A nyitott Hv1 protoncsatorna alegységek közötti interfészének lekérdezése allosztérikusan csatolt szondával

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Addig is, hogy biztosítsa folyamatos támogatás, stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt. A Hv1 feszültségfüggő protoncsatorna egy dimer komplex, amely két feszültségérzékelő doménből (VSD) áll, amelyek mindegyike tartalmaz egy kapuzott protonpermeációs útvonalat. A dimerizációt a citoplazmatikus tekercs-tekercses domén szabályozza. Az átmenet a zárt állapotból a a nyitott állapot mindkét VSD-ben ismert, hogy együttműködve fordul elő; a mögöttes mechanizmusokról azonban keveset tudunk. Az alegységek közötti interfészek kulcsszerepet játszanak az allosztérikus folyamatokban; azonban ilyen interfészeket nem azonosítottak nyitott Hv1 csatornákban. Itt bemutatjuk, hogy a 2-guanidinotiazol-származékok kooperatív módon blokkolnak két Hv1 VSD-t, és e vegyületek egyikét használják szondaként a nyílt alegységek közötti alloszterikus csatoláshoz. Azt találtuk, hogy az extracelluláris A VSD első transzmembrán fragmensének vége alegységek közötti interfészt képez, amely közvetíti a kötőhelyek közötti kapcsolódást, míg a tekercs-tekercses domén közvetlenül nem vesz részt ebben a folyamatban. Erős bizonyítékot találtunk arra is, hogy a csatorna protonszelektív szűrője szabályozza a blokkoló-kötő együttműködést . A feszültségfüggő protoncsatornák számos organizmusban játszanak fontos szerepet, a fitoplanktontól az emberig1.A legtöbb sejtben ezek a csatornák közvetítik a protonmembránból való protonkiáramlást, és szabályozzák a NADPH-oxidáz aktivitását. Az egyetlen ismert feszültségfüggő protoncsatorna emberben a Hv1, amely a HVCN1 gén2,3 terméke. A Hv1 (más néven VSOP) szerepet játszik a B-sejtek proliferációjában4, a veleszületett immunrendszer által reaktív oxigénfajták előállításában5,6,7,8, spermium a légúti felszíni folyadék mozgékonysága9 és pH-szabályozása10. Ez a csatorna számos Túlexpresszált ráktípusban vesz részt, mint például a B-sejtes rosszindulatú daganatok4,11 és a mell- és vastagbélrák12,13.A túlzott Hv1-aktivitás növeli a rákos sejtek metasztatikus potenciálját11,12.Az agyban a Hv1 expresszálódik mikroglia által, és aktivitásáról kimutatták, hogy súlyosbítja az agykárosodást az ischaemiás stroke modellekben. A Hv1 fehérje feszültségérzékelő domént (VSD) tartalmaz, amely négy, S1-től S414-ig nevezett transzmembrán szegmensből áll. A VSD hasonlít a feszültségfüggő Na+-, K+- és Ca2+-csatornák, valamint a feszültségérzékeny foszfatázok megfelelő doménjeire, mint például a CiVSP-re. Ciona gutis15.E más fehérjékben az S4 C-terminálisa egy effektor modulhoz, a pórusdoménhez vagy enzimhez kapcsolódik. A Hv1-ben az S4 a membrán citoplazmatikus oldalán található tekercselt tekercs doménhez (CCD) kapcsolódik .A csatorna egy dimer komplex, amely két VSD-ből áll, amelyek mindegyike kapuzott protonpermeációs útvonalat tartalmaz16, 17, 18. Erről a két Hv1 alegységről azt találták, hogy kooperatívan nyílik meg19, 20, 21, 22, ami arra utal, hogy alloszterikus csatolás és alegységek közötti kölcsönhatások játszanak szerepet. fontos szerepet játszik a kapuzási folyamatban. A tekercses tekercs doménen belüli alegységek közötti interfész jól meghatározott, mivel a két izolált domén kristályszerkezete rendelkezésre áll22,23. Másrészt a membránon belüli VSD-k közötti interfész nem jól érthető.A Hv1-CiVSP kiméra fehérje kristályszerkezete nem ad információt erről az interfészről, mivel a kikristályosodott csatornakomplex trimer szerveződése abból fakadhat, hogy a natív Hv1 CCD-t a GCN424 élesztőleucin cipzárral helyettesítették. A Hv1 csatorna alegységeinek felépítésére vonatkozó közelmúltbeli tanulmány arra a következtetésre jutott, hogy két S4 hélix a másodlagos szerkezet súlyos megzavarása nélkül megy át a CCD-be, ami hosszú hélixeket eredményez, amelyek a membránból indulnak ki és a citoplazmába nyúlnak be. A cisztein keresztkötési elemzése alapján, ez a tanulmány azt javasolja, hogy a Hv1 VSD-k érintkezzenek egymással az S4 szegmens mentén. Más tanulmányok azonban alternatív interfészeket javasoltak a VSD-k között. Ezek az interfészek magukban foglalják a 17., 21., 26. S1 szegmenseket és a 21. S2 szegmens külső végeit. Az ütközés lehetséges oka Ezen vizsgálatok eredménye az, hogy a VSD-k közötti allosztérikus csatolást a kapuzási folyamat kapcsán vizsgáltuk, amely a zárt és nyitott állapotoktól függ, és a VSD-k közötti interfész a konformáció különböző állapotváltozásaiban változhat. Itt azt találtuk, hogy a 2-guanidinotiazol gátolja a Hv1 csatornákat azáltal, hogy szinergetikusan kötődik két nyitott VSD-hez, és az egyik vegyületet, a 2-guanidinobenzotiazolt (GBTA) használtuk a nyitott állapotban lévő alegységek közötti kölcsönhatás vizsgálatára. Azt találtuk, hogy a GBTA kötési görbe jól leírható egy kvantitatív modellel, amelyben egy inhibitor kötődése az egyik alegységhez a szomszédos alegység kötési affinitásának növekedését eredményezi. Azt is megállapítottuk, hogy a D112 aminosavak szelektivitás szűrők a A 27-es, 28-as csatorna és a guanidinszármazék 29-es kötőhelyének egy része szabályozza a GBTA kötési együttműködést. Megmutattuk, hogy a kooperatív kötődés megmarad a Hv1 dimerben, ahol a CCD elválik az S4 szegmenstől, ami arra utal, hogy a CCD-ben lévő alegységek közötti interfész nem közvetlenül közvetítik az allosztérikus kapcsolást a GBTA-kötő helyek között. Ezzel szemben azt találtuk, hogy az S1 fragmens az alegységek közötti interfész része, és a szomszédos VSD-k elrendezését javasoljuk úgy, hogy az S4 hélix extracelluláris vége távol legyen a dimer közepétől, hogy lehetővé tegye hogy az S1 fragmentum nyitott állapotban legyen. A Hv1 kis molekulájú inhibitorai rákellenes gyógyszerekként és neuroprotektív szerekként használhatók. Mindeddig azonban kevés vegyület volt képes gátolni a csatornát30, 31, 32, 33. Köztük a 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, [1] vegyület az 1. ábrán). 1a) és származékai blokkolják a protonok VSD29,32 átjutását a csatornán. Az ilyen vegyületek megkötése egymástól függetlenül történik a két nyitott alegységben. Korábban kimutatták, hogy 200 μM koncentrációban vizsgálva majdnem olyan hatékonyan gátolja a Hv1-et, mint a 2GBI-t (1b. ábra). Megvizsgáltunk más tiazol-származékokat, és azt találtuk, hogy ezek közül néhány hasonló vagy nagyobb hatékonysággal gátolja a csatornát, mint a GBTA (1. ábra és kiegészítő). szöveg). Meghatároztuk négy tiazol-származék (GBTA és [3], [6] és [11] vegyületek, 1c. ábra) koncentráció-válasz görbéjét, és megállapítottuk, hogy ezek meredekebbek, mint a 2GBI-é. A Hill-együtthatók (h) A tiazol-származékok 1,109 ± 0,040 és 1,306 ± 0,033 között változtak. 1c. ábra és 1. kiegészítő ábra). Ezzel szemben a 2GBI Hill-koefficiense 0,975 ± 0,024 29, 2a. ábra és 1. kiegészítő ábra). Az 1 feletti Hill-koefficiens kötési együttműködést jelez. Mivel minden Hv1-alegységnek megvan a maga inhibitora, kötőhely, 29,32, úgy gondoltuk, hogy egy tiazol-származék kötődése az egyik alegységhez fokozhatja egy második inhibitor molekula kötődését a szomszédos alegységhez. A GBTA volt a legmagasabb Hill-koefficienssel rendelkező tesztvegyület. Ezért ezt a vegyületet választottuk tovább tanulmányozta a kötési szinergia mechanizmusát, és referencia negatív kontrollként 2GBI-t használt. (a) Tesztvegyületek: [1] Referencia Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluor-metil-1,3-benzotiazol-2-il)-guanidin, [4]nafto[1,2-d][1,3]tiazol-2-il -guanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)-guanidin, [6](5-bróm-4-metil-1,3-tiazol-2-il)-guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karbonsav-etil-észter, [9] 2-guanidino-4-metil-etil-1,3-tiazol-5-karboxilát, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil-acetát, [11]1-[4-(4-klórfenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxi-fenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidin. (b) A humán Hv1 aktivitás gátlása a jelzett guanidinotiazolokkal és a 2GBI referenciavegyülettel (kék-zöld oszlopok) A Hv1 protonáramokat Xenopus oociták kifelé irányuló plakkjaiban mértük a -80 mV-ról +120 mV-ra tartó depolarizáció hatására. Mindegyik inhibitort 200 μM koncentrációban adtuk a fürdőhöz.pHi = pHo = 6,0 .Az adatok átlag±SEM (n≥4).(c) A humán Hv1 koncentrációtól függő gátlása a [2], [3], [6] és [11] vegyületek által. Minden pont a 3 átlagos gátlást ± SD 15 mérésig. A vonal egy Hill-illesztés, amelyet az 1. kiegészítő táblázatban közölt látszólagos Kd értékek meghatározásához használnak. A Hill-együtthatókat az 1. kiegészítő ábrán közölt illesztésekből határoztuk meg: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,024 h(2) 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (lásd a módszereket). (a,b) A 2GBI és GBTA vegyületek koncentrációfüggő módon gátolták a dimer és monomer Hv1-et. Mindegyik pont 3-8 mérés átlagos gátlási ± SD értékét jelenti, és a görbe Hill-illesztés. A Hill-együtthatók (h) a beillesztett hisztogramokat a 3. és 4. kiegészítő ábrán közölt illeszkedésekből határoztuk meg. A GBTA (a)-ban látható koncentráció-válasza megegyezik az 1c. ábrán láthatóval. A látszólagos Kd-értékeket lásd az 1. kiegészítő táblázatban.(c) a GBTA kooperatív kötődése a dimer Hv1-hez. A folytonos fekete vonal a kísérleti adatokhoz való illeszkedést jelenti a (6) egyenlet alapján, amely leírja a (d) pontban bemutatott kötési modellt. A Sub 1 és Sub 2 jelű szaggatott vonalak a bimolekuláris asszociációt jelentik -az első és a második kötési esemény disszociációs egyensúlyi görbéi (1. rész: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; 2. rész: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) A Hv1 blokk javasolt mechanizmusának sematikus diagramja.GBTA esetén az egyik nyitott alegységhez való kötődés növeli a szomszédos nyitott alegység affinitását (Kd2 0,05) csökkenést találtunk a GBTA GGG csatornákhoz való kötődésének Hill-koefficiensében a vad típushoz képest (5c. ábra), ami arra utal, hogy annak ellenére, hogy a GGG csatornákhoz kötődik a Hill-együttható a vad típushoz képest (5c. ábra). két alegység együtt fontos, de a CCD közvetlenül nem közvetíti az alegységek közötti allosztérikus kapcsolást a GBTA kötőhelyek között. (a) A Hv1 dimer sematikus diagramja az S4 belső végén egy triglicin mutációval, amelyet úgy terveztek, hogy megszakítsa a citoplazmatikus tekercses domén által közvetített alegységek közötti kapcsolást (kék nyilak). (b) A Hv1 dimerek és a ligációs dimerek sematikus ábrázolása jelzett mutációk, amelyeket az alegységek közötti kapcsolódásban részt vevő S1 fragmentumok tesztelésére terveztek (kék nyilak). (c–h) A 2GBI (cián) és a GBTA (sötétvörös) koncentrációfüggő módon gátolja a jelzett konstrukciókat. Minden pont az átlagos gátlást jelenti ± SD 3-10 mérés. A görbe Hill-illesztés volt, amelyet a látszólagos Kd értékek meghatározásához használtak (lásd az 1. kiegészítő táblázatot). Az interpolált hisztogramok Hill-együtthatóit a Módszerek részben leírtak szerint határoztuk meg (lásd a 3. és 4. kiegészítő ábrákat). Referencia h értékek A Hv1 WT szaggatott vonallal látható. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbségeket jeleznek a mutáns és a WT passzálások között (p 0,05, 5d,i ábra). ). Másrészt a D123A mutáció jelentősen csökkentette a GBTA Hill-együtthatóját (p 0,05/14). Mivel a töltés semlegesítése a 123-as pozícióban mindkét alegységen erős változást eredményezett a GBTA kötési kooperativitásában, míg a töltés megfordítása mindkét alegységen csak csekély hatással volt, kiterjesztettük az elemzést egyetlen olyan alegységre, amelynél a töltés inverziós csatornája van. Hv1-hez kötött dimereket generált D123R szubsztitúcióval a C-terminális alegységben (5b. ábra), és mérte a GBTA és a 2GBI koncentráció-válasz gátlását. Azt találtuk, hogy a GBTA WT-D123R csatornákhoz való kötődésének Hill-koefficiense szignifikánsan magasabb volt ennél vad típusú Hv1 (p 0,05). Azt is megállapítottuk, hogy βME hiányában a GBTA D112E I127C Hv1 dimerhez való kötődésének Hill-koefficiense szignifikánsan magasabb volt, mint a redukálószerek jelenlétében mért érték (6e. ábra és 4. kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy a D112E mutáció nem szüntette meg a GBTA-kötési kooperativitás növekedését, amely a cisztein 127 keresztkötéséből eredt. A 2GBI D112E, I127C Hv1 dimerekhez való kötődésének Hill-koefficiensét szintén nem befolyásolta szignifikánsan a D112E mutáció (1. ábra). 6d és kiegészítő 3. ábra). Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GBTA kötődését fokozza a szomszédos Hv1 alegységekben lévő S1 fragmensek külső végei közötti kölcsönhatás vonzó elektrosztatikus kölcsönhatások révén vagy a szubsztituált ciszteinek közötti kovalens kötések kialakulása révén. Míg a vonzó elektrosztatikus kölcsönhatások kooperativitásra gyakorolt ​​hatása a D112E mutációval megszüntethető, a kovalens kötések hatása nem. A guanidin-származékok Hv1-csatornákhoz való kötéséhez rendelkezésre álló kémiai tér feltárása során azt találtuk, hogy a 2-guanidino-tiazolok, például a GBTA meredekebb koncentráció-függéssel rendelkeznek, mint a 2-guanidino-benzimidazolok (1c. ábra). A GBTA mindkét dimerhez való kötődésének Hill-koefficiens elemzése és a monomer csatornák (2a, b ábra), valamint a dimer csatornához, amelyben az egyik alegység előre kötődött az inhibitorhoz (4. ábra), arra a következtetésre jutottunk, hogy a Hv1 gátlása GBTA által A hatás szinergikus folyamat, és a vegyületek kötőhelyei a két alegységben allosztérikusan kapcsolódnak egymáshoz. Az a felfedezés, hogy a GBTA a nyitott csatornához kötődik, amint azt korábban a rokon 2GBI32 vegyületnél kimutattuk, azt sugallja, hogy az alloszterikus kapcsolás specifikusan értékelhető nyitott állapotban. Kooperatív kötési modellünk Képes volt kvantitatív módon leírni a HV1 GBTA általi gátlását (2C. Ábra), és megmagyarázni a 2GBI és a GBTA eltérő hatásait a csatorna farokáramának romlására a membrán repolarizáció után, amely alátámasztja a kötési folyamat értelmezését. Az a maximális domb-együttható, amelyet két kötőhely (például HV1) alloszterikus fehérjében lehet elérni Szinergetikus szabad energia, a legalacsonyabb és legmagasabb affinitási helyek kötődési szabad energiáinak különbsége (lásd a módszereket) 1,3 kcal/mol volt a HV1 vad típusú és 2,7 kcal/mol esetében HV1 i127c esetén. oxigén és hemoglobin-o. A KCAL/mol, a kísérleti körülményektől függően38.Tus, a globális energiák szempontjából, a GBTA HV1 -hez való kötődésének együttműködése nem különbözik lényegesen a hemoglobinhoz való kötődéstől, amikor a két rendszer különböző számú fehérje alegységét figyelembe veszik. Szinergia modellünkben a GBTA molekulák egy alegységhez való kötődése a szomszédos alegység kötési affinitásának növekedését eredményezi. Elképzeljük azt a folyamatot, amelyben az első kötési eseményből származó kötési környezet átrendeződése vezet (indukált illeszkedés). Az alegységek közötti interakciók változásai. Ezekre a változásokra a szomszédos alegységek megváltoztatják a kötőhelyeket, ami szigorúbb GBTA -kötést eredményez. Ennek a folyamatnak az S1 aszpartát D112 -je felelős a megnövekedett kötési affinitáshoz kapcsolódó kötési hely átrendezéséért.D112. Korábban kimutatták, hogy a HV1 proton permeációs út része, és szelektivitási szűrőként működik27,28. Eredményeink azt mutatják, hogy a szelektivitási szűrők a két HV1 alegységben alloszterikusan kapcsolódnak a nyílt állapotban. A 7A. Ábra a GBTA -kötőhely hozzávetőleges helyét és a D112, D123, K125 és I127 maradék helyét mutatja a HV1 VSD alapú vázlatain. A HV1-CIVSP kristályszerkezetén a Chimera. (A) A HV1 VSD vázlata, amely a HV1-CIVSP kiméra kristályszerkezetén alapul, a spirális szegmensek hengeresnek bizonyulnak. Ebben a konfigurációban az S4 szegmens belső vége összeolvad a CCD-vel (nem ábrázolva). A kötött GBTA várható helyét szürke oválisként mutatjuk be. Black nyilak jelzik az alloszterikus kapcsoláshoz kapcsolódó útvonalakat két szomszédos alegységben a kötőhelyek között. Két különböző dimer -konfigurációban, amint azt a membrán sík extracelluláris oldaláról látják. A két S4 helikon (szaggatott nyilak) külső végeinek elválasztása előállítja a jobb oldalon bemutatott elrendezést. Ebben a konfigurációban a szomszédos alegységek D123 és I127 maradványai megengedik, hogy közel álljanak. (C) A CIVSP VSD vázlatos ábrázolása. A 4G80 kristályszerkezetben található dimer -konfigurációban. A P140 -helyzet a CIVSP -ben megfelel a D123 helyzetnek a HV1 -ben. Eredményeink azt mutatják, hogy a 123. maradék (123d/123d vagy 123R/123R) közötti visszataszító elektrosztatikus kölcsönhatás a GBTA-kötő együttműködési képesség "normál" szintjével társul, és az interakciót a repulációtól vonzza (123D/123R). , megnövekedett együttműködés (5G. Ábra). Várható, hogy az alanin helyettesítésével való visszataszító kölcsönhatás eltávolítása fokozott együttműködési képességhez vezet. A 123A/123A dimer együttműködésének csökkenése megfigyelhető (5E. Ábra). Egy lehetséges lehetséges. Magyarázat az, hogy a hidrofób maradékok hidrofil környezetbe történő elhelyezésének destabilizáló hatása meghaladhatja a stabilizáló hatást a D123 maradékok közötti visszataszító kölcsönhatások kiküszöbölése miatt A CIONA GUTIS CI-HV1 D171 helyzete (a D123-nak felel meg a humán HV1-ben) aktiváláskor növekszik, alátámasztva azt a gondolatot, hogy a D123 nyílt állapotban hidrofil környezetben helyezkedik el. A HV1 csatornák gátlásáról ismert, hogy több átmeneten keresztül történik19,20,26,39,40,41.qiu et al26. , amelyet egy megkülönböztetett átmenet követ, amely a protonokat mindkét alegység útján nyitva tartja. A fluoreszcens jel perturbációja összhangban van a szomszédos alegységek D171 maradékai közötti elektrosztatikus kölcsönhatások jelenlétével a konformációs változás reakció koordinátáinál egy bizonyos ponton. és közvetíti az alloszterikus kapcsolást a GBTA -kötő helyek között. Fujiwara et al25 azt javasolta, hogy a citoplazmatikus tekercselt tekercs domén dimer interfésze kiterjed a membránba, hogy két S4 héliát tartalmazzon (7B. Ábra, bal oldali panel). Az interszubegység interakciójának modellje a cisztein keresztkötési elemzésen alapul, amely lefedi. Az S4 hélixet és a CCD -t összekötő régió teljes VSD és funkcionális elemzése. A transzmembrán pH -gradiens hiányában a HV1 csatornáknak jelentős membrán -depolarizációra van szükségük, és a cisztein térhálósodás olyan körülmények között fordul elő, ahol a csatorna túlnyomórészt bezárva van. Ezért a kimutatott S4-S4 interfész valószínűleg tükrözi az államon kívüli alegység konfigurációját. Egyéb tanulmányok bizonyítékokat találtak az S1 és S2 bevonására az interakció közötti interakciókban, amelyek a Gating17,21,26-ra utalnak, hogy a csatornák eltérő alegységkonfigurációkat fogadhatnak el a nyitott és a nyitott és Zárt államok, egy olyan ötlet, amely összhangban áll Mony és mtsai. Az S1 a kapu során 39 -et mozog. Itt megmutatjuk, hogy nyílt állapotban az S1 hélix extracelluláris végei elég közel vannak ahhoz, hogy támogassák a közvetlen elektrosztatikus interakciókat, amelyek az alegységek közötti alloszterikus kapcsolást közvetítik. egymástól eltekintve, hogy közvetlenül kölcsönhatásba lépjenek. Megállapításainkkal (7B. Ábra, jobb oldali panel). Ajánljuk ezt a konfigurációt a csatorna nyílt állapotban. Noha a CIVSP enzimről úgy gondolják, hogy monomerként működik, az izolált VSD kristályszerkezetét dimer állapotban rögzítik. Az S1 helikák külső végei ebben a dimerben térben közel állnak egymáshoz, és a teljes konfiguráció hasonló a javasolt javasolthoz A HV1 esetében (7C. Ábra). A CIVSP dimerben a szomszédos alegység legközelebbi maradéka prolin volt a 140. helyzetben (7C. Ábra). Érdekes módon a P140 a CIVSP -ben megfelel a D123 pozíciónak a HV1 -ben. És a CIVSP dimerek azt sugallják, hogy ezeknek a fehérjéknek a VSD -je belső hajlama olyan interfész kialakulására, ahol az S1 extracelluláris végei kölcsönhatásba lépnek. A HV1 alapvető szerepe a sperma sejtek aktiválásában, ez a csatorna vonzó gyógyszercélként szolgál a férfi termékenység ellenőrzéséhez. Megállapítva, hogy a HV1 aktiválása mikrogliaban kimutatták, hogy rontja az ischaemiás stroke -ból származó gyógyulást. Kutatták, hogy alacsonyabban kapcsolódik az alacsonyabbhoz. Túlélés 12 vagy kolorektális rákos betegek esetén 13, és úgy gondolják, hogy hozzájárulnak a B-sejt rosszindulatú daganatokhoz. A nyitott HV1 alegység, amely megnövekedett kötési affinitást eredményez, a HV1 csatornákat célzó erősebb gyógyszerek kialakulásához vezethet. A humán HV1 helyspecifikus mutagenezisét standard PCR technikákkal végeztük. A HV1NCCIVSP konstrukcióban a HV1 1-96 és 228-273 maradékát a CIVSP18 1-113 és 240-576 maradékokkal helyettesítettük. A HV1-hez kapcsolódó dimerben, Az egyik alegység C-terminálisát a második alegység N-terminálisához kapcsolják a GGSGGSGGSGGGGSGG linkerrel. T7 mmessage Mmachine transzkripciós készlet (Ambion) .1-3 nappal az elektrofiziológiai mérések előtt a CRNS-t injektáltuk Xenopus oocitákba (50 nl/cellánként, 0,3-1,5 μg/μL). Az ökociták biológiai tudományából. Az RNS injekcióinak követését a sejteket ND96 táptalajban tartottuk, amely 96 mM NaCl -t, 2 mM KCl -t, 1,8 mM CaCl -t, 1 mM mgcl -t, 10 mM HEPES -t, 5 mM piruvátot, 100 μg/ml gentamicin -t, pH 7,2 18 ° C pH -t, pH 7,2 18 ° C -t tartalmaz. . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzotiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidin, (5-bróm-4-metil-1,3 -tiazol-2-il) guanidin) [6], etil-2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboxilát [8], etil-2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol- 5-karboxilát [9] és (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)-etil-acetát [10] a Sigma-Aldrich-ból származik.famotidin [7] az MP Biomedical.1- [4 [4 [4 -(4-klór-fenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidin [11] és 1- [4- (3,4-dimetoxi-fenil) -1,3- tiazol-2-il] guanidin [12] volt. A mátrix tudományos szempontjából. Ezek a vegyületek a legmagasabb tisztaságúak a kereskedelemben. Legalább 99% tisztaság. A 2-amino-4- (trifluor-metil)-benzenetiol-hidroklorid (1,02 g, 4,5 mmol) szuszpenziójához 25 ml vizes sósavban (2,5 N) adunk hozzá szilárd dicyandiamidot (380 mg, 4,5 mmol), és az eredményes heterogén keveréket. refluxáltuk erőteljes keveréssel 4 órán keresztül. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre lehűtjük és 10N kálium -hidroxid fokozatos hozzáadásával semlegesítjük. 65 ° C) több órán át, majd az etil -acetátból/kőolaj -éterből átkristályosítva, hogy fehér szilárd anyagot kapjon (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (fény 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7,25 (nagyon széles s, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d (d , 1 H, J = 8,1 Hz). = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152.1, 158,4, 175.5.hrms (ESI): m/z számított érték. for C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, megállapították. : 261.0419. A naftho [1,2-D] tiazol-2-amin (300 mg, 1,5 mmol), a korábban leírtak szerint szintetizált, 200 ° C-ra melegítjük egy olajfürdőben, egy kis tesztcsőben. 1,0 ml konc. A forró vegyülethez gyorsan hozzáadjuk a sósavat, és az elegyet kb. 2 percig tartottuk az olajfürdőben, amely alatt a víz nagy része elpárologtatott. kis darabokra bontottuk és vízzel mostuk, hogy halványsárga amorf szilárd anyagot kapjunk. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 hz) .13c nmr (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119,9, 122.7, 123.4, 123.6, 126,5, 127,1, 128,7, 132.1, 140,7, 169.1.hrms (ESI): M/Z számított érték.for C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , talált: 243.0704. A protonáramokat a különböző konstrukciókat expresszáló petesejtek belső és külső foltjain mértük egy AxoPatch 200b erősítővel, amelyet egy axon digidata 1440a (molekuláris eszközök) vezéreltek PCLAMP10 szoftverrel. Aintracelluláris és extracelluláris oldatok ugyanazt a kompozíciót tartalmazzák: 100 mm 2- (n-morpolino ) etanszulfonsav (MES), 30 mm-es tetraetil-ammónium (tea) mezilát, 5 mM tea-klorid, 5 mM etilénglikol-bisz (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetracetsav (EGTA), beállítva, beállítva A pH 6,0 tea -hidroxiddal. Mindegyik mérést 22 ± 2 ° C -on végeztük. A pipetta hozzáférési ellenállása 1,5–4 MΩ. A Current nyomokat 1 kHz -en szűrtük, 5 kHz -es mintavételre szűrtük és CLAMPFIT10.2 -rel elemeztük (molekuláris eszközök ) és az Origin8.1 (OriginLab). A HV1 inhibitor különféle koncentrációit tartalmazó oldatokat, és bizonyos esetekben a 10 mM βME-t gravitációval vezették be a fürdőbe egy VC-6 perfúziós szeleprendszerhez (Warner Instr.), Amelyet a PCLAMP TTL szoftveren átadtak (Transistor-- Tranzisztor logika) jelek.Rapid perfúziós kísérleteket többcsöves perfúziós ceruzával (Automatize SCI) végeztünk, egy 360 μm átmérőjű kézbesítési hegyével. +120 mV depolarizáló impulzus.GV méréseket a korábban leírtak szerint végeztünk. A jelenlegi bomlás javításához használták. A hegyi egyenlettel: ahol az [i] az I inhibitor koncentrációja az I és H a domb együtthatója. A domb együttható kiszámításához a (2) egyenlet átrendeződik: