Könnun á millieiningaviðmóti opinnar Hv1 róteindarásar með allósterískt tengdri rannsaka

Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan stuðning fyrir CSS. Til að fá bestu upplifunina mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökktir á samhæfnistillingu í Internet Explorer). Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við sýna síðuna án stíla og JavaScript. Hv1 spennustýrða róteindarásin er tvískipt flókið sem samanstendur af tveimur spennuskynjandi lénum (VSD), sem hvert um sig inniheldur hliðaða róteindagengsleiðsluferil.Dimerun er stjórnað af umfrymisspólusvæðinu. Umskiptin frá lokuðu ástandi í vitað er að opið ástand í báðum VSDs gerist í samvinnu; þó, lítið er vitað um undirliggjandi kerfi. Milliundireiningar tengi gegna lykilhlutverki í allósterískum ferlum; Hins vegar hafa slík tengi ekki verið auðkennd í opnum Hv1 rásum. Hér sýnum við fram á að 2-gúanídínóþíasól afleiður blokka tvær Hv1 VSDs á samvinnu hátt og nota eitt af þessum efnasamböndum sem rannsaka fyrir allósteríska tengingu milli opinna undireininga. Við komumst að því að utanfrumu endi á fyrsta himnuhluta VSD myndar snertifleti milli undireininga sem miðlar tengingu milli bindistaða, en spólusvæðið tekur ekki beinan þátt í þessu ferli. Við fundum einnig sterkar vísbendingar um að róteindasértæk sía rásarinnar stjórnar blokkabindandi samvinnu . Spennustýrðar róteindarásir gegna mikilvægu hlutverki í ýmsum lífverum, allt frá plöntusvifi til manna1. Í flestum frumum miðla þessar rásir róteindaflæði frá róteindahimnunni og stjórna virkni NADPH oxidasa. Eina þekkta spennustýrða róteindarásin í mönnum er Hv1, sem er afurð HVCN1 gensins2,3.Hv1 (aka VSOP) hefur verið sýnt fram á að gegna hlutverki í útbreiðslu B frumna4, framleiðslu á viðbragðsefnum súrefnistegunda af meðfædda ónæmiskerfinu5,6,7,8, sæðisfrumu hreyfigeta9 og pH-stjórnun yfirborðsvökva í öndunarvegi10. Þessi rás tekur þátt í nokkrum oftjáðum í krabbameinsgerðum eins og illkynja sjúkdómum af B-frumu4,11 og brjósta- og endaþarmskrabbameinum12,13. Of mikil Hv1 virkni reyndist auka meinvörpunarmöguleika krabbameinsfrumna 11, 12. Í heilanum er Hv1 tjáð af microglia, og sýnt hefur verið fram á að virkni þess eykur heilaskaða í líkönum af heilablóðþurrð. Hv1 próteinið inniheldur spennuskynjunarsvæði (VSD), sem samanstendur af fjórum himnuhlutum sem kallast S1 til S414. VSD líkist samsvarandi sviðum spennustýrðra Na+, K+ og Ca2+ rása og spennuviðkvæmra fosfatasa, eins og CiVSP frá Ciona gutis15. Í þessum öðrum próteinum er C-enda S4 festur við áhrifaeiningu, svitahola lénið eða ensímið. Í Hv1 er S4 tengt vafningasvæðinu (CCD) sem er staðsett á umfrymishlið himnunnar .Rásin er tvískipt flókin sem samanstendur af tveimur VSD, sem hver um sig inniheldur hliðaða róteindagegndrættisferil16,17,18. Þessar tvær Hv1 undireiningar reyndust opnast í samvinnu19,20,21,22, sem bendir til þess að allósterísk tenging og víxlverkun milli undireininga spili mikilvægu hlutverki í hliðarferlinu. Viðmótið milli undireininga innan spólusvæðisins er vel skilgreint vegna þess að kristalbyggingar tveggja einangruðu lénanna eru tiltækar22,23. Á hinn bóginn er tengi milli VSD innan himnunnar ekki vel skilið.Kristalbygging Hv1-CiVSP chimeric próteinsins veitir ekki upplýsingar um þetta tengi, þar sem trimeric skipulag kristallaðra rásarsamstæðunnar getur stafað af því að innfædda Hv1 CCD er skipt út fyrir ger leucine rennilásinn GCN424. Nýleg rannsókn á undireiningaskipulagi Hv1 rásarinnar komst að þeirri niðurstöðu að tvær S4 þyrlur færast yfir í CCD án alvarlegrar truflunar á efri byggingu, sem leiðir til langra þyrla sem byrja frá himnunni og skarast inn í umfrymið. þessi rannsókn leggur til að Hv1 VSDs hafi samband hver við annan meðfram S4 hlutanum. Hins vegar hafa aðrar rannsóknir lagt til önnur viðmót milli VSDs.Þessi viðmót innihalda S1 hluta 17, 21, 26 og ytri enda S2 hluta 21. Möguleg ástæða fyrir misvísandi Niðurstöður þessara rannsókna eru þær að allósterísk tenging á milli VSDs var skoðuð í tengslum við hliðarferlið, sem fer eftir lokuðu og opnu ástandi, og viðmót milli VSDs getur verið breytilegt í mismunandi ástandsbreytingum á lögun. Hér komumst við að því að 2-guanidínótíazól hamlar Hv1 rásum með samverkandi bindingu við tvö opin VSD og notuðum eitt af efnasamböndunum, 2-guanidínóbensótíasóli (GBTA), til að rannsaka samspil milli undireininga í opnu ástandi. Við komumst að því að GBTA bindingarferilnum er vel hægt að lýsa með megindlegu líkani þar sem binding hemils við eina undireiningu leiðir til aukningar á bindisækni aðliggjandi undireininga. Við komumst líka að því að leifar D112, sértækni síar fyrir rás 27, 28 og hluti af gúanidínafleiðu bindisstað 29 stjórna GBTA bindandi samvinnu. Við sýnum að samvinnubinding er viðhaldið í Hv1 dimer, þar sem CCD aðskilur frá S4 hlutanum, sem bendir til þess að intersubunit tengi í CCD er ekki beint miðla allósterískri tengingu milli GBTA-bindingarstaða. Aftur á móti komumst við að því að S1 brotið er hluti af tengi milli undireininga og leggjum til uppröðun aðliggjandi VSDs með utanfrumu enda S4 helixsins í burtu frá miðju dimersins til að leyfa S1 brotið að vera í opnu ástandi. Lítil sameindahemlar Hv1 eru gagnlegir sem krabbameinslyf og taugavarnarefni. Hins vegar hafa fá efnasambönd til þessa getað hamlað rásina30,31,32,33. Þar á meðal er 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, efnasamband [1] á mynd 1a) og afleiður þess reyndust blokka VSD29,32 gegndræpi róteinda í gegnum rásina. Binding slíkra efnasambanda er talin eiga sér stað óháð öðru í opnu undireiningunum tveimur. áður sýnt fram á að hindra Hv1 næstum eins á áhrifaríkan hátt og 2GBI þegar það var prófað í styrkleikanum 200 μM (Mynd 1b). Við skoðuðum aðrar tíasólafleiður og komumst að því að sumar þeirra hindruðu rásina með svipaða eða meiri styrkleika en GBTA (Mynd 1 og viðbótarefni) texti). Við ákváðum styrksvörunarferla fjögurra tíasólafleiða (GBTA og efnasambönd [3], [6] og [11], mynd 1c) og komumst að því að þær voru brattari en 2GBI. Hill-stuðlarnir (h) af tíasólafleiðum var á bilinu 1,109 ± 0,040 til 1,306 ± 0,033 (mynd. 1c og viðbótarmynd 1). Aftur á móti var Hill stuðullinn fyrir 2GBI 0,975 ± 0,024 29, mynd 2a og aukamynd 1). Hill stuðull fyrir ofan 1 gefur til kynna bindandi samvinnu. Vegna þess að hver Hv1 undireining hefur sína eigin hemla- bindistaður,29,32 við rökstuddum að binding tíasólafleiðu við eina undireiningu gæti aukið bindingu annarrar hindrunarsameindar við aðliggjandi undireiningu.GBTA var prófunarefnasambandið með hæsta Hill stuðulinn. Þess vegna völdum við þetta efnasamband til að rannsakað frekar gangverk bindandi samvirkni og notaði 2GBI sem neikvæða viðmiðunarstýringu. (a) Prófefnasambönd: [1] Tilvísunar Hv1 hemill 2-gúanidínó-bensímídasól (2GBI).[2] 2-gúanidínó-bensóþíasól (GBTA), [3] (5-tríflúormetýl-1,3-bensóþíasól-2-ýl)gúanidín, [4] naftó[1,2-d][1, 3] þíasól-2-ýl -gúanidín, [5](4-metýl-1,3-þíasól-2-ýl)gúanidín, [6](5-bróm-4-metýl-1,3-þíasól-2-ýl)gúanidín, [7] famótidín, [8] 2-gúanidínó-5-metýl-1,3-þíasól-4-karboxýlsýruetýlester, [9] 2-gúanidínó-4-metýl etýl-1,3-þíasól-5-karboxýlat, [10 ](2-gúanidínó-4-metýl-1,3-þíasól-5-ýl)etýlasetat, [11]1-[4-(4-Klórfenýl)-1,3-þíasól-2-ýl]gúanidín, [ 12]1-[4-(3,4-dímetoxýfenýl)-1,3-þíasól-2-ýl]gúanidín. (b) Hindrun á Hv1 virkni manna með tilgreindum gúanídínóþíasólum og viðmiðunarefnasambandinu 2GBI (blágrænar súlur) .Hv1 róteindastraumar voru mældir í inni og út veggskjöldur Xenopus eggfruma sem svar við afskautun frá -80 mV til +120 mV. Hverjum hemli var bætt við baðið í styrkleikanum 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Gögn eru meðaltal±SEM (n≥4).(c) Styrk háð hömlun á Hv1 manna með efnasamböndum [2], [3], [6] og [11]. Hver punktur táknar meðalhömlun ± SD af 3 til 15 mælinga. Línan er Hill fit sem notuð er til að fá sýnileg Kd gildi sem greint er frá í viðbótartöflu 1. Hill stuðlar voru ákvörðuð út frá passanum sem greint er frá í aukamynd 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (sjá aðferðir). (a,b) Efnasambönd 2GBI og GBTA hamluðu tvíliða og einliða Hv1 á styrkleikaháðan hátt. Hver punktur táknar meðalhömlun ± SD af 3 til 8 mælingum og ferillinn er Hill fit. Hill-stuðlarnir (h) sýndir í innfelldu súluritin voru ákvörðuð út frá flögunum sem greint er frá í viðbótarmyndum 3 og 4. Styrkunarsvörun GBTA sem sýnd er í (a) er sú sama og á mynd 1c. Sjá viðbótartöflu 1 fyrir augljós Kd gildi. (c) Líkan af samstarfsbinding GBTA við tvíliða Hv1. Heilda svarta línan táknar passa við tilraunagögnin með jöfnu (6), sem lýsir bindilíkaninu sem sýnt er í (d). Strikuðu línurnar merktar Sub 1 og Sub 2 tákna tvísameindasambandið -dreifingarjafnvægisferlar fyrsta og annars bindandi atburða, í sömu röð (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Skýringarmynd af fyrirhugaðri vélbúnaði Hv1 blokkarinnar. Þegar um er að ræða GBTA, eykur binding við eina opna undireiningu sækni aðliggjandi opna undireiningarinnar (Kd2 0,05) lækkun á Hill-stuðlinum fyrir bindingu GBTA við GGG rásir samanborið við villigerð (mynd 5c), sem bendir til þess að þrátt fyrir hlutverk hans í að halda tvær undireiningar saman mikilvægar, en CCD miðlar ekki beint milliundireininga allósterískri tengingu milli GBTA bindistaða. (a) Skýringarmynd af Hv1 dimer með þríglýsín stökkbreytingu í innri enda S4 sem er hönnuð til að trufla tengingu milli undireininga sem miðlað er af umfrymis spólu léninu (bláar örvar). tilgreindar stökkbreytingar, hönnuð til að prófa S1 brot sem taka þátt í tengingu milli undireininga (bláar örvar).(c–h) 2GBI (sýan) og GBTA (dökkrauður) hamla tilgreindum byggingum á styrkleikaháðan hátt. Hver punktur táknar meðalhömlunina ± SD af 3 til 10 mælingar. Ferillinn var Hill fit sem notaður var til að fá augljós Kd gildi (sjá viðbótartöflu 1). Hæðarstuðlar í innskotnu súluritunum voru ákvörðuð eins og lýst er í kaflanum um aðferðir (sjá viðbótarmyndir 3 og 4). Tilvísun h gildi fyrir Hv1 WT eru sýndar sem strikaðar línur. Stjörnumerki gefa til kynna tölfræðilega marktækan mun á stökkbreyttum og WT leiðum (p 0,05, mynd 5d,i) ). Aftur á móti dró stökkbreyting D123A marktækt úr Hill-stuðlinum GBTA (p 0,05/14). Þar sem hlutleysing hleðslunnar í stöðu 123 á báðum undireiningunum leiddi til mikillar breytinga á GBTA bindandi samvinnu, á meðan að snúa hleðslunni við á báðum undireiningunum hafði aðeins lítil áhrif, útvíkkuðum við greininguna til að taka aðeins til eina undireiningu með snúningsrás hleðslu. mynduðu Hv1-tengda dimera með D123R skiptingu í C-enda undireiningunni (mynd 5b) og mældu þéttni-svörunarhömlunina með GBTA og 2GBI. Við komumst að því að Hill stuðullinn fyrir GBTA bindingu við WT-D123R rásir var marktækt hærri en það af villigerð Hv1 (p 0,05). Við komumst einnig að því að í fjarveru βME var Hill stuðullinn fyrir bindingu GBTA við D112E I127C Hv1 dimerinn marktækt hærri en mældur í nærveru afoxunarefna (mynd 6e og viðbótarmynd 4), sem gefur til kynna að D112E stökkbreytingin afnam ekki aukningu á GBTA bindandi samvinnu sem stafaði af krosstengingu cysteins 127. Hill stuðullinn fyrir 2GBI bindingu við D112E, I127C Hv1 dimera var heldur ekki fyrir marktækum áhrifum af D112E stökkbreytingunni (mynd 1).6d og viðbót. mynd 3). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að GBTA-binding aukist með víxlverkun á milli ytri enda S1 brota í aðliggjandi Hv1 undireiningum með aðlaðandi rafstöðueiginleikum eða með myndun samgildra tengsla milli útskipt cysteina Allosteric tenging milli staða eykst og leiðir til bindandi samvinnu. Þó að hægt sé að afnema áhrif aðlaðandi rafstöðueiginleikar á samvinnu með stökkbreytingu D112E, þá geta áhrif samgildra tengsla ekki. Við könnun okkar á efnarýminu sem er tiltækt til að binda gúanidínafleiður við Hv1 rásir, komumst við að því að 2-gúanídínóþíazól eins og GBTA eru háðari styrkleika en 2-gúanídínóbensímídazól (mynd 1c). og einliða rásir (mynd 2a,b) og tvíliða rásarinnar þar sem ein undireining var fyrirfram bundin við hemilinn (mynd 4) leiddu til þess að við komum að þeirri niðurstöðu að hömlun Hv1 með GBTA. Verkunin er samverkandi ferli, og bindistaðir efnasambandanna í undireiningunum tveimur eru ósamstýrð tengd. Uppgötvunin að GBTA binst opnu rásinni, eins og áður hefur verið sýnt fyrir tengda efnasambandið 2GBI32, bendir til þess að hægt sé að meta ósamlæga tengingu sérstaklega í opnu ástandi. Samvinnubindingarlíkan okkar var fær um að lýsa megindlega hömlun HV1 með GBTA (mynd 2C) og útskýra mismunandi áhrif 2GBI og GBTA á rotnun rásarstrauma eftir endurskautun himna, sem styður túlkun okkar á bindingarferlinu. Hámarks hæðstuðullinn sem hægt er að ná í allosterískum próteini með tveimur bindisstöðum (svo sem HV1) er 2. Við mældum GBTA til að binda HV1 villta gerð með stuðulinn 1,31, sem jókst í 1,88 í HV1 I127C. Samverkandi frjáls orka, munurinn á bindandi frjálsri orku lægstu og hæstu sæknistöðva (sjá aðferðir), var 1,3 kkal/mól þegar um er að ræða HV1 villigerð og 2,7 kcal/mól þegar um er að ræða HV1 I127C. Af súrefni til blóðrauða er frægasta og vel rannsakaða dæmi um samvinnuferlið38. Fyrir blóðrauða manna (tetramer með fjórum bindandi bindisstöðum) er hæðstuðullinn á bilinu 2,5-3,0, með gildi á bilinu 1,26 til 3,64 KCAL/MOL, háð tilraunaaðstæðum38. Þess vegna er hvað varðar alþjóðlega orku, samvinnu GBTA bindingar við HV1 er ekki verulega frábrugðin O2 bindingu við blóðrauða þegar mismunandi fjöldi prótein undireininga í kerfunum tveimur er talinn. Í samvirkni líkaninu okkar leiðir binding GBTA sameinda við eina undireininguna til aukinnar bindandi sækni aðliggjandi undireiningar. Breytingar á milliverkunum milli undireininga. Í svörun við þessum breytingum breyta aðliggjandi undireiningar bindandi stöðum þeirra, sem leiðir til hertari GBTA bindingar. Þvingun á þessu ferli er S1 aspartat D112 ábyrgur fyrir endurskipulagningu bindingarstaðsins sem tengist aukinni bindandi sækni. D112 var áður sýnt að það var hluti af HV1 róteindarferli og virka sem sértæku síu27,28. Niðurstöður okkar sýna að sértækni síur í tveimur HV1 undireiningunum eru bundnar saman í opnu ástandi. Figure 7a sýnir áætlaða staðsetningu GBTA bindingarstaðsins og staðsetningu leifar D112, D123, K125 og I127 á skýringarmynd af HV1 VSD byggir á kristalbyggingu HV1-CIVSP chimera. Sýndar leiðbeiningar fyrir allosteric tengingu sem felur í sér utanfrumu enda S1 eru sýndar með svörtum örvum. (a) Skematískt af HV1 VSD.basað á kristalbyggingu HV1-CIVSP chimera, er sýnt fram á að helical hlutarnir eru sívalur. Í þessari stillingu sameinast innri endinn á S4 hlutanum CCD (ekki sýnt). Spáðir staðir bundinna GBTA eru sýndir sem grár eggjar. Black örvar gefa til kynna leiðir sem taka þátt í allosteric tengingu milli bindandi staða í tveimur aðliggjandi undireiningum. Í tveimur mismunandi dimer stillingum eins og sést frá utanfrumu hlið himnustólsins. Á vinstri spjaldinu er dimerviðmótið myndað af S4 helix. Aðskilnaður ytri endanna tveggja S4 helices (strikaðar örvar), framleiðir fyrirkomulagið sem sýnt er til hægri. Í þessari stillingu er leifum D123 og I127 frá aðliggjandi undireiningum leyft að koma þétt saman. (C) Teikning á CivSP VSD Í dimer stillingum sem finnast í 4G80 kristalbyggingunni. Niðurstöður okkar sýna að fráhrindandi rafstöðueiginleikar milli leifar 123 (123d/123d eða 123R/123R) tengjast „venjulegu“ stigi GBTA-bindandi samvinnu í opnu ástandi og færir samspil frá fráhrindingu til laðaðs (123d/123r) , aukið samstarf (mynd 5G). Það er búist við að það að fjarlægja fráhrindandi samskipti við alanínuppbót myndi einnig leiða til aukinnar samvinnu. Hins vegar sást samdráttur í samvinnu 123A/123A dimersins (mynd 5e). EINN mögulegur mögulegur Útskýring er sú að óstöðugleikaáhrifin af því að setja vatnsfælna leifar í vatnssækið umhverfi geti vegið þyngra en stöðugleikaáhrif vegna brotthvarfs fráhrindandi samskipta milli D123 leifar, sem leiðir til heildar minnkunar á bindandi samvinnu. Staða D171 á Ciona Gutis Ci-HV1 (sem samsvarar D123 í HV1 manna) er aukin við virkjun, sem styður hugmyndina um að D123 sé staðsett í vatnssæknu umhverfi í opnu ástandi. Vitað er að hlið HV1 rásanna kemur fram með mörgum umbreytingum19,20,26,39,40,41.Qiu o.fl. , fylgt eftir með sérstökum umskiptum sem valda róteindum til opinnar leiðni í báðum undireiningum. Skipt var um breytingu á spennu skynjara með spennu-klemmum flúrljómun og kom í ljós að seinni umskiptin voru valin trufluð með stökkbreytingunni í stöðu D171. Truflun á flúrperu merkinu er í samræmi við tilvist rafstöðueiginleika milliverkana milli D171 leifanna aðliggjandi undireininga á einhverjum tímapunkti meðfram viðbragðshnitum sköpunarbreytingarinnar. Þessi túlkun er í samræmi við niðurstöðu okkar um að D123 leifar rafrænna samspili í opnu ástandi og miðlar allosteric tengingu milli GBTA bindisstöðva. Fujiwara o.fl. Öll VSD og hagnýt greining á svæðinu sem tengir S4 helix og CCD. Í fjarveru pH -stigs transmembrane þurfa HV1 rásir talsverða afskautun himna til að opna, og cystein krossbinding á sér stað við aðstæður þar sem rásin er aðallega lokuð. Þess vegna endurspeglar S4-S4 viðmótið líklega líklega uppstillingu utan eininga. Aðrar rannsóknir hafa fundið vísbendingar um þátttöku S1 og S2 í millibili millibili meðan á Gating17,21,26 bendir til þess að rásir geti tekið upp mismunandi undireiningarstillingar í opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum og opnum. Lokað ríki, hugmynd í samræmi við niðurstöður Mony o.fl. S1 flytur 39 við hlið. Hér sýnum við að í opnu ástandi eru utanfrumu endar S1 helixsins nógu nálægt til að styðja við bein rafstöðueiginleikar sem miðla allosteric tengingu milli undireininga. Í dimer stillingu með framlengdum S4-S4 milliverkunum eru S1 helices of langt Burtséð frá hvort öðru til að hafa samskipti beint. Samt sem með niðurstöðum okkar (mynd 7B, hægri spjaldið). Við mælum með þessari stillingu fyrir rásina í opnu ástandi. Þrátt fyrir að talið sé að civsp ensímið virki sem einliða, þá er kristalbygging einangraðs VSD þess tekin í dimmara ástandi. Ytri endar S1 helices í þessum dime eru staðbundnir saman og heildarstillingin er svipuð og fyrirhuguð fyrirhuguð fyrir HV1 (mynd 7C). Í Civsp Dimer var nánasta leifin frá aðliggjandi undireiningunni prólín í stöðu 140 (mynd 7C). Áhugasöm, p140 í CivSP samsvarar stöðu D123 í HV1. Líkingin í undireiningunni á milli HV1 og civsp dimers bendir til þess að VSDs þessara próteina hafi eðlislæg tilhneigingu til að mynda viðmót þar sem utanfrumu endar S1 hafa samskipti. Nauðsynlegt hlutverk HV1 í virkjun sæðisfrumna gerir þessa rás að aðlaðandi lyfjamarkmiði til að stjórna frjósemi karla. Ennfremur hefur verið sýnt fram á að virkjun HV1 í míkróglíum var versna bata frá heilablóðþurrð. Lifun hjá sjúklingum með brjóst 12 eða ristilkrabbamein 13 og er talið að það stuðli að illkynja sjúkdómum í B-frumum 11. Þess vegna er hægt að nota lítil sameindalyf sem miða við HV1 sem taugavarnaefni eða krabbameinslyf. Opið HV1 undireining, sem leiðir til aukinnar bindandi sækni, getur leitt til þróunar öflugra lyfja sem miða við HV1 rásir. Skipt var um stökkbreytingu á HV1 úr mönnum með stöðluðum PCR tækni. Í HV1NCCIVSP smíðinni var leifum 1-96 og 228-273 af HV1 skipt út fyrir leifar 1-113 og 240-576 af CivSP18.in í HV1-tengdum dimer, 240-576 af CivSP18. í HV1-tengdu dimer,, 240-576 af CivSP18. í HV1-tengdum dimer,, 240-576 af CivSP18. í HV1-tengdum dimer,,, af 240-576 af CivSP18. C-enda einnar undireiningar er tengt við N-enda annarrar undireiningarinnar í gegnum GGSGGSGGSGSGGSGG tengilinn. T7 mmessage mmachine umritunarsett (Ambion) .1-3 dögum fyrir raf-lífeðlisfræðilegar mælingar var cRNA sprautað í xenopus eggfrumur (50 nl á hverja frumu, 0,3-1,5 μg/μl). Stig V og VI eggfrumur frá Xenopus Laevis (NASCO) voru fengnar Frá Ecocyte Bioscience. Eftirfylgni RNA innspýtingar var frumum haldið í ND96 miðli sem innihélt 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM mgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvat, 100 μg/ml gentamicin, pH 7,2 18 ° C . 2-guanidino-benzimídasól [1], 2-guanidino-benzothiazol [2], (4-metýl-1,3-thiazol-2-ýl) guanidín [5], (5-brómó-4-metýl-1,3 -Thiazol-2-ýl) guanidín) [6], etýl 2-guanidino-5-metýl-1,3-þíasól-4-karboxýlat [8], etýl 2-guanidino-4-metýl-1,3-thiazole- 5-karboxýlat [9] og (2-guanidino-4-metýl-1,3-thiazol-5-ýl) etýlasetat [10] voru frá Sigma-Aldrich.famotidini [7] var frá MP Biomedical.1- [4 -(4-klórfenýl) -1,3-thiazol-2-ýl] guanidín [11] og 1- [4- (3,4-dímetoxýfenýl) -1,3- Thiazol-2-ýl] guanidín [12] var Frá vísindavísindum fylkis. Þessi efnasambönd eru af mestu hreinleika sem fást í atvinnu að minnsta kosti 99% hreinleiki. Til sviflausnar af 2-amínó-4- (tríflúormetýl) benzenethiol hýdróklóríði (1,02 g, 4,5 mmól) í 25 ml af vatnskenndu hýdróklórsýru (2,5 n) var bætt við fast dicyandamide (380 mg, 4,5 mmól) og heterógenblöndunni var bakflæði með kröftugri hrærslu í 4 klukkustundir. 65 ° C) í nokkrar klukkustundir, og síðan endurkristallað úr etýlasetat/jarðolíu eter til að gefa hvítt fast efni (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (ljós 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7,25 (mjög breið S, 4 klst.), 7,40 (d, 1 klst. , 1 klst., J = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114,2 (d, j = 3,5 Hz), 117,5 (d, j = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, j, j = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.Hrms (ESI): M/Z Reiknuð gildi. : 261.0419. Naphtho [1,2-d] tíazól-2-amín (300 mg, 1,5 mmól), samstillt eins og áður hefur verið lýst, var hitað að 200 ° C í olíubaði í litlu prófunarrör.300 mg (stórt umfram) blásýru og 1,0 ml Conc.To Hot efnasambandið var bætt við saltsýru hratt og blandan var geymd í olíubaðinu í um það bil 2 mínútur, en á þeim tíma gufaði upp. var brotið í litla bita og þvegið með vatni til að veita fölgult formlaust fast efni. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 klst., J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 klst. , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 klst., J = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 klst., J = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 klst. MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z Reiknuð gildi.For C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , fannst: 243.0704. Róteindarstraumar voru mældir í innri og ytri plástrum af eggfrumum sem tjáðu mismunandi smíði með því að nota Axopatch 200B magnara sem stjórnað er af axon digidata 1440a (sameindatæki) með PCLAMP10 hugbúnaði. Intracellular og utanfrumulausnir hafa sömu samsetningu: 100 mm 2- (N-Morpholino og utanfrumu ) Etanesúlfónsýra (MES), 30 mM tetraetýlammoníum (te) mesýlat, 5 mM teaklóríð, 5 mm etýlen glýkól-bis (2-amínóetýl) -n, n, n ', n'-tetraediksýra (EGTA), aðlagað að pH 6,0 með tehýdroxíði. Allar mælingar voru gerðar við 22 ± 2 ° C. Pípettan er með aðgangsþol 1,5–4 MΩ. Straumsmerki voru síuð við 1 kHz, sýni í 5 kHz og greind með klemmu ) og Origin8.1 (OriginLab). Lausnir sem innihalda ýmsan styrk HV1 hemils og í sumum tilvikum voru 10 mM ßME kynntir í baðið með þyngdarafl í gegnum margvíslega tengt VC-6 perfusion loki kerfinu (Warner Instr.), Sem var komið í gegnum PCLAMP hugbúnaðinn TTL (transistor-- Transistor Logic) Merki. Rapid perfusion Tilraunir voru gerðar með því að nota margra túpa perfusion blýant (Automatica +120 mV afskautandi púls.GV Mælingar voru gerðar eins og áður hefur verið lýst18,20. TIL Straumar voru skráðir við -40 mV eftir afskautunarþrep við mismunandi spennu frá -20 mV til +120 mV nema annað sé tekið fram. Viðmiðunarpúlsinn á undan prófunarpúlsinum er Notað til að leiðrétta fyrir núverandi rotnun 18. GV línuritið passar við Boltzmann -jöfnuna: augljósir aðgreiningarstaðir (KD) fyrir mismunandi samsetningar rásir og hemla (viðbótartafla 1) voru ákvörðuð með því að passa styrk hömlunar (meðaltal %hemla gildi)) Með Hill -jöfnunni: þar sem [I] er styrkur hemils I og H er hæðstuðullinn. Til að reikna hæðstuðulinn er jöfnu (2) endurröðun sem: