Entèwogasyon nan koòdone nan entèsubunite nan kanal la pwoton Hv1 louvri ak yon sond allosterically makonnen

Mèsi paske w te vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò limite pou CSS.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa fèmen mòd konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire w sipò kontinye, nou pral montre sit la san estil ak JavaScript. Chanèl pwoton Hv1 vòltaj-gated se yon konplèks dimerik ki fòme ak de domèn vòltaj-sensing (VSD), yo chak gen yon chemen pèmeyasyon pwoton gated. Dimerization kontwole pa domèn nan bobin cytoplasmic. se eta a louvri nan tou de VSD yo konnen yo rive koperasyon; sepandan, yo konnen ti kras sou mekanism ki kache yo. Entèfas entèfas jwe yon wòl kle nan pwosesis allosteric; sepandan, koòdone sa yo pa te idantifye nan chanèl Hv1 ouvè. Isit la nou demontre ke dérivés 2-guanidinothiazole bloke de Hv1 VSD nan yon fason koperativ epi sèvi ak youn nan konpoze sa yo kòm yon ankèt pou kouple allosteric ant subunits louvri. fen premye fragman transmembran nan VSD fòme yon koòdone intersubunit ki medyatè kouple ant sit obligatwa, tandiske domèn nan bobin bobin pa patisipe dirèkteman nan pwosesis sa a. Nou te jwenn tou prèv fò ke filtè proton-selektif chanèl la kontwole koperasyon blocker-obligatwa. . Chanèl pwoton ki fèmen vòltaj jwe wòl enpòtan nan yon varyete òganis, ki soti nan fitoplankton rive nan moun1.Nan pifò selil yo, chanèl sa yo medyatè pwoton ekoulman nan manbràn pwoton an epi kontwole aktivite NADPH oksidaz. se Hv1, ki se pwodwi HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) yo te montre pou jwe yon wòl nan proliferasyon selil B4, pwodiksyon espès oksijèn reyaktif pa sistèm iminitè natirèl la5,6,7,8, selil espèm. mobilite9 ak regilasyon pH nan likid sifas Airway10. Chanèl sa a patisipe nan plizyè Overexpressed nan kalite kansè tankou B-selil malignities4,11 ak tete ak kansè kolorektal12,13.Twòp aktivite Hv1 yo te jwenn ogmante potansyèl la metastatik nan selil kansè yo 11, 12 .Nan sèvo a, Hv1 eksprime. pa microglia, ak aktivite li yo te montre agrave domaj nan sèvo nan modèl nan konjesyon serebral ischemic. Pwoteyin Hv1 a gen yon domèn vòltaj-sensing (VSD), ki gen ladann kat segman transmembrane ki rele S1 rive S414. Ciona gutis15.Nan lòt pwoteyin sa yo, tèminal C nan S4 tache ak yon modil efèktè, domèn nan pò oswa anzim.Nan Hv1, S4 lye nan domèn nan bobin bobin (CCD) ki sitiye sou bò sitoplasmik manbràn la. .Kanèl la se yon konplèks dimerik ki gen de VSD, yo chak genyen yon chemen pèmeyasyon pwoton gated16,17,18.Sa yo te jwenn de Hv1 sou-inite yo louvri koperativman19,20,21,22, sijere ke kouple allosteric ak entèraksyon entè-sous-inite jwe. yon wòl enpòtan nan pwosesis la gating.Koòdone ant subunits yo nan domèn nan bobin bobin byen defini paske estrikti yo kristal nan de domèn izole yo disponib22,23.Nan lòt men an, koòdone ki genyen ant VSD nan manbràn nan se pa. byen konprann.Estrikti kristal Hv1-CiVSP pwoteyin chimerik la pa bay enfòmasyon sou koòdone sa a, kòm òganizasyon trimerik konplèks chanèl kristalize a ka rezilta nan ranplasman Hv1 CCD natif natal pa ledven leucine zip GCN424 la. Yon etid resan sou òganizasyon an subunit nan kanal Hv1 konkli ke de elis S4 tranzisyon nan CCD a san yo pa dezòd grav nan estrikti segondè, sa ki lakòz elis long ki kòmanse soti nan manbràn nan ak pwojè nan sitoplasm la. tid sa a pwopoze ke Hv1 VSD yo kontakte youn ak lòt sou segman S4 la.Sepandan, lòt etid yo te pwopoze koòdone altènatif ant VSD yo.Koòdone sa yo gen ladan segman S1 17, 21, 26 ak pwent yo deyò nan segman S2 21.Yon rezon posib pou konfli a. rezilta etid sa yo se ke kouple allosteric ant VSD yo te egzamine an relasyon ak pwosesis la gating, ki depann sou eta yo fèmen ak louvri, ak koòdone ki genyen ant VSD yo ka varye nan diferan eta chanjman nan konfòmasyon. Isit la, nou te jwenn ke 2-guanidinothiazole inibit chanèl Hv1 pa synergistically obligatwa nan de VSDs louvri, epi yo itilize youn nan konpoze yo, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), pou sonde entèraksyon ki genyen ant subunits nan eta a louvri. koòdone.Nou te jwenn ke koub la obligatwa GBTA ka byen dekri pa yon modèl quantitative nan ki obligatwa nan yon inibitè nan yon sèl rezilta nan yon ogmantasyon nan afinite nan obligatwa nan subunit la adjasan.Nou te jwenn tou ke résidus D112, filtè selektivite pou la. chanèl 27, 28 ak yon pati nan sit la obligatwa guanidine dérivés 29 kontwole GBTA obligatwa koperasyon.Nou montre ke se obligatwa koperativ konsève nan Hv1 dimer la, kote CCD a separe de segman S4 la, sijere ke koòdone nan intersubunit nan CCD a pa dirèkteman. medyatè kouple allosterik ant sit GBTA-obligatwa. Kontrèman, nou jwenn ke fragman S1 a se yon pati nan koòdone ki genyen ant subinite yo epi pwopoze yon aranjman nan VSD adjasan ak fen ekstraselilè nan helix S4 la lwen sant la nan dimè a pou pèmèt fragman S1 a dwe nan eta a louvri. Ti inibitè molekil Hv1 yo itil kòm dwòg antikansè ak ajan neuroprotective.Sepandan, jiska dat, kèk konpoze yo te kapab anpeche kanal la 30,31,32,33.Pami yo, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, konpoze [1] nan Figi). 1a) ak dérivés li yo te jwenn bloke VSD29,32 pèmeyasyon nan pwoton nan kanal la. Liaison nan konpoze sa yo te panse yo rive poukont yo nan de sousinite yo louvri.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, konpoze [2] nan Figi 1a). deja montre yo anpeche Hv1 prèske menm jan ak 2GBI lè yo teste nan yon konsantrasyon 200 μM (Figi 1b). Nou egzamine lòt dérivés thiazole epi nou jwenn ke kèk nan yo inibit kanal la ak pisans ki sanble oswa pi gwo pase GBTA (Figi 1 ak siplemantè). tèks).Nou te detèmine koub repons konsantrasyon kat dérivés thiazole (GBTA ak konpoze [3], [6] ak [11], Fig. 1c) epi nou te jwenn ke yo te pi apik pase sa yo ki nan 2GBI.Koyefisyan Hill yo (h) nan dérivés thiazole te varye ant 1.109 ± 0.040 a 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c ak Figi Siplemantè 1).Okontrè, koyefisyan Hill pou 2GBI te 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a ak Fig. Siplemantè 1).Yon koyefisyan Hill ki pi wo a 1 endike koperatif obligatwa. sit obligatwa,29,32 nou te rezone ke obligatwa a nan yon dérivés thiazole nan yon sèl sou-inite ta ka amelyore lyezon an nan yon molekil inibitè dezyèm nan subunit la adjasan.GBTA te konpoze tès la ak koyefisyan Hill ki pi wo a. plis etidye mekanis nan sinèrji obligatwa ak itilize 2GBI kòm yon referans kontwòl negatif. (a) Konpoze tès yo: [1] Referans Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic asid etil ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4-Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Anpèchman aktivite Hv1 imen pa guanidinothiazoles ki endike yo ak konpoze referans 2GBI (ba ble-vèt) .Hv1 pwoton kouran yo te mezire nan plak andedan-deyò nan oosit Xenopus an repons a depolarize soti nan yon potansyèl kenbe nan -80 mV a +120 mV. Yo te ajoute chak inibitè nan beny lan nan yon konsantrasyon nan 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Done yo vle di ± SEM (n≥4). (c) Anpèchman depandan de konsantrasyon nan Hv1 imen pa konpoze [2], [3], [6] ak [11]. Chak pwen reprezante anpèchman an vle di ± SD nan 3. a 15 mezi. Liy la se yon anfòm Hill yo itilize pou jwenn valè aparan Kd yo rapòte nan Tablo siplemantè 1. Koefisyan Hill yo te detèmine nan adapte yo rapòte nan Figi siplemantè 1: h (1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033, h (3) = 1.25 ± 0.07, h (6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (gade Metòd). (a,b) Konpoze 2GBI ak GBTA anpeche Hv1 dimerik ak monomerik nan yon fason ki depann de konsantrasyon. Chak pwen reprezante anpèchman an mwayèn ± SD nan 3 a 8 mezi ak koub la se yon anfòm Hill. Koefisyan Hill yo (h) yo montre nan istogram yo mete yo te detèmine nan adapte yo rapòte nan Fig Siplemantè 3 ak 4. Repons konsantrasyon GBTA yo montre nan (a) se menm jan ak sa ki nan Fig. 1c.Gade Tablo Siplemantè 1 pou valè Kd aparan. (c) Modèl obligatwa koperativ GBTA ak dimerik Hv1.Liy nwa solid la reprezante anfòm nan done eksperimantal la pa ekwasyon (6), ki dekri modèl obligatwa yo montre nan (d).Liy tirè ki make Sub 1 ak Sub 2 reprezante asosyasyon bimolekilè. -disosyasyon koub ekilib premye ak dezyèm evènman obligatwa yo, respektivman (Sub 1: OO + B ⇄ BO *, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO * + B ⇄ B * O *, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Dyagram eskematik mekanis yo pwopoze a nan blòk Hv1 la.Nan ka GBTA, obligatwa nan yon sèl sousinite louvri ogmante afinite nan sousinite adjasan louvri a (Kd2 0.05) nan koyefisyan Hill nan GBTA obligatwa nan chanèl GGG konpare ak kalite sovaj (figi 5c), ki sijere ke malgre wòl li nan kenbe la. de subunit ansanm enpòtan, men CCD pa dirèkteman medyatè intersubunit allosteric kouple ant GBTA sit obligatwa. (a) Dyagram eskematik dimè Hv1 la ak yon mitasyon triglizin nan fen enteryè S4 ki fèt pou deranje kouple intersubunit la medyatè pa domèn bobin cytoplasmic (flèch ble). endike mitasyon yo, ki fèt pou teste fragman S1 ki enplike nan kouple ant subinite (flèch ble).(c–h) 2GBI (cyan) ak GBTA (wouj fonse) anpeche konstwi ki endike yo nan yon fason ki depann de konsantrasyon. Chak pwen reprezante anpèchman an vle di. ± SD nan 3 a 10 mezi. Koub la se te yon Hill anfòm ki te itilize pou jwenn valè aparan Kd (gade Tablo siplemantè 1). Koefisyan Hill nan istogram entèpolasyon yo te detèmine jan sa dekri nan seksyon an Metòd (al gade Fig Siplemantè 3 ak 4). Referans h valè pou Hv1 WT yo montre kòm liy tirè. Asterisk endike diferans estatistik enpòtan ant pasaj mutan ak WT (p 0.05, Fig. 5d, i). ). Nan lòt men an, mitasyon D123A siyifikativman redwi koyefisyan Hill nan GBTA (p 0.05/14). Depi netralizasyon chaj la nan pozisyon 123 sou tou de subinite yo te lakòz yon gwo chanjman nan GBTA obligatwa koperasyon, pandan y ap ranvèse chaj la sou tou de subinite yo te gen sèlman yon ti efè, nou pwolonje analiz la pou enkli sèlman yon sèl sou inite ak chanèl envèsyon chaj la. pwodwi Hv1-lye dimers ak sibstitisyon D123R nan subunit C-tèminal la (figi 5b) ak mezire anpèchman konsantrasyon-repons pa GBTA ak 2GBI.Nou te jwenn ke koyefisyan Hill nan GBTA obligatwa nan chanèl WT-D123R te siyifikativman pi wo pase sa. nan Hv1 kalite sovaj (p 0.05). Nou te jwenn tou ke nan absans βME, koyefisyan Hill nan GBTA obligatwa nan D112E I127C Hv1 dimè a te siyifikativman pi wo pase sa ki mezire nan prezans ajan diminye (Fig. 6e ak Fig. Siplemantè 4), sa vle di ke mitasyon D112E a. pa t 'aboli ogmantasyon nan GBTA obligatwa koperasyon ki soti nan kwa-linking nan sistein 127.Koyefisyan Hill nan 2GBI obligatwa nan D112E, I127C Hv1 dimè yo pa te tou siyifikativman afekte pa mitasyon an D112E (Figi 1).6d ak siplemantè. Fig. 3). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke GBTA obligatwa amelyore pa entèraksyon ki genyen ant pwent ekstèn nan fragman S1 nan subinite Hv1 adjasan atravè entèraksyon elèktrostatik atire oswa atravè fòmasyon nan lyezon kovalan ant sistein ranplase koupi allosterik ant sit ogmante ak rezilta nan koperasyon obligatwa. Pandan ke efè a nan entèraksyon elèktrostatik atire sou koperasyon ka aboli pa mitasyon D112E, efè a nan lyezon kovalan pa kapab. Nan eksplorasyon nou an nan espas chimik ki disponib pou obligatwa dérivés guanidine nan chanèl Hv1, nou te jwenn ke 2-guanidinothiazoles tankou GBTA gen yon depandans konsantrasyon pi apik pase 2-guanidinobenzimidazoles (figi 1c). ak chanèl monomerik (Fig. 2a, b) ak nan kanal la dimerik kote yon sèl sou-inite te pre-mare nan inibitè a (Fig. 4) te mennen nou konkli ke anpèchman nan Hv1 pa GBTA Aksyon an se yon pwosesis sinèrjetik, ak sit yo obligatwa nan konpoze yo nan de subinite yo se allosterically makonnen.Dekouvèt la ke GBTA mare nan kanal la louvri, jan yo montre deja pou konpoze an ki gen rapò 2GBI32, sijere ke kouple allosteric ka espesyalman evalye nan eta a louvri.Modèl koperativ obligatwa nou an. te kapab quantitatively dekri anpèchman an nan HV1 pa GBTA (Fig. 2C) epi eksplike efè yo diferan nan 2GBI ak GBTA sou pouri anba tè a nan chanèl chanèl ke apre repolarizasyon manbràn, ki sipòte entèpretasyon nou nan pwosesis la obligatwa. Koyefisyan an ti mòn maksimòm ki ka reyalize nan yon pwoteyin allosteric ak de sit obligatwa (tankou HV1) se 2.Nou mezire GBTA mare HV1 sovaj-kalite ak yon koyefisyan nan 1.31, ki ogmante a 1.88 nan HV1 I127C. Enèji gratis sinèrjetik, diferans ki genyen ant enèji yo obligatwa gratis nan sit sa yo ki pi ba ak pi wo (gade metòd), te 1.3 kcal/mol nan ka HV1 sovaj-kalite ak 2.7 kcal/mol nan ka a nan HV1 I127C. nan oksijèn nan emoglobin se egzanp ki pi popilè ak byen etidye nan pwosesis kolaborasyon38.Pou emoglobin imen (yon tetramè ak kat alosterikman makonnen sit obligatwa), koyefisyan an mòn chenn nan 2.5-3.0, ak valè sòti nan 1.26 a 3.64 Kcal/mol, tou depann de kondisyon eksperimantal38.thus, an tèm de enèjik mondyal, koperativite nan GBTA obligatwa nan HV1 se pa anpil diferan de sa yo ki an O2 obligatwa nan emoglobin lè nimewo yo diferan nan subunit pwoteyin nan de sistèm yo yo konsidere. Nan modèl sinèrji nou an, obligatwa nan molekil GBTA nan yon sèl subunit rezilta nan yon ogmantasyon nan vokasyon an obligatwa nan subunit adjasan an.Nou anvizaje yon pwosesis nan ki yon rmaniman nan anviwònman an obligatwa ki soti nan premye evènman an obligatwa (induit anfòm) mennen nan Chanjman nan entèraksyon ki genyen ant subunits.in repons a chanjman sa yo, subunit adjasan chanje sit obligatwa yo, sa ki lakòz pi sere GBTA obligatwa.Prè pwosesis sa a, S1 aspartate D112 la responsab pou rmaniman nan sit la obligatwa ki asosye ak ogmante obligatwa.D112 te deja montre yo dwe yon pati nan chemen an HV1 pénétration pwoton ak aji kòm filtre selectivite27,28. Rezilta nou yo montre ke filtè selectivite nan de subunit yo HV1 yo alosterikman makonnen nan eta a louvri.Fig 7A montre kote a apwoksimatif nan sit la obligatwa GBTA ak ki kote résidus D112, D123, K125 ak I127 sou yon schematic nan HV1 VSD a ki baze sou Sou estrikti a kristal nan HV1-CIVSP chimera.suggested direksyon an pou alosterik kouti ki enplike nan fen eksetera nan S1 yo montre ak flèch nwa. (a) Schematic nan HV1 VSD la. Based sou estrikti a kristal nan HV1-CIVSP chimères a, segments yo helical yo montre yo dwe silendrik.Nan sa a konfigirasyon, fen a enteryè nan segman a S4 melanje ak ks la (pa montre). Kote yo prevwa nan GBTA mare yo montre kòm ovals gri.LACK flèch endike wout ki enplike nan kouti allosteric ant sit obligatwa nan de subunits adjasan. Pozisyon yo nan rezidi yo envestige S1 yo make ak esfè koulè. Nan de konfigirasyon dimè diferan jan yo wè nan bò a eksetera nan plan an manbràn.Nan panèl la bò gòch, se koòdone nan dimè ki te fòme pa helix la S4.Rotasyon nan de VSDs 20 degre nan goch alantou yon aks pèpandikilè ak plan an manbràn, akonpaye pa Separasyon nan bout yo deyò nan de elik yo S4 (flèch an tirè), pwodui aranjman yo montre sou dwa a.Nan konfigirasyon sa a, résidus D123 ak I127 soti nan subunit adjasan yo gen dwa vin fèmen ansanm. Nan konfigirasyon an dimè yo te jwenn nan estrikti a kristal 4G80.Pozisyon P140 nan CIVSP koresponn ak pozisyon D123 nan HV1. Rezilta nou yo montre ke entèraksyon an repouse Electrostatic ant rezidi 123 (123d/123d oswa 123R/123R) ki asosye ak yon "nòmal" nivo nan GBTA-obligatwa kowoperativite nan eta a louvri ak orè entèraksyon an soti nan repulsyon atire (123d/123r) , Ogmantasyon koperasyon (Fig. 5 G) .Li espere ke retire nan entèraksyon an vye ak sibstitisyon alanin ta tou mennen nan ogmante cooperativity.Mo Eksplikasyon se ke efè a destabilizasyon nan mete résidus idrofob nan yon anviwònman idrofil ka depase efè a estabilize akòz eliminasyon an nan entèraksyon vye ant d123 résidus, ki kapab lakòz yon rediksyon an jeneral nan obligatwa kowoperativite.Mony et al.39 dènyèman rapòte ke solvant aksè nan Pozisyon D171 nan Ciona Gutis CI-HV1 (ki koresponn a D123 nan HV1 moun) ogmante sou deklanchman, sipòte nosyon ke D123 sitiye nan yon anviwònman idrofil nan eta a louvri. Se gating nan HV1 chanèl li te ye rive nan tranzisyon miltip19,20,26,39,40,41.qiu et al26 te jwenn ke sou depolarizasyon manbràn, Capteur a vòltaj nan CI-HV1 sibi yon chanjman conformational ki kite kanal la aktive men yo toujou fèmen , ki te swiv pa yon tranzisyon distenk ki lakòz pwoton yo louvri kondiksyon nan tou de chemen subunits.The chanjman conformational nan Capteur a vòltaj te kontwole pa fluoresans vòltaj-kranpon, epi li te jwenn ke yo te tranzisyon an dezyèm oaza pèrturbasyon pa mitasyon an nan pozisyon D171. Perturbation nan siyal la fliyoresan ki konsistan avèk prezans nan entèraksyon Electrostatic ant résidus yo D171 nan subunit adjasan nan kèk pwen ansanm kowòdone yo reyaksyon nan chanjman an conformational.Sa entèpretasyon sa a ki konsistan avèk nou jwenn ke rezidi a D123 Electrostatically reyaji nan eta a louvri ak medyasyon allosteric kouti ant GBTA sit obligatwa. Fujiwara et al25 pwopoze ke koòdone nan dimè nan domèn nan sitoplasmik bobine-bobin fin nan manbràn lan ki gen de elik S4 (Fig. Tout VSD ak analiz fonksyonèl nan rejyon an ki konekte helix a S4 ak CCD.Nan absans la nan yon gradyan pH transmembrane, HV1 chanèl mande pou depolarizasyon manbràn konsiderab yo louvri, ak cysteine ​​crosslinking fèt nan kondisyon kote kanal la se majorite fèmen. Se poutèt sa, koòdone nan detekte S4-S4 gen anpil chans reflete konfigirasyon an subunit Off-eta. Eta fèmen, yon lide ki konsistan avèk rezilta yo nan Mony et al. S1 deplase 39 pandan gating. Isit la, nou montre ke, nan eta a louvri, fini yo eksetera nan helix a S1 yo fèmen ase yo sipòte dirèk entèraksyon Electrostatic ki medyasyon allosteric kouti ant subunits.Nan konfigirasyon an dimè ak pwolonje S4-S4 entèraksyon, elik yo S1 yo twò lwen Apa youn ak lòt yo kominike dirèkteman.Men, yon wotasyon 20 ° goch nan de subunit yo VSD alantou yon aks pèpandikilè ak plan an manbràn, konbine avèk separasyon an nan bout yo deyò nan de elik yo S4, sede yon konfigirasyon S1-S1 ki konsistan Avèk rezilta nou yo (Fig. 7b, panèl dwat) .Nou rekòmande sa a konfigirasyon pou kanal la nan eta a louvri. Malgre ke se anzim nan CivSP te panse fonksyone kòm yon monomè, se estrikti a kristal nan VSD izole li yo kaptire nan yon eta dimè. Pou HV1 (Fig. 7c) .Nan dimè a CivSP, rezidi ki pi pre ki soti nan subunit adjasan an te proline nan pozisyon 140 (Fig. 7c) .Interestingly, P140 nan CivSP koresponn ak pozisyon D123 nan HV1.Simite nan konfigirasyon subunit ant HV1 ak CIVSP dimers sijere ke VSDs yo nan pwoteyin sa yo gen yon tandans intrinsèques yo fòme yon koòdone kote fini yo eksetera nan S1 kominike. Wòl esansyèl nan HV1 nan aktivasyon selil espèm fè kanal sa a yon sib dwòg atire pou kontwòl la nan fètilite gason.Furthermore, aktivasyon nan HV1 nan microglia te montre yo vin pi mal rekiperasyon soti nan konjesyon sere siviv nan pasyan ki gen tete 12 oswa kansè nan kolon 13 epi yo panse pou kontribiye pou B-selil malignans 11. Se poutèt sa, ti dwòg molekil vize HV1 ka itilize kòm ajan neuroprotèktif oswa anticancer therapeutics.The dekouvèt ke guanidinothiazole dérivé Open HV1 subunit, ki mennen ale nan ogmante vokasyon obligatwa, ka mennen nan devlopman nan dwòg plis ki pisan vize HV1 chanèl. Mutagenesis sit-dirije nan HV1 moun te fè lè l sèvi avèk teknik PCR estanda.Nan konstwi a HV1NCCIVSP, résidus 1-96 ak 228-273 nan Hv1 yo te ranplase pa résidus 1-113 ak 240-576 nan Civsp18.Nan Hv1-lye a Linked, Dimer, Hv1-lye, Dimer a Hv1-lye, Se C-tèminal la nan yon sèl subunit lye nan N-tèminal la nan dezyèm subunit la nan GGSGGSGGSGSGGSGG LINKER.THE PGEMHE PLASMIDS yo ki gen konstriksyon yo divès kalite yo te linearized ak NHE1 oswa SPH1 anzim restriksyon (New England Biolabs) ak RNA RANESES anzim yo te fè (Biolabs New England) ak RNA RANESES anzim yo te fè. T7 mmessage mmachine Transcription twous (Ambion) .1-3 jou anvan mezi elèktrofizyolojik, CRNA te sou fòm piki nan ovosit Xenopus (50 nl pou chak selil, 0.3-1.5 μg/μl) .staj V ak VI oocytes soti nan Xenopus laevis (Nasco) Soti nan ekosit byosyans.Fwouve piki RNA, selil yo te konsève nan ND96 medyòm ki gen 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CACl, 1 mm mgcl, 10 mM HEPES, 5 mM piruvat, 100 μg/ml gentamicin, pH 7.2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazole [1], 2-guanidino-benzothiazole [2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-il) guanidine [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -Thiazol-2-il) guanidine) [6], etil 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], etil 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- 5-carboxylate [9] ak (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-il) asetat etil -(4-klorofenil) -1,3-thiazol-2-il] guanidine [11] ak 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3- thiazol-2-il] guanidine [12] te soti nan matris syantifik. konpoze sa yo yo se nan pite ki pi wo a komèsyal ki disponib.Yo yo te fonn nan DMSO sèk jenere yon solisyon stock 100 mm, ki te Lè sa a, dilye nan solisyon an anrejistreman nan konsantrasyon final la. Omwen 99% pite. Nan yon sispansyon nan 2-amine-4- (trifluoromethyl) benzenethiol idroklorur (1.02 g, 4.5 mmol) nan 25 ml nan asid idroklorik akeuz (2.5 N) te ajoute solid dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol), ak rezilta a hetereatiamid ( te rflu ak vibran wòdpòte pou 4 èdtan. Te melanj lan reyaksyon refwadi a tanperati chanm ak netralize pa adisyon gradyèl nan 10n idroksid potasyòm.Decripite blan an te fòme, lave ak dlo frèt (3 × 50 ml), seche nan yon fou ( 65 ° C) pou plizyè èdtan, ak Lè sa a, rkristalize soti nan etil asetat/petwòl etè bay yon solid blan (500 mg, 48 %); MP 221-222 ° C (limyè 225-226 ° C) 45; 1H NMR (500 megaèrts, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7.25 (trè laj s, 4 h), 7.40 (d, 1 h, j = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 h), 7.92 (d , 1 h, j = 8.1 Hz) .13c NMR (200 megaèrts, DMSO-D6): δ = 114.2 (d, j = 3.5 Hz), 117.5 (d, j = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, j = 272 Hz), 126.1 (q, j = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): m/z valè kalkile.FOR C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, yo te jwenn : 261.0419. Naphtho [1,2-D] thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), sentetiz jan yo te dekri deja, yo te chofe a 200 ° C nan yon beny lwil nan yon ti tès tib.300 mg (gwo depase) syanamid ak 1.0 ml conc.to konpoze an cho te ajoute asid idroklorik rapidman ak melanj lan te kenbe nan beny lan lwil pou apeprè 2 minit, pandan ki tan pi fò nan dlo a evapore.Li melanj la te Lè sa a, refwadi a tanperati chanm ak materyèl la ki kapab lakòz solidifye te kase an ti moso ak lave ak dlo a bay yon pal jòn amorphe solid. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 megaèrts, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 h, j = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 h, j = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 h , J = 8.6 Hz), 7.89 (d, 1 h, j = 8.6 Hz), 8.02 (d, 1 h, j = 8.2 Hz), 8.35 (d, 1 h, j = 8.3 Hz) .13c NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z Kalkile valè.Pou C12H11N4s (M + H) +: +: 3. , Twouve: 243.0704. Kouran pwoton yo te mezire nan plak entèn ak ekstèn nan ovosit eksprime konstwi diferan lè l sèvi avèk yon axopatch 200b anplifikatè kontwole pa yon axon digidata 1440A (aparèy molekilè) ak PCLAMP10 lojisyèl.Intracellular ak solisyon eksetera gen menm konpozisyon an: 100 mm 2- (Norpholino Norpholino. ) etanesulfonic asid (MES), 30 mm tetraethylammonium (te) mesylate, 5 mm te klori, 5 mm ethylene glycol-bis (2-aminoethyl) -n, N, N ', N'-tetraacetic asid (EGTA), ajiste nan pH 6.0 ak te idroksid.Tout mezi yo te fèt nan 22 ± 2 ° C. Pipèt la gen yon rezistans aksè nan 1.5-4 Mω.current tras yo te filtre nan 1 kHz, echantiyon nan 5 kHz ak analize ak clampfit10.2 (aparèy molekilè ) ak Origin8.1 (OriginLab). Solisyon ki gen divès kalite konsantrasyon nan HV1 inibitè ak nan kèk ka 10 mM βME yo te prezante nan beny lan pa gravite nan yon manifoul ki konekte nan yon sistèm valv VC-6 perfusion (Warner instr.), Ki te pase nan lojisyèl an PCLAMP TTL (tranzistò- Lojik tranzistò) siyal.Rapid Perfusion eksperyans yo te fè lè l sèvi avèk yon kreyon milti-tib perfusion (otomatize SCI.) Avèk yon 360 μm dyamèt livrezon pwent monte devan yon pipèt patch. +120 mV depolarizing batman.gv mezi yo te fèt kòm deja dekri18,20.Tail kouran yo te anrejistre nan -40 mV apre etap depolarizasyon nan diferan tension soti nan -20 mV a +120 mV sof si deklare otreman. Itilize pou korije pou dekonpozisyon aktyèl 18. GV graf la adapte ekwasyon an Boltzmann: konstan yo aparan dissociation (KD) pou konbinezon diferan nan chanèl ak inhibiteurs (Siplemantè Tablo 1) yo te detèmine pa Fitting depandans nan konsantrasyon nan anpèchman (vle di valè %inhib) Avèk ekwasyon an ti mòn: kote [mwen] se konsantrasyon an nan inhibiteur I ak H se koyefisyan an ti mòn.Pou kalkile koyefisyan an ti mòn, ekwasyon (2) se rearanje kòm: