spajanje između podjedinica (plave strelice). (c–h) 2GBI (cijan) i GBTA (tamnocrvena) inhibiraju naznačene konstrukte na način ovisan o koncentraciji. Svaka točka predstavlja srednju inhibiciju ± SD od 3 do 10 mjerenja. Krivulja je Hill fit korišten za dobivanje prividnih Kd vrijednosti (vidi dodatnu tablicu 1). Hillovi koeficijenti u interpoliranim histogramima određeni su kako je opisano u odjeljku Metode (vidi dodatne slike 3 i 4). Referentne h vrijednosti za Hv1 WT prikazani su isprekidanim linijama. Zvjezdice označavaju statistički značajne razlike između mutantnih i WT pasaža (p 0,05, slika 5d,i ) ). S druge strane, mutacija D123A značajno je smanjila Hillov koeficijent GBTA (p 0,05/14). Budući da je neutraliziranje naboja na poziciji 123 na obje podjedinice rezultiralo snažnom promjenom u kooperativnosti vezanja GBTA, dok je preokret naboja na obje podjedinice imao samo mali učinak, proširili smo analizu kako bismo uključili samo jednu podjedinicu s inverzijskim kanalom naboja. generirali Hv1-povezane dimere sa supstitucijom D123R u C-terminalnoj podjedinici (Slika 5b) i izmjerili inhibiciju koncentracije-odgovora pomoću GBTA i 2GBI. Otkrili smo da je Hillov koeficijent vezanja GBTA na WT-D123R kanale značajno viši od onog divljeg tipa Hv1 (p 0,05). Također smo otkrili da je u odsutnosti βME, Hillov koeficijent vezanja GBTA na dimer D112E I127C Hv1 bio značajno viši od onog izmjerenog u prisutnosti redukcijskih sredstava (slika 6e i dopunska slika 4), što implicira da mutacija D112E nije ukinuo povećanje kooperativnosti vezanja GBTA koja je rezultat unakrsnog povezivanja cisteina 127. Hillov koeficijent vezanja 2GBI na dimere D112E, I127C Hv1 također nije bio značajno pod utjecajem mutacije D112E (Slika 1).6d i dopunski Slika 3). Uzeti zajedno, ovi nalazi sugeriraju da je vezanje GBTA pojačano interakcijom između vanjskih krajeva S1 fragmenata u susjednim podjedinicama Hv1 kroz privlačne elektrostatske interakcije ili kroz stvaranje kovalentnih veza između supstituiranih cisteina. Alosterično spajanje između mjesta se povećava i rezultira kooperativnošću vezanja. Dok se učinak privlačnih elektrostatskih interakcija na kooperativnost može ukinuti mutacijom D112E, učinak kovalentnih veza ne može. U našem istraživanju kemijskog prostora dostupnog za vezanje derivata gvanidina na Hv1 kanale, otkrili smo da 2-gvanidinotiazoli poput GBTA imaju strmiju ovisnost o koncentraciji od 2-gvanidinobenzimidazola (Slika 1c). Analiza Hillovog koeficijenta vezanja GBTA na oba dimerna i monomerne kanale (Sl. 2a,b) i na dimerni kanal u kojem je jedna podjedinica bila unaprijed vezana za inhibitor (Sl. 4) doveli su nas do zaključka da je inhibicija Hv1 od strane GBTA Djelovanje sinergistički proces, i vezna mjesta spojeva u dvije podjedinice su alosterički povezana. Otkriće da se GBTA veže na otvoreni kanal, kao što je prethodno pokazano za srodni spoj 2GBI32, sugerira da se alosteričko spajanje može posebno procijeniti u otvorenom stanju. Naš model kooperativnog vezanja uspio kvantitativno opisati inhibiciju HV1 pomoću GBTA (Sl. 2C) i objasniti različite učinke 2GBI i GBTA na propadanje kanala repa nakon repolarizacije membrane, što podržava našu interpretaciju procesa vezanja. Maksimalni koeficijent brda koji se može postići u alosteričnom proteinu s dva mjesta vezanja (poput HV1) je 2. Izmjereni smo GBTA za vezanje HV1 divljeg tipa s koeficijentom od 1,31, koji se povećao na 1,88 u HV1 i127c.the Sinergistička slobodna energija, razlika između energije bez vezanja na najnižim i najvišim afinitetnim mjestima (vidi metode), bila je 1,3 kcal/mol u slučaju HV1 divljeg tipa i 2,7 kcal/mola u slučaju hv1 i127c. od kisika do hemoglobina najpoznatiji je i dobro proučen primjer suradničkog procesa38. za ljudski hemoglobin (tetramer s četiri alosterično povezana mjesta vezanja), koeficijent brda kreće se od 2,5-3,0, s vrijednostima u rasponu od 1,26 do 3,64 KCAL/Mol, ovisno o eksperimentalnim uvjetima38.Th, u smislu globalne energetike, kooperativnost vezanja GBTA na HV1 ne razlikuje se značajno od onog vezanja O2 na hemoglobin kada se razmatra različiti broj podjedinica proteina u dva sustava. U našem modelu sinergije, vezanje GBTA molekula na jednu podjedinicu rezultira povećanjem afiniteta vezanja susjedne podjedinice. Zamišljamo postupak u kojem je preuređivanje okoliša vezanja koji je posljedica prvog događaja vezanja (inducirano fit) dovodi do Promjene u interakcijama između podjedinica. U odgovoru na ove promjene, susjedne podjedinice mijenjaju mjesta vezanja, što rezultira čvršćim vezanjem GBTA -e. Nadajući ovaj postupak, S1 aspartat D112 odgovoran je za preuređivanje mjesta vezanja povezanog s povećanom afinitetom vezanja.D112 prethodno je pokazano da je dio propusnosti protona HV1 i djelovao kao filter selektivnosti27,28. Naši rezultati pokazuju da su filtri selektivnosti u dvije HV1 podjedinice alosterično povezani u otvorenom stanju.Figure 7A prikazuje približno mjesto mjesta za vezanje GBTA i mjesto ostataka D112, D123, K125 i I127 na shemi sa sjedištem u HV1 VSD Na kristalnoj strukturi HV1-CIVSP himere. Upućeni smjerovi za alosteričnu spojku koji uključuju izvanstanični kraj S1 prikazani su s crnim strelicama. (A) Shema HV1 VSD.Bota na kristalnoj strukturi HV1-CIVSP himere, pokazuje se da su spiralni segmenti cilindrični. U ovoj konfiguraciji, unutarnji kraj S4 segmenta spaja se s CCD-om (nije prikazan). Predviđena mjesta vezane GBTA prikazane su kao sivi ovali.Black strelice označavaju putove koji su uključeni u alosteričnu spajanje između mjesta vezanja u dvije susjedne podjedinice. Položaji ispitivanih ostataka S1 označeni su obojenim sferama. (B) Shematski prikaz HV1 podjedinica uređenih U dvije različite konfiguracije dimera kao što se vidi s izvanstanične strane ravnine membrane. Na lijevoj ploči, dimer sučelje formira S4 spiralu. Uređaj dva VSD -a 20 stupnjeva u smjeru kazaljke na satu oko osi okomito na ravninu membrane, uz to Odvajanje vanjskih krajeva dviju S4 helikonja (isprekidane strelice) proizvodi raspored prikazan s desne strane. U ovoj konfiguraciji, ostaci D123 i I127 iz susjednih podjedinica dopušteno je da se zbliže. (C) Shematski prikaz civsp VSD U konfiguraciji dimera pronađena u kristalnoj strukturi 4G80.pozicija P140 u Civsp odgovara položaju D123 u HV1. Naši rezultati pokazuju da je odbojna elektrostatička interakcija između ostatka 123 (123D/123D ili 123R/123R) povezana s "normalnom" razinom kooperativnosti koja veže GBTA u otvorenom stanju i mijenja interakciju od odbijanja na privlačenu (123d/123R) , povećana suradnja (Sl. 5G). Očekuje se da bi uklanjanje odbojne interakcije sa supstitucijom alanina također dovelo do povećane kooperativnosti. Međutim, zabilježeno je smanjenje kooperativnosti dimera 123A/123A (Sl. 5E). Objašnjenje je da destabilizirajući učinak stavljanja hidrofobnih ostataka u hidrofilno okoliš može nadmašiti stabilizacijski učinak zbog uklanjanja odbojnih interakcija između ostataka D123, što je rezultiralo ukupnim smanjenjem kooperativnosti vezanja. Položaj D171 Ciona Gutis CI-HV1 (što odgovara D123 u ljudskom HV1) povećava se nakon aktivacije, podržavajući ideju da se D123 nalazi u hidrofilnom okruženju u otvorenom stanju. Poznato je da se pojavljuje HV1 kanale kroz više prijelaza19,20,26,39,40,41 .qiu i sur .26 utvrdili su da nakon depolarizacije membrane, naponski senzor CI-HV1 podliježe konformacijskoj promjeni koja ostavlja kanal aktiviran, ali još uvijek zatvoren, ali još uvijek zatvoren , nakon čega je uslijedio poseban prijelaz koji uzrokuje otvaranje protona u obje podjedinice. Konformacijska promjena naponskog senzora praćena je fluorescencijom napona, a utvrđeno je da je drugi prijelaz selektivno uznemiren mutacijom na položaju D171. Poremećaj fluorescentnog signala u skladu je s prisutnošću elektrostatičkih interakcija između D171 ostataka susjednih podjedinica u nekom trenutku duž reakcijskih koordinacija konformacijske promjene. Ova interpretacija je u skladu s nalazom da D123 ostatak elektrostatski djeluje u otvorenom stanju i posreduje alosterično spajanje između mjesta vezanja GBTA. Fujiwara i sur .25 predložili su da se dimer sučelje citoplazmatske domene namotane zavojnice proteže u membranu da bi se sadržavalo dva S4 helikopter (Sl. 7b, lijeva ploča). A model ove intersunitne interakcije temelji se na analizi cisteina umrežavanja pokriva Čitava VSD i funkcionalna analiza regije koja povezuje S4 spiralu i CCD. U odsutnosti transmembranskog pH gradijenta, HV1 kanali zahtijevaju značajnu depolarizaciju membrane za otvaranje, a cisteinsko umrežavanje se pojavljuje u uvjetima gdje je kanal pretežno zatvoren. Stoga, otkriveno sučelje S4-S4 vjerojatno odražava konfiguraciju podjedinice izvan stanja. Ostala su studija otkrila dokaze o uključenosti S1 i S2 u intersubinit interakcijama tijekom GATING17,21,26, što sugerira da kanali mogu usvojiti različite konfiguracije podjedinica na otvorenom i Zatvorena stanja, ideja koja je u skladu s nalazima Mony i sur. S1 se kreće 39 tijekom rezanja. Ovdje pokazujemo da su u otvorenom stanju izvanstanični krajevi S1 spirale dovoljno blizu da podržavaju izravne elektrostatske interakcije koje posreduju alosterično spajanje između podjedinica. U konfiguraciji dimera s proširenim S4-S4 interakcijama, S1 Helics su predaleko Osim međusobno za izravno interakciju. Međutim, rotacija dviju VSD podjedinica od 20 ° u smjeru kazaljke na satu oko membrane okomito, u kombinaciji s odvajanjem vanjskih krajeva dviju S4 helikonja, dala je konfiguraciju S1-S1 konfiguraciju s našim nalazima (Sl. 7b, desna ploča). Preporučujemo ovu konfiguraciju za kanal u otvorenom stanju. Iako se smatra da je civsp enzim funkcionirao kao monomer, kristalna struktura njegovog izoliranog VSD -a zarobljena je u dimer stanju. Vanjski krajevi S1 helikopter u ovom dimeru su prostorno bliski, a cjelokupna konfiguracija je slična onoj predloženom Za HV1 (Sl. 7C). U dimeru Civsp, najbliži ostatak iz susjedne podjedinice bio je prolin na položaju 140 (Sl. 7C). Uvjerljivo, P140 u Civsp -u odgovara položaju D123 u Hv1.. Sličnost u konfiguraciji podjedinice između HV1 i CIVSP Dimers sugerira da VSD -ovi ovih proteina imaju unutarnju tendenciju formiranja sučelja u kojem djeluju izvanstanični krajevi S1. Bitna uloga HV1 u aktivaciji spermatorskih stanica čini ovaj kanal atraktivnim ciljem lijeka za kontrolu plodnosti muške plodnosti. Utvrđeno je da aktiviranje HV1 u mikrogliji pogoršava oporavak od ishemijskog moždanog udara. Utvrđeno je da je aktivnost Hv1 povezana s nižim nižim Preživljavanje u bolesnika s dojkom 12 ili kolorektalnim karcinomom 13, a smatra se da doprinose zlonamjernošću B-stanica 11., dakle, lijekovi za male molekule koji ciljaju HV1 mogu se koristiti kao neuroprotektivna sredstva ili terapeutike protiv raka. Otvorena HV1 podjedinica, što dovodi do povećanog afiniteta vezanja, može dovesti do razvoja moćnijih lijekova koji ciljaju HV1 kanale. Mutageneza ljudskog HV1 usmjerena na mjesto provedena je korištenjem standardnih PCR tehnika. U konstructu HV1NCCIVSP, ostaci 1-96 i 228-273 HV1 zamijenjeni su ostacima 1-113 i 240-576 od civsp18.U dimeru vezanom za HV1, C-kraj jedne podjedinice povezan je s N-terminusom druge podjedinice kroz veznik GGSGGSGSGSGGGGSGG. T7 MMESSAGE MMACHINE TRANSPRICTION KIT (Ambion) .1-3 dana prije elektrofizioloških mjerenja, CRNA je ubrizgana u oocite Xenopus (50 nL po stanici, 0,3-1,5 µg/μl). Iz bioznanosti ekocita. Ubrizgavanje RNA, stanice su održavane u mediju Nd96 koji sadrži 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM kakl, 1 mM mgCl, 10 mM HEPES, 5 mM piruvata, 100 µg/ml gentamicina, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzothiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) gvanidin [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -tiazol-2-il) gvanidin) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilat [8], etil 2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol--tiazol- 5-karboksilat [9] i (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) etil acetat [10] bili su iz Sigma-Aldrich.famotidina [7] iz MP biomedicina.1- [4 -(4-klorofenil) -1,3-tiazol-2-il] gvanidin [11] i 1- [4- (3,4-dimetoksifenil) -1,3-tiazol-2-il] gvanidin [12] bio je bio gvanidin [12] iz matrice znanstvene. Ovi spojevi su od najveće čistoće komercijalno dostupne. Otopili su se u suhom DMSO -u kako bi se stvorilo 100 mM zalihe, koja je zatim razrijeđena u otopini za snimanje u željenoj konačnoj koncentraciji. najmanje 99% čistoće. Na suspenziju 2-amino-4- (trifluorometil) benzenetiol hidroklorid (1,02 g, 4,5 mmol) u 25 ml vodene klorovodične kiseline (2,5 n) dodana je čvrsta diciandiamid (380 mg, 4,5 mmol) i rezultirajući HMOLSENE bio je reflektiran snažnim miješanjem 4 sata. Reakcijska smjesa ohlađena je na sobnu temperaturu i neutralizirana postupnim dodavanjem 10N kalijevog hidroksida. Formirani bijeli talog filtriran je, ispravan hladnom vodom (3 × 50 ml), osušena u pećnici ( 65 ° C) nekoliko sati, a zatim rekristalizirano iz etil acetata/naftnog etera kako bi se dobila bijela kruta tvar (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (svjetlost 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7,25 (vrlo široki S, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (d, j = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, j, J = 272 hz), 126.1 (q, q = 272 hz) = 31.6 hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): m/z izračunala vrijednost. Za C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, pronađeno : 261.0419. Naphtho [1,2-D] Thiazol-2-amine (300 mg, 1,5 mmol), sintetiziran kako je prethodno opisano, zagrijan je na 200 ° C u uljnoj kupelji u maloj epruveti.300 mg (veliki višak) cijanamida i 1,0 ml koncentracije. Za vrući spoj dodan je brzo klorovodična kiselina, a smjesa se držala u uljnoj kupelji oko 2 minute, za koje je vrijeme većina vode isparila. Reakcijska smjesa je zatim ohlađena na sobnu temperaturu i rezultirajući učvršćeni materijal razbijen je u male komade i isprao vodom kako bi se osigurala blijedo žuta amorfna kruta tvar (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 hz) .13C nMr (150 MHZ, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): m/z izračunala vrijednost.for C12H11n4s (M + H) +: 243.069. , pronađeno: 243.0704. Protonske struje izmjerene su u unutarnjim i vanjskim zakrpama oocita koji eksprimiraju različite konstrukcije pomoću AXOPATCH 200B pojačala kontroliranog aksonom Digidata 1440A (Molekularni uređaji) sa softverom PCLAmp10.intracelularne i izvanćelijske otopine: 100 mm 2- (n-mm-mm-mm-mm (n-mM-MR-MR-MR-MR-MR-MR-MR-MR-MR-MR-MR-MR-MM-MR-MM-MM-MR-MM-MR-MM-MR-MM-MM-MM-M-MRFOLINO ) etanesulfonska kiselina (MES), 30 mM tetraetilamonija (čaj) mesilat, 5 mM čajnog klorida, 5 mM etilen glikol-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraocetska kiselina (npr. pH 6,0 s čajnim hidroksidom. Sva mjerenja izvedena su na 22 ± 2 ° C. Pipeta ima otpor pristupa 1,5–4 MΩ. Trajni tragovi filtrirani su na 1 kHz, uzorkovani na 5 kHz i analizirani s CLAMPFIT10.2 (Molekularni uređaji (Molekularni uređaji (Molekularni uređaji (molekularni uređaji ) i podrijetlo8.1 (OriginLab). Otopine koje sadrže različite koncentracije HV1 inhibitora, a u nekim slučajevima 10 mM βME uvedene su u kupku gravitacijom kroz razdjelnik spojen na VC-6 sustav perfuzijskih ventila (Warner Instru.), Koji je prošao kroz softver PCLAMP (Tranzistor- Logika tranzistora) Signali.Rapid perfuzijski eksperimenti izvedeni su korištenjem perfuzijske olovke s više cijevi (automatizacija znanosti) s vrhom isporuke promjera 360 µm, montiranom ispred patch pipete. Inhibicija kanala određena je izohronalnim amperometrijskim mjerenjima na kraju Mjerenja depolariziranja depolarizirajući impuls. Koristi se za ispravljanje propadanja struje 18. GV grafikon odgovara Boltzmannovoj jednadžbi: prividne konstante disocijacije (KD) za različite kombinacije kanala i inhibitora (dopunska tablica 1) određene su ugradnjom koncentracijske ovisnosti inhibicije (prosječne vrijednosti inhibicije)) S jednadžbom brda: gdje je [i] koncentracija inhibitora I i H je koeficijent brda. Za izračunavanje koeficijenta brda, jednadžba (2) se preuređuje kao: