חקירה של ממשק בין-תת-יחידות של ערוץ הפרוטון הפתוח Hv1 עם בדיקה צמודה אלוסטרית

תודה שביקרת ב-Nature.com. לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח המשך תמיכה, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript. ערוץ הפרוטונים המוגדר במתח Hv1 הוא קומפלקס דימרי המורכב משני תחומי חישת מתח (VSDs), שכל אחד מהם מכיל מסלול חדירת פרוטון מגודד. הדימריזציה נשלטת על ידי תחום הסליל הציטופלזמי. המעבר מהמצב הסגור אל ידוע שהמצב הפתוח בשני ה-VSDs מתרחש בשיתוף פעולה; עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים הבסיסיים. ממשקים בין-תת-יחידות ממלאים תפקיד מפתח בתהליכים אלוסטריים; עם זאת, ממשקים כאלה לא זוהו בערוצי Hv1 פתוחים. כאן אנו מדגימים כי נגזרות 2-guanidinothiazole חוסמות שני Hv1 VSDs באופן שיתופי ומשתמשות באחת מהתרכובות הללו כבדיקה לצימוד אלוסטרי בין תת-יחידות פתוחות. מצאנו כי החוץ-תאיים הקצה של השבר הטרנסממברני הראשון של VSD יוצר ממשק בין-תת-יחידות המתווך צימוד בין אתרי קישור, בעוד שתחום הסליל המפותל אינו מעורב ישירות בתהליך זה. מצאנו גם ראיות חזקות לכך שהמסנן הסלקטיבי של הפרוטון של הערוץ שולט בשיתוף פעולה של חוסם-קשירה . תעלות פרוטונים תלויות מתח ממלאות תפקידים חשובים במגוון של אורגניזמים, מפיטופלנקטון ועד לבני אדם1. ברוב התאים, תעלות אלו מתווך פליטת פרוטונים מממברנת הפרוטון ומווסתות את פעילותו של NADPH אוקסידאז. תעלת הפרוטונים המוגדרת במתח הידועה היחידה בבני אדם הוא Hv1, שהוא התוצר של הגן HVCN12,3.Hv1 (aka VSOP) הוכח כממלא תפקיד בהתרבות תאי B4, ייצור מיני חמצן תגובתיים על ידי מערכת החיסון המולדת5,6,7,8, תא זרע תנועתיות9 וויסות pH של נוזל פני הנשימה10. ערוץ זה מעורב במספר ביטויי יתר בסוגי סרטן כגון ממאירות של תאי B4,11 וסרטן שד וסרטן המעי הגס 12,13. נמצאה פעילות מוגזמת של Hv1 כמגבירה את הפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים 11, 12. במוח, Hv1 מתבטא על ידי מיקרוגליה, והוכח שהפעילות שלו מחמירה את הנזק המוחי במודלים של שבץ איסכמי. החלבון Hv1 מכיל תחום חישת מתח (VSD), המורכב מארבעה מקטעים טרנס-ממברניים הנקראים S1 עד S414. ה-VSD דומה לתחומים המקבילים של תעלות Na+, K+ ו-Ca2+ עם מתח, ופוספטאזות רגישות למתח, כגון CiVSP מ- Ciona gutis15.בחלבונים אחרים אלה, קצה ה-C של S4 מחובר למודול אפקטור, תחום הנקבוביות או האנזים. ב-Hv1, S4 מקושר לתחום ה-coiled-coil (CCD) הממוקם בצד הציטופלזמי של הממברנה הערוץ הוא קומפלקס דימרי המורכב משני VSDs, שכל אחד מהם מכיל מסלול חדירת פרוטונים מגודר16,17,18. נמצאו שתי תת-יחידות Hv1 אלו נפתחות בשיתוף פעולה19,20,21,22, מה שמרמז על כך שאינטראקציות אלוסטריות ואינטראקציות בין-תת-יחידות משחקות תפקיד חשוב בתהליך השער. הממשק בין יחידות המשנה בתוך תחום הסליל המפותל מוגדר היטב מכיוון שמבני הגביש של שני התחומים המבודדים זמינים22,23. מצד שני, הממשק בין VSDs בתוך הממברנה אינו המבנה הגבישי של החלבון הכימרי Hv1-CiVSP אינו מספק מידע על ממשק זה, שכן הארגון הטרימרי של קומפלקס הערוצים המגובשים עשוי לנבוע מהחלפת ה-Hv1 CCD המקומי ברוכסן השמרים לאוצין GCN424. מחקר שנערך לאחרונה על ארגון תת-היחידות של ערוץ Hv1 הגיע למסקנה ששני סלילי S4 עוברים לתוך ה-CCD ללא הפרעה חמורה של המבנה המשני, וכתוצאה מכך סלילים ארוכים שמתחילים מהממברנה ויוצאים לתוך הציטופלזמה. בהתבסס על ניתוח צולבות של ציסטאין, מחקר זה מציע כי Hv1 VSDs יתקשרו זה עם זה לאורך מקטע S4. עם זאת, מחקרים אחרים הציעו ממשקים חלופיים בין VSDs. ממשקים אלה כוללים מקטעים S1 17, 21, 26 והקצוות החיצוניים של S2 מקטע 21. סיבה אפשרית לסכסוך התוצאות של מחקרים אלו הן שצימוד אלוסטרי בין VSDs נבדק ביחס לתהליך השער, התלוי במצבים סגורים ופתוחים, והממשק בין VSDs עשוי להשתנות בשינויי מצבים שונים בקונפורמציה. כאן, מצאנו ש-2-guanidinothiazole מעכב תעלות Hv1 על ידי קשירה סינרגטית לשני VSDs פתוחים, והשתמשנו באחת התרכובות, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), כדי לחקור את האינטראקציה בין תת-יחידות במצב פתוח. מצאנו שניתן לתאר היטב את עקומת הקישור של GBTA על ידי מודל כמותי שבו קישור של מעכב ליחידה אחת מביאה לעלייה בזיקה הקישורית של תת-היחידה הסמוכה. מצאנו גם ששאריות D112, סלקטיביות מסננת עבור ערוץ 27, 28 וחלק מאתר הקישור של נגזרת גואנידין 29 שולטים בשיתוף הפעולה הקישור ל-GBTA. אנו מראים שהקישור השיתופי נשמר בדימר Hv1, שבו ה-CCD נפרד ממקטע S4, מה שמרמז על כך שהממשק הבין-תת-יחידות ב-CCD אינו ישיר לתווך צימוד אלוסטרי בין אתרי קשירה ל-GBTA. לעומת זאת, אנו מוצאים שקטע S1 הוא חלק מהממשק בין יחידות המשנה ומציעים סידור של VSDs סמוכים עם הקצה החוץ-תאי של הליקס S4 רחוק ממרכז הדימר כדי לאפשר שקטע S1 יהיה במצב פתוח. מעכבי מולקולות קטנות של Hv1 שימושיים כתרופות נוגדות סרטן וכסוכנים נוירו-פרוקטיבים. עם זאת, עד כה, תרכובות מעטות הצליחו לעכב את הערוץ30,31,32,33. ביניהם, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, תרכובת [1] באיור 1a) ונגזרותיו נמצאו חוסמים את חדירת הפרוטונים של VSD29,32 דרך הערוץ. הקישור של תרכובות כאלה מתרחש באופן עצמאי בשתי תת-היחידות הפתוחות. הוכח בעבר כמעכבת Hv1 ביעילות כמעט כמו 2GBI כאשר נבדק בריכוז של 200 מיקרומטר (איור 1b). בדקנו נגזרות תיאזול אחרות ומצאנו שחלקן מעכבות את התעלה עם עוצמה דומה או גדולה יותר מ-GBTA (איור 1 והשלמה קבענו את עקומות תגובת הריכוז של ארבע נגזרות תיאזול (GBTA ותרכובות [3], [6] ו-[11], איור 1c) ומצאנו שהן תלולות יותר מאלו של 2GBI. מקדמי הגבעה (h) של נגזרות תיאזול נע בין 1.109 ± 0.040 ל-1.306 ± 0.033 (איור. 1c ואיור משלים 1). לעומת זאת, מקדם היל עבור 2GBI היה 0.975 ± 0.024 29, איור 2a ואיור משלים 1). מקדם היל מעל 1 מצביע על שיתוף פעולה מחייב. מכיוון שלכל תת-יחידה Hv1 יש מעכב משלה- אתר הקישור,29,32 נימקנו שהקשירה של נגזרת תיאזול ליחידה אחת יכולה לשפר את הקישור של מולקולת מעכב שנייה לתת-היחידה הסמוכה.GBTA הייתה תרכובת הבדיקה עם מקדם היל הגבוה ביותר. לכן, בחרנו בתרכובת זו כדי למד עוד את המנגנון של סינרגיה מחייבת והשתמש ב-2GBI כבקרה שלילית התייחסות. (א) תרכובות בדיקה: [1] מעכב Hv1 התייחסות 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-גואנידינו-בנזותיאזול (GBTA), [3] (5-טריפלואורומתיל-1,3-בנזותיאזול-2-איל)גואנידין, [4] נפתו[1,2-ד][1, 3] תיאזול-2-איל -גואנידין, [5](4-מתיל-1,3-תיאזול-2-איל)גואנידין, [6](5-ברומו-4-מתיל-1,3-תיאזול-2-איל)גואנידין, [7] פמוטידין, [8] 2-גואנידינו-5-מתיל-1,3-תיאזול-4-חומצה קרבוקסילית אתיל אסטר, [9] 2-גואנידינו-4-מתיל אתיל-1,3-תיאזול-5-קרבוקסילאט, [10 ](2-גואנידינו-4-מתיל-1,3-תיאזול-5-איל)אתיל אצטט, [11]1-[4-(4-כלורופניל)-1,3-תיאזול-2-איל]גואנידין, [ 12]1-[4-(3,4-דימתוקסיפניל)-1,3-תיאזול-2-איל]גואנידין .(ב) עיכוב פעילות Hv1 אנושית על ידי הגואנידינוטיאזולים המצוינים ותרכובת הייחוס 2GBI (פסים כחולים-ירוקים) זרמי פרוטון .Hv1 נמדדו בפלאקים מבפנים החוצה של ביציות קסנופוס בתגובה לדה-פולריזציה מפוטנציאל החזקה של -80 mV ל-+120 mV. כל מעכב התווסף לאמבטיה בריכוז של 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .הנתונים הם ממוצע ±SEM (n≥4).(ג) עיכוב תלוי ריכוז של Hv1 אנושי על ידי תרכובות [2], [3], [6] ו-[11]. כל נקודה מייצגת את העיכוב הממוצע ± SD של 3 עד 15 מדידות. הקו הוא התאמה הגבעה המשמשת להשגת ערכי Kd לכאורה המדווחים בטבלה משלימה 1. מקדמי הגבעה נקבעו מההתאמות שדווחו באיור משלים 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (ראה שיטות). (א,ב) תרכובות 2GBI ו-GBTA עיכבו Hv1 דימרי ומונומרי באופן תלוי ריכוז. כל נקודה מייצגת את העיכוב הממוצע ± SD של 3 עד 8 מדידות והעקומה היא התאמה של Hill. מקדמי היל (h) המוצגים ב- ההיסטוגרמות המוכנסות נקבעו מההתאמות שדווחו באיורים משלימים 3 ו-4. תגובת הריכוז של GBTA המוצגת ב(א) זהה לזו באיור 1c. ראה טבלה משלימה 1 לערכי Kd לכאורה. (ג) מודלים של הקישור השיתופי של GBTA ל-Dimeric Hv1. הקו השחור המוצק מייצג את ההתאמה לנתוני הניסוי באמצעות משוואה (6), המתארת ​​את מודל הקישור המוצג ב-(d). הקווים המקווקוים המסומנים Sub 1 ו- Sub 2 מייצגים את האסוציאציה הבימולקולרית עקומות שיווי משקל של דיסוציאציה של אירועי הקישור הראשון והשני, בהתאמה (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(ד) דיאגרמה סכמטית של המנגנון המוצע של בלוק Hv1.במקרה של GBTA, התקשרות לתת-יחידה פתוחה אחת מגבירה את הזיקה של תת-היחידה הפתוחה הסמוכה (Kd2 0.05) במקדם ה-Hill של קשירת GBTA לערוצי GGG בהשוואה לסוג הבר (איור 5c), מה שמצביע על כך שלמרות תפקידו בשמירה על שתי תת-יחידות יחד חשובות, אך CCD אינו מתווך ישירות צימוד אלוסטרי בין תת-יחידות בין אתרי קישור GBTA. (א) דיאגרמה סכמטית של הדימר Hv1 עם מוטציית טריגליצין בקצה הפנימי של S4 שנועדה לשבש את הצימוד בין תת-יחידות המתווך על ידי תחום הסליל הציטופלזמי (חצים כחולים).(ב) ייצוג סכמטי של דימרים Hv1 ודימרים קשירה עם הצביעו על מוטציות, שנועדו לבדוק שברי S1 המעורבים בצימוד בין תת-יחידות (חצים כחולים).(c-h) 2GBI (ציאן) ו-GBTA (אדום כהה) מעכבים את המבנים המצוינים באופן תלוי ריכוז. כל נקודה מייצגת את העיכוב הממוצע ± SD של 3 עד 10 מדידות. העקומה הייתה התאמה של Hill ששימשה להשגת ערכי Kd לכאורה (ראה טבלה משלימה 1). מקדמי הגבעה בהיסטוגרמות המשולבות נקבעו כמתואר בסעיף השיטות (ראה איורים משלימים 3 ו-4). Hv1 WT מוצגים כקווים מקווקוים. כוכביות מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית בין מעברי מוטציה ו-WT (p 0.05, איור 5d,i). ). מצד שני, מוטציה D123A הפחיתה באופן משמעותי את מקדם היל של GBTA (p 0.05/14). מכיוון שניטרול המטען בעמדה 123 בשתי תת-היחידות הביא לשינוי חזק בשיתוף הפעולה המחייב GBTA, בעוד שהיפוך המטען בשתי תת-היחידות היה בעל השפעה קטנה בלבד, הרחבנו את הניתוח כך שיכלול רק תת-יחידה אחת עם ערוץ היפוך הטעינה. יצרו דימרים מקושרים ל-Hv1 עם החלפת D123R בתת-היחידה המסוף C (איור 5b) ומדדו את עיכוב הריכוז-תגובה על ידי GBTA ו-2GBI. מצאנו שמקדם היל של קישור GBTA לערוצי WT-D123R היה גבוה משמעותית מזה. של Hv1 מסוג פרא (p 0.05). מצאנו גם שבהיעדר βME, מקדם היל של קשירת GBTA לדימר D112E I127C Hv1 היה גבוה משמעותית מזה שנמדד בנוכחות חומרים מפחיתים (איור 6e ואיור משלים 4), מה שמרמז על המוטציה של D112E. לא ביטל את העלייה בשיתופיות הקישור ל-GBTA הנובעת מהצלבה של ציסטאין 127. מקדם היל של 2GBI קישור ל-D112E, I127C Hv1 dimers גם לא הושפע משמעותית מהמוטציה D112E (איור 1).6d ו-Supplementary איור 3). ביחד, ממצאים אלה מצביעים על כך שקישור GBTA מוגבר על ידי האינטראקציה בין הקצוות החיצוניים של שברי S1 בתתי יחידות Hv1 סמוכות באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות אטרקטיביות או באמצעות יצירת קשרים קוולנטיים בין ציסטינים מוחלפים צימוד אלוסטרי בין אתרים גדל ומביא לשיתוף פעולה מחייב. בעוד שניתן לבטל את ההשפעה של אינטראקציות אלקטרוסטטיות אטרקטיביות על שיתוף הפעולה על ידי מוטציה D112E, ההשפעה של קשרים קוולנטיים אינה יכולה. בחקרנו את המרחב הכימי הזמין לקשירת נגזרות גואנידין לתעלות Hv1, מצאנו של-2-guanidinothiazoles כמו GBTA יש תלות ריכוז תלולה יותר מ-2-guanidinobenzimidazoles (איור 1c). ניתוח מקדם היל של קישור GBTA לשני הדימריים ותעלות מונומריות (איור 2a,b) ולתעלה הדימרית שבה תת-יחידה אחת הייתה קשורה מראש למעכב (איור 4) הביאו אותנו למסקנה שעיכוב Hv1 על ידי GBTA הפעולה היא תהליך סינרגטי, וכן אתרי הקישור של התרכובות בשתי תת-היחידות מחוברות אלוסטרילית. הגילוי ש-GBTA נקשר לערוץ הפתוח, כפי שהוצג בעבר עבור התרכובת הקשורה 2GBI32, מציע שניתן להעריך באופן ספציפי צימוד אלוסטרי במצב הפתוח. מודל הקישור השיתופי שלנו הצליח לתאר כמותית את עיכוב ה- HV1 על ידי GBTA (איור 2 ג) ולהסביר את ההשפעות השונות של 2GBI ו- GBTA על ריקבון זרמי זנב התעלה לאחר קיטוב קרום, התומך בפרשנותנו לתהליך הכריכה. מקדם הגבעה המרבי שניתן להשיג בחלבון אלוסטרי עם שני אתרי כריכה (כמו HV1) הוא 2. אנו נמדדים את GBTA כדי לקשור סוג HV1 פראי עם מקדם של 1.31, שגדל ל 1.88 ב- HV1 I127C. אנרגיה חופשית סינרגיסטית, ההבדל בין האנרגיות החופשיות המחייבות של אתרי הזיקה הנמוכים והגבוהים ביותר (ראה שיטות), היה 1.3 קק"ל/שומה במקרה של סוג HV1 פראי ו -2.7 קק"ל/שומה במקרה של HV1 I127C. של חמצן להמוגלובין הוא הדוגמה המפורסמת והנחקרת ביותר לתהליך השיתופי 38. עבור המוגלובין אנושי (טטרמר עם ארבעה אתרי כריכה משולבים באופן אלוסטרי), מקדם הגבעה נע בין 2.5-3.0, כאשר ערכים נעים בין 1.26 ל- 3.64 Kcal/mol, תלוי בתנאים ניסיוניים 38. אם כן, מבחינת אנרגטיות גלובליות, שיתופי הפעולה של קשירת GBTA ל- HV1 אינה שונה באופן מהותי מזה של קשירת O2 להמוגלובין כאשר נחשבים המספרים השונים של יחידות תת -חלבון בשתי המערכות. במודל הסינרגיה שלנו, הכריכה של מולקולות GBTA ליחידה אחת מביאה לעלייה בזיקה המחייבת של תת היחידה הסמוכה. אנו רואים תהליך בו סידור מחדש של הסביבה הכריכה הנובעת מאירוע הכריכה הראשון (הכושר הנגרם) מוביל לכיוון שינויים באינטראקציות בין יחידות משנה. בתגובה לשינויים אלה, יחידות משנה סמוכות משנות את אתרי הכריכה שלה בעבר הוכח כחלק ממסלול חדירת הפרוטון HV1 ולפעול כסלקטיביות 27,28. התוצאות שלנו מראות כי מסנני הסלקטיביות בשתי יחידות המשנה של HV1 משולבות באופן אסטרוסטרי במצב הפתוח. תצורה 7A מציגה את המיקום המשוער של אתר הכריכה של GBTA ואת מיקום שאריות D112, D123, K125 ו- I127 על סכמה של ה- HV1 VSD מבוסס על מבנה הקריסטל של הכימרה HV1-CIVSP. כיוונים שהוגדרו עבור צימוד אלוסטרלי הכולל את הקצה החוץ תאי של S1 מוצגים עם חצים שחורים. (א) סכמטי של ה- HV1 VSD. מבוסס על מבנה הגביש של הכימרה HV1-CIVSP, הקטעים הסליליים מוצגים כגליליים. בתצורה זו, הקצה הפנימי של קטע ה- S4 מתמזג עם ה- CCD (לא מוצג). המיקומים החזויים של GBTA כבולים מוצגים כאל אליפסות אפורות. חצים שחורים מציינים מסלולים המעורבים בצימוד אלוסטרי בין אתרי כריכה בשתי יחידות משנה סמוכות. עמדותיה של שאריות S1 שנחקרו מסומנות בתחום צבעוני. (ב) איור סכמטי של יחידות HV1 מסודרות. בשתי תצורות דימר שונות כפי שנראו מהצד החוץ תאי של מישור הממברנה. בלוח השמאלי, ממשק הדימר נוצר על ידי סליל S4. הטענה של שני VSDs 20 מעלות בכיוון השעון סביב ציר בניצב למישור הממברנה, מלווה על ידי הפרדת הקצוות החיצוניים של שני מסדקי ה- S4 (חצים מקווקו), מייצרת את הסידור המוצג מימין. בתצורה זו מותרות להתקרב יחד (ג) ייצוג סכמטי של Civsp VSD. בתצורת הדימר שנמצאה במבנה הקריסטל 4G80. מיקום P140 ב- CivSP תואם את המיקום D123 ב- HV1. התוצאות שלנו מראות שהאינטראקציה האלקטרוסטטית הדוחה בין שאריות 123 (123d/123d או 123r/123r) קשורה לרמה "רגילה" של שיתוף פעולה מחייב GBTA במצב הפתוח ומעבירה את האינטראקציה מהדחייה למשיכה (123d/123r) , שיתוף פעולה מוגבר (איור 5G). צפוי כי הסרת האינטראקציה הדוחה עם החלפת אלנין תביא גם להגדלת שיתוף פעולה. ההסבר הוא שההשפעה היציבה של הצבת שאריות הידרופוביות בסביבה הידרופילית עשויה לעלות על האפקט המייצב עקב ביטול אינטראקציות דוחה בין שאריות D123, וכתוצאה מכך הפחתה כוללת בשיתוף פעולה מחייב. מיקום D171 של Ciona Gutis CI-HV1 (המתאים ל- D123 ב- HV1 אנושי) מוגבר עם ההפעלה, התומך ברעיון ש- D123 ממוקם בסביבה הידרופילית במצב הפתוח. ידוע כי שער של ערוצי HV1 מתרחש באמצעות מעברים מרובים 12,20,26,39,40,41.Qiu et al26 מצא כי עם קיטוב קרום, חיישן המתח של CI-HV1 עובר שינוי קונפורמטיבי שמותיר את הערוץ מופעל אך עדיין סגור , ואחריו מעבר מובהק הגורם לפרוטונים להולכה פתוחה בשתי יחידות המשנה. השינוי הקונפורמטיבי של חיישן המתח היה מנוטר על ידי פלואורסצנט מהדק מתח, ונמצא כי המעבר השני הוטרד באופן סלקטיבי על ידי המוטציה במיקום D171. הפרעה של האות הפלואורסצנטי תואמת את נוכחותם של אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין שאריות D171 של יחידות משנה סמוכות בשלב מסוים לאורך קואורדינטות התגובה של השינוי הקונפורמציוני. הפרשנות הזו תואמת את הממצא שלנו כי שאריות D123 מתקשרת באופן אלקטרוסטטי במצב הפתוח. ומתווך צימוד אלוסטרי בין אתרי קשירת GBTA. פוג'יווארה ואחרי כל ה- VSD והניתוח התפקודי של האזור המחבר בין סליל S4 ו- CCD. בהיעדר שיפוע pH טרנסממברני, תעלות HV1 דורשות קיטוב ממברנה ניכרת כדי להיפתח, וקישור צולב ציסטאין מתרחש בתנאים שבהם הערוץ סגור בעיקר. לפיכך, ממשק S4-S4 שזוהה משקף ככל הנראה את תצורת המשנה מחוץ למצב. מחקרים אחרים מצאו עדויות למעורבות של S1 ו- S2 באינטראקציות בין-יחידות במהלך שערים 17,21,26 המצביעים על כך שערוצים עשויים לאמץ תצורות תת יחידה שונות בפתיחה ופתוח מצבים סגורים, רעיון התואם את ממצאי Mony et al. S1 נע 39 במהלך השערים. כאן אנו מראים כי במצב הפתוח, הקצוות החוץ תאיים של סליל ה- S1 קרובים מספיק כדי לתמוך באינטראקציות אלקטרוסטטיות ישירות המתווכות צימוד אלוסטרי בין יחידות משנה. בתצורת הדימר עם אינטראקציות S4-S4 מורחבות, מסוקי ה- S1 רחוקים מדי מלבד זה לזה כדי ליצור אינטראקציה ישירות. עם זאת, סיבוב של 20 מעלות בכיוון השעון של שתי יחידות המשנה VSD סביב ציר בניצב למישור הממברנה, בשילוב עם הפרדת הקצוות החיצוניים של שני הסלילים S4, הניב תצורה S1-S1 עקבית עם הממצאים שלנו (איור 7B, לוח ימני). אנו ממליצים על תצורה זו לערוץ במצב הפתוח. למרות שהאנזים Civsp נחשב לתפקוד כמונומר, מבנה הגביש של ה- VSD המבודד שלו נלכד במצב דימס. הקצוות החיצוניים של מסוקי ה- S1 בדימר זה קרובים זה לזה, והתצורה הכללית דומה לזו המוצעת עבור HV1 (איור 7 ג). בדימר CIVSP, המשקעים הקרובים ביותר מהתת היחידה הסמוכה הייתה פרולין במצב 140 (איור 7 ג). באופן מעניין, P140 ב- CivSP תואם את המיקום D123 ב- HV1. הדמיון בתצורת המשנה בין HV1 ו- Civsp Dimers מציעים כי ל- VSDs של חלבונים אלה יש נטייה מהותית ליצור ממשק בו הקצוות החוץ תאיים של S1 מתקשרים. התפקיד המהותי של HV1 בהפעלה של תאי הזרע הופך את הערוץ הזה למטרה תרופתית אטרקטיבית לבקרת הפוריות הגברית. הישרדות בקרב חולים עם שד 12 או סרטן המעי הגס 13 ונחשבים שתורמים לממאירות תאי B 11. לכן, תרופות מולקולות קטנות הממוקדות ל- HV1 יכולות לשמש כחומרים נוירו-מגנים או כטיפול נגד סרטן. הגילוי כי נגזרות גואנידינוטיאזר יכולות לגרום לתאומים אחוריים באחוריים באחוריים באחוריים באחוריים באחוריים באחוריים באחוריים במאחוריים. יחידת משנה פתוחה של HV1, המובילה להגדלת זיקה מחייבת, עשויה להוביל להתפתחות של תרופות חזקות יותר הממוקדות לערוצי HV1. מוטגנזה מכוונת אתר של HV1 אנושית בוצעה באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות. במבנה HV1NCCIVSP, שאריות 1-96 ו- 228-273 של HV1 הוחלפו על ידי שאריות 1-113 ו- 240-576 של Civsp18. במעמעם ה- HV1, קצה ה- C של תת יחידה אחת קשור לקשר ה- N של יחידת המשנה השנייה דרך ה- GGSGGSGGSGSGSGGSGGGGEG. ערכת תעתיק mmessage mmachine (Ambion) .1-3 ימים לפני המדידות האלקטרופיזיולוגיות, הוזרק cRNA לביציות קסנופוס (50 ננומטר לתא, 0.3-1.5 מיקרוגרם/מיקרו). ממדעי הביולוגי של אקוציטים. הזרקת RNA של זריקת RNA, תאים נשמרו במדיום ND96 המכיל 96 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CACL, 1 מ"מ מ"ג, 10 מ"מ HEPES, 5 מ"מ פירובט, 100 מיקרוגרם/מ"ל ג'נטמיצין, PH 7.2 18 מעלות צלזיוס . 2-גוואנידינו-בנזימידאזול [1], 2-גוונידינו-בנזותיאזול [2], (4-מתיל-1,3-תאיאזול-2-איל) גואנידין [5], (5-ברומו -4-מתיל-1,3 -thiazol-2-yl) גואנידין) [6], אתיל 2-גוואנידינו-5-מתיל-1,3-תאיאזול-4-קרבוקסילאט [8], אתיל 2-גואנידינו-4- מתיל-1,3-טיאזול- 5-קרבוקסילאט [9] ו- (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) אתיל אצטט [10] היו מ- sigma-aldrich.famotidine [7] היה מ- MP Biomedicals.1- [4 -(4-כלורופניל) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine [11] ו- 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3- thiazol-2-yl] guanidine [12] היה ממטריקס מדע לפחות 99% טוהר. להשעיה של 2-אמינו-4- (Trifluoromethyl) Benzenethiol Hydrochloride (1.02 גרם, 4.5 מ"מ) ב 25 מ"ל של חומצה הידרוכלורית מימית (2.5 N) התווספה Dicyandandiamide מוצק (380 מ"ג, 4.5 מ"מ), והתערובת הטרוגנית המוזכרת (380 מ"ג) הוחזר מחדש עם ערבוב נמרץ למשך 4 שעות. תערובת התגובה התקררה לטמפרטורת החדר ונוטרלה על ידי תוספת הדרגתית של 10N אשלגן הידרוקסיד. המשקעים הלבנים שנוצרו סוננו, נשטפה במים קרים (3 × 50 מ"ל), מיובשת בתנור ( 65 מעלות צלזיוס) למשך מספר שעות ואז התגבשו מחדש מאתיל אצטט/אתר נפט כדי לתת מוצק לבן (500 מ"ג, 48 %); MP 221–222 ° C (אור 225–226 מעלות צלזיוס) 45; 1H NMR (500 מגה הרץ, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7.25 (S רחבה מאוד, 4 שעות), 7.40 (D, 1 H, J = 8.1 הרץ), 7.73 (שעה, 1 שעה), 7.92 (D , 1 H, J = 8.1 הרץ) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114.2 (D, J = 3.5 הרץ), 117.5 (D, J = 3.5 הרץ), 121.7, 124.6 (Q, J = 272 הרץ), 126.1 (q, j = 272 הרץ) = 31.6 הרץ), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): M/Z מחושב ערך. עבור C9H8F3N4 (M + H) +: 261.0416, נמצא : 261.0419. NAPHTHO [1,2-D] THIAZOL-2-AMINE (300 מ"ג, 1.5 מ"מול), שסונתז כמתואר לעיל, היה מחומם ל -200 מעלות צלזיוס באמבט שמן בצינור מבחן קטן .300 מ"ג (עודף) ציאנמיד וציאנמיד 1.0 מ"ל. לתרכובת החמה נוספה חומצה הידרוכלורית במהירות והתערובת הוחזקה באמבטיית השמן במשך כשתי דקות, ובמהלכה מרבית המים התאדו. נשבר לחתיכות קטנות ונשטף במים כדי לספק מוצק אמורפי צהוב בהיר. (38 מ"ג, 10%) MP 246-250 מעלות צלזיוס; 1H NMR (500 מגה הרץ, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8.2 הרץ), 7.66 (T, 1 H, J = 8.3 הרץ), 7.77 (D, 1 H , J = 8.6 הרץ), 7.89 (D, 1 H, J = 8.6 הרץ), 8.02 (D, 1 H, J = 8.2 הרץ), 8.35 (D, 1 H, J = 8.3 הרץ) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z מחושב. , נמצא: 243.0704. זרמי פרוטון נמדדו בכתמים פנימיים וחיצוניים של ביציות המבטאות מבנים שונים באמצעות מגבר 200b Axopatch שנשלט על ידי Axon Digidata 1440a (מכשירים מולקולריים) עם תוכנת pclamp10. ) חומצה אתאנסולפונית (MES), 30 מ"מ טטרה-אתילמו-אמוניום (תה) מסילאט, 5 מ"מ כלוריד תה, 5 מ"מ אתילן גליקול-ביס (2-אמינו-אתיל) -n, n, n ', חומצה לא-אטראטית (EGTA), הותאמה ל pH 6.0 עם תה הידרוקסיד. כל המדידות בוצעו ב 22 ± 2 מעלות צלזיוס. לפיפטה יש התנגדות גישה של 1.5–4 MΩ. עקבות זרם סוננו במהירות של 1 קילו הרץ, נדגמו במהירות 5 קילו הרץ ונותחו באמצעות ClampFit10.2 (מכשירים מולקולריים ) ומקור 8.1 (OriginLab). פתרונות המכילים ריכוזים שונים של מעכב HV1 ובמקרים מסוימים הוכנסו 10 מ"מ βME לאמבט על ידי כוח הכבידה דרך סעפת המחוברת למערכת שסתום זלוף VC-6 (Warner Instr.), שהועברה דרך תוכנת PCLAMP TTL (טרנזיסטור- לוגיקה של טרנזיסטור) אותות. ניסויים בזלוף זלוף בוצעו באמצעות עיפרון זלוף רב צינורות (Automate Sci.) עם קצה אספקה ​​בקוטר 360 מיקרומטר שהותקן מול פיפטה של ​​טלאים. +120 MV דופק מקטט. מדידות GV בוצעו כמתואר לעיל 18,20. זרמי זנב נרשמו במהירות -40 mV לאחר שלבי קיטוב במתחים שונים מ- -20 mV ל- +120 mV אלא אם כן צוין אחרת. דופק ההתייחסות שקדם לדופק הבדיקה הוא משמש לתיקון לריקבון נוכחי 18. גרף ה- GV מתאים למשוואת בולצמן: קבועי הניתוק לכאורה (KD) לשילובים שונים של תעלות ומעכבים (טבלה משלימה 1) נקבעו על ידי התאמת תלות הריכוז של עכבה (ערכי מעכב %ממוצע) עם משוואת הגבעה: כאשר [i] הוא ריכוז המעכב I ו- H הוא מקדם הגבעה. לחישוב מקדם הגבעה, משוואה (2) מסודרת מחדש כ: