알로스테릭 결합 프로브를 사용하여 개방형 Hv1 양성자 채널의 하위단위 간 인터페이스에 대한 조사

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VSD의 첫 번째 막횡단 단편의 끝은 결합 부위 사이의 결합을 중재하는 하위 단위 간 인터페이스를 형성하는 반면, 코일 코일 도메인은 이 과정에 직접적으로 관여하지 않습니다. 우리는 또한 채널의 양성자 선택 필터가 차단제 결합 협력성을 제어한다는 강력한 증거를 발견했습니다. . 전압 개폐 양성자 채널은 식물성 플랑크톤에서 인간까지 다양한 유기체에서 중요한 역할을 합니다1. 대부분의 세포에서 이 채널은 양성자막에서 양성자 유출을 중재하고 NADPH 산화효소의 활성을 조절합니다. 인간에게 유일하게 알려진 전압 개폐 양성자 채널 HVCN1 유전자의 산물인 Hv1입니다2,3.Hv1(일명 VSOP)은 B 세포 증식4, 선천적 면역 체계에 의한 활성 산소종 생성5,6,7,8, 정자 세포에서 역할을 하는 것으로 나타났습니다 운동성9 및 기도 표면액의 pH 조절10. 이 채널은 B세포 악성종양4,11, 유방암 및 대장암12,13과 같은 여러 암 유형에서 과발현되는 데 관여합니다. 과도한 Hv1 활성은 암세포의 전이 가능성을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다11,12. 뇌에서 Hv1이 발현됩니다. 미세아교세포(microglia)에 의해, 그 활동은 허혈성 뇌졸중 모델에서 뇌 손상을 악화시키는 것으로 나타났습니다. Hv1 단백질은 S1~S414라고 불리는 4개의 막관통 세그먼트로 구성된 전압 감지 도메인(VSD)을 포함합니다. VSD는 전압 개폐 Na+, K+ 및 Ca2+ 채널과 전압 감지 포스파타제(예: CiVSP)의 해당 도메인과 유사합니다. Ciona Gutis15. 이러한 다른 단백질에서 S4의 C 말단은 효과기 모듈, 기공 도메인 또는 효소에 부착됩니다. Hv1에서 S4는 막의 세포질 측면에 위치한 코일드 코일 도메인(CCD)에 연결됩니다. 채널은 두 개의 VSD로 구성된 이량체 복합체이며, 각각은 개폐 양성자 투과 경로를 포함합니다16,17,18. 이 두 개의 Hv1 하위 단위는 협력적으로 열리는 것으로 밝혀졌으며19,20,21,22, 이는 알로스테릭 결합과 하위 단위 간 상호 작용이 작용함을 시사합니다. 게이팅 과정에서 중요한 역할. 코일 코일 도메인 내의 하위 단위 사이의 인터페이스는 두 개의 격리된 도메인의 결정 구조를 사용할 수 있기 때문에 잘 정의되어 있습니다22,23. 반면에 멤브레인 내의 VSD 사이의 인터페이스는 그렇지 않습니다. Hv1-CiVSP 키메라 단백질의 결정 구조는 이 인터페이스에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 결정화된 채널 복합체의 삼량체 구성은 천연 Hv1 CCD가 효모 류신 지퍼 GCN424로 대체된 결과일 수 있기 때문입니다. Hv1 채널의 하위 단위 구성에 대한 최근 연구에서는 2개의 S4 나선이 2차 구조의 심각한 붕괴 없이 CCD로 전환되어 막에서 시작하여 세포질로 돌출되는 긴 나선이 생성된다는 결론을 내렸습니다. 시스테인 가교 분석을 기반으로, 본 연구에서는 Hv1 VSD가 S4 세그먼트를 따라 서로 접촉한다고 제안합니다. 그러나 다른 연구에서는 VSD 간의 대체 인터페이스를 제안했습니다. 이러한 인터페이스에는 S1 세그먼트 17, 21, 26과 S2 세그먼트 21의 외부 끝이 포함됩니다. 이러한 연구 결과는 닫힌 상태와 열린 상태에 따라 달라지는 게이팅 프로세스와 관련하여 VSD 간의 알로스테릭 결합이 조사되었으며 VSD 간의 인터페이스는 형태의 다양한 상태 변화에 따라 달라질 수 있다는 것입니다. 여기에서 우리는 2-구아니디노티아졸이 두 개의 열린 VSD에 시너지적으로 결합하여 Hv1 채널을 억제하고 화합물 중 하나인 2-구아니디노벤조티아졸(GBTA)을 사용하여 열린 상태에서 하위 단위 간의 상호 작용을 조사한다는 것을 발견했습니다. 인터페이스. 우리는 GBTA 결합 곡선이 하나의 하위 단위에 대한 억제제의 결합이 인접한 하위 단위의 결합 친화력을 증가시키는 정량적 모델로 잘 설명될 수 있음을 발견했습니다. 우리는 또한 잔류물 D112, 선택성 필터가 채널 27, 28 및 구아니딘 유도체 결합 부위 29의 일부는 GBTA 결합 협동성을 제어합니다. 우리는 CCD가 S4 세그먼트에서 분리되는 Hv1 이합체에서 협동 결합이 유지된다는 것을 보여줍니다. 이는 CCD의 하위 단위 간 인터페이스가 직접적으로 GBTA 결합 부위 사이의 알로스테릭 결합을 중재합니다. 대조적으로, 우리는 S1 단편이 하위 단위 사이의 인터페이스의 일부임을 발견하고 S4 나선의 세포외 끝이 이량체의 중심에서 멀리 떨어져 있는 인접한 VSD의 배열을 제안합니다. S1 프래그먼트는 열린 상태가 됩니다. Hv1의 소분자 억제제는 항암제 및 신경보호제로 유용합니다. 그러나 현재까지 채널을 억제할 수 있는 화합물은 거의 없습니다30,31,32,33. 그 중 2-guanidinobenzimidazole(2GBI, 그림의 화합물 [1]) 1a) 및 그 유도체는 VSD29,32 채널을 통한 양성자의 침투를 차단하는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 화합물의 결합은 두 개의 개방형 하위 단위에서 독립적으로 발생하는 것으로 생각됩니다. 2-구아니디노벤조티아졸(GBTA, 그림 1a의 화합물 [2])은 이전에는 200 μM의 농도에서 테스트했을 때 2GBI만큼 효과적으로 Hv1을 억제하는 것으로 나타났습니다 (그림 1b). 우리는 다른 티아졸 유도체를 조사한 결과 이들 중 일부가 GBTA와 유사하거나 더 큰 효능으로 채널을 억제하는 것으로 나타났습니다 (그림 1 및 보충) 텍스트). 우리는 4개의 티아졸 유도체(GBTA 및 화합물 [3], [6] 및 [11], 그림 1c)의 농도 반응 곡선을 결정했으며 2GBI의 것보다 가파른 것을 발견했습니다. 힐 계수(h) 티아졸 유도체의 범위는 1.109 ± 0.040에서 1.306 ± 0.033 사이였습니다(그림 1). 대조적으로, 2GBI에 대한 Hill 계수는 0.975 ± 0.024 29, 그림 2a 및 보충 그림 1)입니다. 1보다 큰 Hill 계수는 결합 협력성을 나타냅니다. 각 Hv1 하위 단위에는 자체 억제제가 있기 때문에 - 결합 부위29,32 우리는 하나의 하위 단위에 대한 티아졸 유도체의 결합이 인접한 하위 단위에 대한 두 번째 억제제 분자의 결합을 향상시킬 수 있다고 추론했습니다. GBTA는 가장 높은 Hill 계수를 가진 테스트 화합물이었습니다. 따라서 우리는 이 화합물을 선택했습니다. 결합 시너지 메커니즘을 추가로 연구하고 2GBI를 참조 음성 대조군으로 사용했습니다. (a) 시험 화합물: [1] 기준 Hv1 억제제 2-구아니디노-벤즈이미다졸(2GBI).[2] 2-구아니디노-벤조티아졸(GBTA), [3](5-트리플루오로메틸-1,3-벤조티아졸-2-일)구아니딘, [4] 나프토[1,2-d][1,3]티아졸-2-일 -구아니딘, [5](4-메틸-1,3-티아졸-2-일)구아니딘, [6](5-브로모-4-메틸-1,3-티아졸-2-일)구아니딘, [7] 파모티딘, [8] 2-구아니디노-5-메틸-1,3-티아졸-4-카르복실산 에틸 에스테르, [9] 2-구아니디노-4-메틸 에틸-1,3-티아졸-5-카르복실레이트, [10 ](2-구아니디노-4-메틸-1,3-티아졸-5-일)에틸 아세테이트, [11]1-[4-(4-클로로페닐)-1,3-티아졸-2-일]구아니딘, [ 12]1-[4-(3,4-디메톡시페닐)-1,3-티아졸-2-일]구아니딘.(b) 표시된 구아니디노티아졸 및 기준 화합물 2GBI(청록색 막대)에 의한 인간 Hv1 활성 억제 .Hv1 양성자 전류는 -80mV ~ +120mV의 유지 전위에서 탈분극에 반응하여 Xenopus 난모세포의 내부 플라크에서 측정되었습니다. 각 억제제는 200μM 농도로 욕조에 추가되었습니다.pHi = pHo = 6.0 .데이터는 평균 ± SEM입니다(n≥4).(c) 화합물 [2], [3], [6] 및 [11]에 의한 인간 Hv1의 농도 의존적 ​​억제. 각 점은 3의 평균 억제 ± SD를 나타냅니다. 최대 15개 측정. 이 선은 보충 표 1에 보고된 겉보기 Kd 값을 얻기 위해 사용된 Hill Fit입니다. Hill 계수는 보충 그림 1에 보고된 Fit에서 결정되었습니다. h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h(11) = 1.179 ± 0.036(방법 참조). (a,b) 화합물 2GBI 및 GBTA는 농도 의존적 ​​방식으로 이량체 및 단량체 Hv1을 억제했습니다. 각 점은 3~8회 측정의 평균 억제 ± SD를 나타내며 곡선은 Hill fit입니다. Hill 계수(h)는 삽입 된 히스토그램은 보충 그림 3과 4에보고 된 적합치로부터 결정되었습니다. (a)에 표시된 GBTA의 농도 반응은 그림 1c와 동일합니다. 겉보기 Kd 값은 보충 표 1을 참조하십시오. (c) 모델링 이량체 Hv1에 대한 GBTA의 협력적 결합. 검정색 실선은 (d)에 표시된 결합 모델을 설명하는 식(6)에 의한 실험 데이터에 대한 적합성을 나타냅니다. Sub 1 및 Sub 2로 표시된 점선은 이분자 연관성을 나타냅니다. - 각각 첫 번째 및 두 번째 결합 이벤트의 해리 평형 곡선(하위 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; 하위 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) 제안된 Hv1 블록 메커니즘의 개략도. GBTA의 경우 하나의 개방형 하위 단위에 결합하면 인접한 개방형 하위 단위의 친화도가 증가합니다(Kd2 0.05)를 발견했습니다(그림 5c). 두 개의 하위 단위가 함께 중요하지만 CCD는 GBTA 결합 부위 사이의 하위 단위 간 알로스테릭 결합을 직접 중재하지 않습니다. (a) 세포질 코일 코일 도메인(파란색 화살표)에 의해 매개되는 하위 단위간 결합을 방해하도록 설계된 S4의 내부 말단에 트리글리신 돌연변이가 있는 Hv1 이량체의 도식적 다이어그램.(b) Hv1 이량체 및 결찰 이량체의 도식적 표현 하위 단위 사이의 결합에 관여하는 S1 단편을 테스트하기 위해 설계된 표시된 돌연변이(파란색 화살표).(c-h) 2GBI(청록색) 및 GBTA(진한 빨간색)는 표시된 구성을 농도 의존 방식으로 억제합니다. 각 점은 평균 억제를 나타냅니다. 3~10회 측정의 ± SD. 곡선은 겉보기 Kd 값을 얻기 위해 사용된 힐 핏이었습니다(보충 표 1 참조). 보간된 히스토그램의 힐 계수는 방법 섹션에 설명된 대로 결정되었습니다(보충 그림 3 및 4 참조). Hv1 WT는 점선으로 표시됩니다. 별표는 돌연변이와 WT 계대 사이의 통계적으로 유의미한 차이를 나타냅니다(p 0.05, 그림 5d, i) ). 반면, 돌연변이 D123A는 GBTA의 Hill 계수를 크게 감소시켰으며(p 0.05/14). 두 하위 단위의 위치 123의 전하를 중화하면 GBTA 결합 협력성이 크게 변한 반면 두 하위 단위의 전하를 역전시키는 것은 작은 효과만 나타냈기 때문에 우리는 반전 전하 채널이 있는 하나의 하위 단위만 포함하도록 분석을 확장했습니다. C 말단 서브유닛에서 D123R 치환으로 Hv1 연결 이량체를 생성하고(그림 5b) GBTA 및 2GBI에 의한 농도-반응 억제를 측정했습니다. 우리는 WT-D123R 채널에 결합하는 GBTA의 Hill 계수가 그보다 훨씬 높다는 것을 발견했습니다. 야생형 Hv1의 결과(p 0.05). 우리는 또한 βME가 없는 경우 D112E I127C Hv1 이량체에 결합하는 GBTA의 Hill 계수가 환원제의 존재 하에서 측정된 것보다 상당히 높다는 것을 발견했습니다(그림 6e 및 보충 그림 4). 이는 D112E 돌연변이 시스테인 127의 가교로 인한 GBTA 결합 협력성의 증가를 폐지하지 않았습니다. D112E, I127C Hv1 이합체에 결합하는 2GBI의 Hill 계수는 D112E 돌연변이에 의해 크게 영향을 받지 않았습니다(그림 1).6d 및 보충 그림 3). 종합하면, 이러한 발견은 GBTA 결합이 매력적인 정전기적 상호작용을 통해 또는 치환된 시스테인 사이의 공유 결합 형성을 통해 인접한 Hv1 하위 단위에 있는 S1 단편의 바깥쪽 끝 사이의 상호 작용에 의해 강화된다는 것을 시사합니다. 사이트 간의 알로스테릭 결합이 증가하고 결합 협동성을 초래합니다. 협동성에 대한 매력적인 정전기 상호작용의 효과는 돌연변이 D112E에 의해 폐지될 수 있지만, 공유 결합의 효과는 폐지될 수 없습니다. 구아니딘 유도체를 Hv1 채널에 결합시키는 데 사용할 수 있는 화학적 공간을 조사하면서 GBTA와 같은 2-구아니디노티아졸이 2-구아니디노벤지미다졸보다 농도 의존성이 더 가파르다는 것을 발견했습니다(그림 1c). 및 단량체 채널(그림 2a, b)과 하나의 하위 단위가 억제제에 미리 결합된 이량체 채널(그림 4)을 통해 우리는 GBTA에 의한 Hv1 억제 작용이 시너지 과정이라는 결론을 내릴 수 있었습니다. 두 하위 단위에 있는 화합물의 결합 부위는 알로스테릭 결합되어 있습니다. 관련 화합물 2GBI32에 대해 이전에 표시된 것처럼 GBTA가 열린 채널에 결합한다는 발견은 알로스테릭 결합이 열린 상태에서 구체적으로 평가될 수 있음을 시사합니다. 우리의 협력 결합 모델 GBTA에 의한 HV1의 억제를 정량적으로 설명 할 수 있었고 (도 2C) 막 재분극 후 채널 꼬리 전류의 붕괴에 대한 2GBI 및 GBTA의 다른 효과를 설명 할 수 있었으며, 이는 결합 공정의 해석을 지원한다. 2 개의 결합 부위 (예 : HV1)를 갖는 알로 스테 릭 단백질에서 달성 할 수있는 최대 언덕 계수는 2입니다. 우리는 1.31의 계수와 HV1 야생형 결합하기 위해 GBTA를 측정하여 HV1 I127C에서 1.88로 증가했습니다. 상승적 자유 에너지, 가장 낮고 가장 높은 친화력 부위의 결합 자유 에너지 (방법 참조)의 차이는 HV1 야생형 및 HV1 I127C의 경우 2.7 kcal/mole의 경우 1.3 kcal/mole이었다. Hemoglobin에 대한 산소의 가장 유명하고 잘 연구 된 공동 작업 과정의 예입니다. KCAL/MOL, 실험 조건에 따라 38. 글로벌 에너지의 관점에서, HV1에 대한 GBTA 결합의 협력은 두 시스템에서 상이한 수의 단백질 서브 유닛이 고려 될 때 헤모글로빈에 대한 O2 결합의 협력과 실질적으로 다르지 않다. 우리의 시너지 모델에서, GBTA 분자의 하나의 서브 유닛에 대한 결합은 인접한 서브 유닛의 결합 친화력을 증가시킨다. 이러한 변화에 대한 응답에서 인접한 서브 유닛은 결합 부위를 변경하여 GBTA 결합을 더 강하게 만듭니다.이 과정에서 S1 아스파 테이트 D112는 증가 된 결합 친화력과 관련된 결합 부위의 재 배열을 담당합니다. D112 이전에 HV1 양성자 투과 경로의 일부인 것으로 나타 났으며 선택성 필터 27,28로서 작용하는 것으로 나타났다. 우리의 결과 2 개의 HV1 서브 유닛의 선택성 필터는 개방 상태에 동시에 결합된다는 것을 보여줍니다. 그림 7A는 HV1 VSD 기반의 개략도에서 GBTA 결합 부위의 근사 위치 및 잔류 물 D112, D123, K125 및 I127의 위치를 ​​보여줍니다. HV1-CIVSP 키메라의 결정 구조에서 S1의 세포 외 끝을 포함하는 알로 스테 릭 커플 링을위한 방향이 검은 색 화살표로 표시됩니다. (a) HV1-CIVSP 키메라의 결정 구조를 기반으로 HV1 vSD의 개략도, 나선형 세그먼트는 원통형 인 것으로 나타났습니다.이 구성에서 S4 세그먼트의 내부 끝은 CCD와 병합됩니다 (표시되지 않음). 결합 된 GBTA의 예측 된 위치는 회색 타원으로 표시됩니다. 블랙 화살표는 두 개의 인접한 서브 유닛에서 결합 부위 사이의 알로 스테 릭 커플 링에 관여하는 경로를 나타냅니다. 조사 된 S1 잔기의 위치에는 색 구체가 표시됩니다. 멤브레인 평면의 세포 외 측면에서 볼 수있는 두 개의 다른 이량 체 구성에서 왼쪽 패널에서, 이량 체 인터페이스는 S4 나선에 의해 형성된다. 두 S4 나선 (점선 화살표)의 외부 끝을 분리하면 오른쪽에 표시된 배열이 생성됩니다.이 구성에서는 인접한 서브 유닛의 잔류 물 D123 및 I127 4G80 결정 구조에있는 이량 체 구성에서 Civsp의 P140은 HV1의 위치 D123에 해당한다. 우리의 결과 잔기 123 (123D/123D 또는 123R/123R) 사이의 반발 정전기 상호 작용은 개방 상태에서 "정상적인"GBTA- 결합 협력 성과 관련이 있고 반발에서 상호 작용을 끌어 당기는 (123D/123R)로 이동 함을 보여준다. , 증가 된 협력 (도 5G). 알라닌 치환과의 반발 상호 작용의 제거는 또한 협력을 증가시킬 것으로 예상되지만, 123A/123A 이량 체의 협력 감소가 관찰되었다 (그림 5E). 친수성 환경에 소수성 잔류 물을 배치하는 불안정화 효과는 D123 잔기 사이의 반발 상호 작용의 제거로 인해 안정화 효과를 능가하여 결합 협력성의 전반적인 감소를 초래할 수 있습니다. Ciona Gutis Ci-HV1 (인간 HV1에서 D123에 해당)의 위치 D171은 활성화시 D123이 개방 상태의 친수성 환경에 위치한다는 개념을지지한다. HV1 채널의 게이팅은 여러 전환을 통해 발생하는 것으로 알려져 있습니다. , 양자가 두 서브 유닛 경로에서 전도를 개방하게하는 뚜렷한 전이가 이어졌다. 전압 센서의 구조적 변화는 전압-클램프 형광에 의해 모니터링되었고, 제 2 전이는 위치 D171에서의 돌연변이에 의해 선택적으로 교란 된 것으로 밝혀졌다. 형광 신호의 섭동은 형태 변화의 반응 좌표에 따라 인접한 서브 유닛의 D171 잔기 사이의 정전기 상호 작용의 존재와 일치한다.이 해석은 D123 잔기가 개방 상태에서 정전기 적으로 상호 작용한다는 우리의 발견과 일치한다. GBTA 결합 부위 사이의 알로 스테 릭 커플 링을 매개합니다. Fujiwara et al25는 세포질 코일 코일 도메인의 이량 체 인터페이스가 막 내로 확장되어 2 개의 S4 나선 (도 7b, 왼쪽 패널)을 포함한다고 제안했다. 막 횡단 pH 구배가 없으면 S4 나선 및 CCD를 연결하는 영역의 전체 VSD 및 기능 분석은 개방에 상당한 막 탈분극이 필요하며, 시스테인 가교는 채널이 주로 닫히는 조건 하에서 발생합니다. 따라서 감지 된 S4-S4 인터페이스는 오프-스테이트 서브 유닛 구성을 반영 할 가능성이 높습니다. 다른 연구는 게이 팅 동안 서브 유닛 상호 작용에 S1과 S2가 관여하는 것에 대한 증거를 발견하여 채널이 개방 및 개방형 및 다른 서브 유닛 구성을 채택 할 수 있음을 시사합니다. 폐쇄 된 상태, Mony et al.의 발견과 일치하는 아이디어. S1은 게이팅 중에 39를 움직입니다. 여기서, 우리는 개방 상태에서 S1 나선의 세포 외 끝이 서브 유닛 사이의 알로 스테 릭 커플 링을 매개하는 직접 정전기 상호 작용을 지원할 정도로 충분히 가깝다는 것을 보여줍니다. 확장 된 S4-S4 상호 작용을 갖는 이량 체 구성에서 S1 나선이 너무 멀다는 것을 보여줍니다. 서로 직접 상호 작용할 수는 없지만, 막 평면에 수직 인 축 주위의 두 VSD 서브 유닛의 20 ° 시계 방향 회전은 두 S4 나선의 외부 끝의 분리와 결합하여 S1-S1 구성이 일관된 일관된 결과를 얻었습니다. 우리의 연구 결과 (그림 7b, 오른쪽 패널)와 함께 개방 상태의 채널에 대한이 구성을 권장합니다. CIVSP 효소는 단량체로서 기능하는 것으로 생각되지만 분리 된 VSD의 결정 구조는 이량 체 상태로 포착되며,이 이량 체의 S1 나선의 외부 끝은 공간적으로 가깝고 전체 구성은 제안 된 것과 유사합니다. HV1 (도 7C)의 경우, Civsp 이량 체에서, 인접한 서브 유닛으로부터 가장 가까운 잔류 물은 위치 140에서 프롤린이었다 (도 7C). Civsp 이량 체는 이들 단백질의 VSD가 S1의 세포 외 말단이 상호 작용하는 계면을 형성하는 고유 한 경향이 있음을 시사한다. 정자 세포 활성화에서 HV1의 필수 역할은이 채널이 남성 생식력의 제어를위한 매력적인 약물 표적이된다. 유방암 12 또는 결장 직장암 13 환자에서의 생존은 B- 세포 악성 종양에 기여하는 것으로 생각된다. 결합 친화력이 증가하는 개방형 HV1 서브 유닛은 HV1 채널을 대상으로보다 강력한 약물의 발달로 이어질 수 있습니다. 인간 HV1의 부위 지향적 돌연변이 유발은 표준 PCR 기술을 사용하여 수행되었으며, HV1NCCIVSP 구성에서, HV1의 잔기 1-96 및 228-273을 Civsp18의 잔기 1-113 및 240-576으로 대체 하였다. 하나의 서브 유닛의 C- 말단은 Ggsgggsgsgsggsgggsgggsgg 링커를 통한 제 2 서브 유닛의 N- 말단에 연결되어있다. 다양한 구조물을 함유하는 PGEMHE 플라스미드는 NHE1 또는 SPH1 제한 효소 (New Endland Biolabs)로 선형화되었고 RNA 합성이 수행되었다. T7 MMESSAGE Mmachine 전사 키트 (Ambion) .1-3 일 전기 생리 학적 측정 전, CRNA를 Xenopus 난 모세포 (세포 당 50nl, 0.3-1.5 μg/μl)에 주사 하였다. ecocyte bioscience로부터, 파종 RNA 주사, 세포는 96 mm NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mm CaCl, 1 mM mgCl, 10 mM 간, 5 mM 피루 베이트, 100 μg/ml gentamicin, pH 7.2 18 ° C를 함유하는 ND96 배지에서 유지되었다. . 2-guanidino-benzimidazole [1], 2-Guanidino-Benzothiazole [2], (4- 메틸 -1,3- 티아 졸 -2- 일) 구아니딘 [5], (5- 브로 -4- 메틸 -1,3 -thiazol-2- 일) 구아니딘) [6], 에틸 2- 구아 니 디노 -5- 메틸 -1,3- 티아 졸 -4- 카르 복실 레이트 [8], 에틸 2- 구아 니 디노 -4- 메틸 -1,3- 티아 졸-티아 졸- 5- 카르 복실 레이트 [9] 및 (2-guanidino-4- 메틸 -1,3- 티아 졸 -5- 일) 에틸 아세테이트 [10]은 Sigma-Aldrich.famotidine [7]은 MP Biomedical.1- [4 -(4- 클로로 페닐) -1,3- 티아 졸 -2- 일] 구아니딘 [11] 및 1- [4- (3,4- 디메 톡시 페닐) -1,3- 티아 졸 -2- 일] 구아니딘 [12] 매트릭스 과학적 으로부터이 화합물은 상업적으로 이용 가능한 순도가 가장 높으며, 건식 DMSO에 용해되어 100 mm 스톡 용액을 생성 한 다음, 원하는 최종 농도에서 기록 용액에 희석된다. 적어도 99% 순도. 25ml의 수성 히드로 클로로 산 (2.5 N) 중 2- 아미노 -4- (트리 플루오 로메틸) 벤젠에 네티 올 하이드로 클로라이드 (1.02 g, 4.5 mmol)의 현탁액으로 고체 디 니아 미드 (380 mg, 4.5 mmol)를 첨가 하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 수산화 칼륨 10N 칼륨을 점진적으로 첨가하여 중화 시켰으며, 형성된 흰색 침전물을 여과하고, 차가운 물 (3 × 50 mL)으로 세척하고 오븐에서 건조시켰다. 65 ℃) 몇 시간 동안,이어서 에틸 아세테이트/석유 에테르로부터 재결정 화되어 백색 고체 (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (라이트 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6) : δ [PPM] = 7.25 (매우 넓은 S, 4 H), 7.40 (D, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (S, 1 H), 7.92 (D , 1 H, J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6) : δ = 114.2 (D, J = 3.5 Hz), 117.5 (D, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (Q, J, J = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31.6Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI) : M/Z C9H8F3N4S (M + H) + : 261.0416, 발견 : 261.0419. 나프토 [1,2-D] 전술 한 바와 같이 합성 된 나프 토 [1,2-D] 티아 졸 -2- 아민 (300 mg, 1.5 mmol)은 작은 시험관에서 오일 욕에서 200 ℃로 가열되었다. 뜨거운 화합물에 1.0 ml conc. holdroced를 빠르게 첨가하고 혼합물을 약 2 분 동안 오일 욕에 보관하고, 그 동안 대부분의 물이 증발시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 옅은 노란색 비정질 고체를 제공하기 위해 작은 조각으로 나누고 물로 세척했습니다. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O) : δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (T, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (D, 1 H , J = 8.6Hz), 7.89 (d, 1 H, J = 8.6Hz), 8.02 (d, 1 H, J = 8.2Hz), 8.35 (d, 1 h, j = 8.3Hz) .13C NMR (150 MHZ, DMSO-D6) : δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI) : m/z 계산 값. , 발견 : 243.0704. 양성자 전류는 PCLAMP10 소프트웨어를 갖는 축삭 디지 다다 1440A (분자 장치)에 의해 제어되는 Axopatch 200b 앰프를 사용하여 상이한 구조물을 발현하는 난 모세포의 내부 및 외부 패치에서 측정되었다. ) 에탄 설 폰산 (MES), 30mM 테트라 에틸 암모늄 (차) 메실 레이트, 5mM 차 클로라이드, 5mM 에틸렌 글리콜-비스 (2- 아미노 에틸) -N, N, N ', N'Tetraacetic Acid (EGTA). 22 ± 2 ° C에서 차량 하이드 록 사이드를 갖는 pH 6.0을 수행 하였다. 피펫은 1.5-4 MΩ의 접근 저항을 가졌다. 전류 흔적은 1kHz에서 여과하고 5kHz에서 샘플링하고 CLAMPFIT10.2로 분석 하였다. ) 및 Origin8.1 (OriginLab). 다양한 농도의 HV1 억제제 및 경우에 따라 10 mM βME를 함유하는 용액은 VC-6 관류 밸브 시스템 (Warner Instr.)에 연결된 매니 폴드를 통해 중력에 의해 욕조에 도입되었으며, 이는 PCLAMP 소프트웨어 TTL (Transistor- 트랜지스터 로직) 신호. rapid 관류 실험은 패치 피펫 앞에 장착 된 360 μm 직경 전달 팁을 사용하여 다중 튜브 관류 연필 (자동 Sci.)을 사용하여 수행되었다. +120 MV 탈분극 펄스 .GV 측정은 앞서 설명한대로 18,20. 테일 전류를 -20 mV 내지 +120 mV의 상이한 전압에서 탈분극 단계에서 -40 mV로 기록했다. GV 그래프는 볼츠만 방정식에 적합합니다. 채널 및 억제제의 상이한 조합에 대한 겉보기 해리 상수 (KD)는 억제의 농도 의존성 (평균 %억제 값)을 적합함으로써 결정되었다. 언덕 방정식의 경우 : 여기서 [i]는 억제제 I의 농도가 언덕 계수입니다. 언덕 계수를 계산하기 위해 방정식 (2)은 다음과 같이 재 배열됩니다.