Interrogatioun vun der Intersubunit Interface vum oppene Hv1 Protonkanal mat enger allosteresch gekoppelter Sonde

Merci fir besicht Nature.com.D'Browserversioun déi Dir benotzt huet limitéiert Ënnerstëtzung fir CSS.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierten Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).An der Tëschenzäit, fir sécherzestellen. weider Ënnerstëtzung, wäerte mir de Site ouni Stiler a JavaScript affichéieren. Den Hv1 voltage-gated Proton Channel ass en dimeresche Komplex, deen aus zwee Voltage-Sensing Domains (VSDs) besteet, all vun deenen e gated Proton Permeation pathway enthält. den oppene Staat a béide VSDs ass bekannt datt se kooperativ geschéien; allerdéngs ass wéineg iwwer d'Basismechanismus bekannt.Intersubunit Interfaces spillen eng Schlësselroll an allosteresche Prozesser; awer, esou Schnëttplazen hunn net an oppen Hv1 Channels identifizéiert ginn. Hei weisen mir datt 2-guanidinothiazole Derivate zwee Hv1 VSDs op eng kooperativ Manéier blockéieren an eng vun dëse Verbindungen als Sonde fir allosteresch Kupplung tëscht oppenen Ënnerunitéiten benotzen. Mir hu festgestallt datt déi extrazellulär Enn vun der éischter transmembrane Fragment vun VSD Formen eng intersubunit Interface datt Kopplung tëscht bindende Siten mediates, iwwerdeems de coiled-coil Domain net direkt an dësem Prozess involvéiert ass. . Voltage-gated Proton Channels spille wichteg Rollen an enger Vielfalt vun Organismen, vu Phytoplankton bis Mënschen1.An de meeschte Zellen vermëttelen dës Kanäl Protoneflux vun der Protonmembran a reguléieren d'Aktivitéit vun NADPH-Oxidase. ass Hv1, dat ass d'Produkt vum HVCN1 Gen2,3.Hv1 (alias VSOP) gouf gewisen eng Roll bei der B Zell Prolifératioun ze spillen4, Produktioun vu reaktive Sauerstoffaarten duerch den gebuerene Immunsystem5,6,7,8, Spermienzelle Motility9 a pH-Reguléierung vun der Airway Surface Fluid10. Dëse Kanal ass involvéiert a verschiddene Overexpressed a Kriibsarten wéi B-Zell Malignitéiten4,11 a Brust- a Kolorektalkrebs12,13.Exzessiv Hv1 Aktivitéit gouf fonnt fir de metastateschen Potenzial vu Kriibszellen 11, 12 ze erhéijen.Am Gehir gëtt Hv1 ausgedréckt. duerch Mikroglia, a seng Aktivitéit gouf gewisen fir Gehirschued bei Modeller vun ischämesche Schlaganfall ze verschäerfen. D'Hv1 Protein enthält eng Volt-Sensing Domain (VSD), déi aus véier transmembrane Segmenter genannt S1 zu S414 besteet. D'VSD gläicht déi entspriechend Beräicher vun voltage-gated Na+, K+ an Ca2+ Channels a Spannungsempfindlech phosphatases, wéi CiVSP aus Ciona gutis15.An dësen anere Proteinen ass den C-Terminus vu S4 un engem Effektormodul, dem Pore-Domain oder Enzym befestegt.An Hv1 ass S4 mat dem coiled-coil-Domain (CCD) verbonnen, deen op der zytoplasmescher Säit vun der Membran läit. .De Kanal ass en dimeresche Komplex, deen aus zwee VSDs besteet, all mat engem gated Proton Permeatiounswee16,17,18. Dës zwee Hv1 Ënnerunitéiten goufen fonnt fir kooperativ opzemaachen19,20,21,22, wat suggeréiert datt allosteresch Kupplung an Inter-Ënnerunitéit Interaktiounen spillen eng wichteg Roll am Gatingprozess.D'Interface tëscht den Ënnerunitéiten an der coiled coil Domain ass gutt definéiert well d'Kristallstrukture vun den zwee isoléierten Domainen verfügbar sinn22,23.Op der anerer Säit ass d'Interface tëscht VSDs bannent der Membran net gutt verstanen.D'Kristallstruktur vum Hv1-CiVSP chimeresche Protein liwwert keng Informatioun iwwer dës Interface, well d'trimeresch Organisatioun vum kristalliséierte Kanalkomplex kann aus dem Ersatz vun der gebierteg Hv1 CCD duerch d'Heefleucin Zipper GCN424 entstoen. Eng rezent Studie vun der Ënnerunitéitsorganisatioun vum Hv1-Kanal huet ofgeschloss datt zwee S4-Heliken an d'CCD iwwerginn ouni schwéier Stéierung vun der sekundärer Struktur, wat zu laange Helices resultéiert, déi vun der Membran ufänken an an den Zytoplasma projizéieren. dëser Etude proposéiert, datt Hv1 VSDs Kontakt all aner laanscht de S4 Segment. Wéi och ëmmer, aner Studien hunn alternativ Schnëttplazen tëscht VSDs proposéiert. Dës Schnëttplazen och S1 Segmenter 17, 21, 26 an de baussenzegen Enn vun S2 Segment 21. A méiglech Ursaach fir d'konflikt Resultater vun dësen Studien ass, datt allosteric Kopplung tëscht VSDs par rapport zu der gating Prozess iwwerpréift gouf, déi hänkt op der zougemaach an oppen Staaten, an der Interface tëscht VSDs kann a verschiddene Staat Ännerungen an conformation variéieren. Hei hu mir festgestallt datt 2-guanidinothiazole Hv1 Channels hemmt duerch synergistesch Bindung un zwee oppe VSDs, a benotzt ee vun de Verbindungen, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), fir d'Interaktioun tëscht Ënnerunitéiten am oppene Staat z'ënnersichen. Interface.Mir hu festgestallt, datt d'GBTA Bindungskurve gutt duerch e quantitative Modell beschriwwe ka ginn, an deem d'Bindung vun engem Inhibitor un eng Ënnerunitéit zu enger Erhéijung vun der Bindungsaffinitéit vun der ugrenzender Ënnerunitéit resultéiert. Kanal 27, 28 an en Deel vun der guanidine derivative bindend Site 29 Kontroll GBTA bindend cooperativity.We weisen datt kooperativ bindend am Hv1 dimer erhale bleift, wou d'CCD aus der S4 Segment trennt, suggeréiert datt d'intersubunit Interface an der CCD net direkt heescht. vermëttelen allosteresch Kopplung tëscht GBTA-bindende Siten. Am Géigesaz, fanne mir datt de S1-Fragment Deel vun der Interface tëscht den Ënnerunitéiten ass a proposéieren eng Arrangement vun ugrenzend VSDs mat dem extrazellulären Enn vun der S4-Heliks ewech vum Zentrum vun der Dimer fir z'erméiglechen. de S1 Fragment am oppenen Zoustand ze sinn. Kleng Molekül Inhibitoren vun Hv1 sinn nëtzlech als anticancer Drogen an neuroprotective Agents. Wéi och ëmmer, puer Verbindungen konnten de Channel30,31,32,33 inhibit. Ënnert hinnen, 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, Verbindung [1] an Fig. 1a) a seng Derivate goufen fonnt fir VSD29,32 Permeatioun vu Protonen duerch de Kanal ze blockéieren.Bindung vun esou Verbindunge gëtt ugeholl datt se onofhängeg an den zwou oppenen Ënnerunitéiten geschéien.2-guanidinobenzothiazol (GBTA, Verbindung [2] an der Figur 1a) war. virdrun gewisen Hv1 bal esou effektiv wéi 2GBI ze inhibit wann op enger Konzentratioun vun 200 μM (Dorënner 1b) getest. Mir iwwerpréift aner thiazole Derivate a fonnt, datt e puer vun hinnen de Kanal mat ähnlechen oder méi grouss Potenz wéi GBTA inhibited (Fig. 1 an Zousaz. Text).Mir hunn d'Konzentratiounsreaktiounskurven vu véier Thiazol-Derivate (GBTA a Verbindungen [3], [6] an [11], Fig. 1c) bestëmmt a fonnt datt se méi steiler waren wéi déi vun 2GBI. The Hill Koeffizienten (h) vun Thiazol-Derivate gounge vun 1.109 ± 0.040 bis 1.306 ± 0.033 (Fig. 1c an Zousaz Lalumi 1). Am Géigesaz, der Hill Koeffizient fir 2GBI war 0,975 ± 0,024 29, Lalumi 2a an Zousaz Lalumi 1).A Hill Koeffizient iwwer 1 weist bindend Kooperativitéit. Well all Hv1 subunit huet seng eege inhibitor- bindend Site,29,32 mir begrënnen datt d'Bindung vun engem Thiazol-Derivat un eng Ënnerunitéit d'Bindung vun enger zweeter Inhibitormolekül un d'Nopeschsubunit verbesseren kéint.GBTA war d'Testverbindung mam héchsten Hill-Koeffizient. weider de Mechanismus vun bindender Synergie studéieren a benotzt 2GBI als Referenz negativ Kontroll. (a) Testverbindungen: [1] Referenz Hv1 Inhibitor 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazol (GBTA), [3] (5-trifluormethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidin, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidin, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [6](5-Brom-4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazol-4-carboxylsäure Ethylester, [9] 2-guanidino-4-methylethyl-1,3-thiazol-5-carboxylat, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethylacetat, [11]1-[4-(4-Chlorphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidin.(b) Inhibitioun vun der mënschlecher Hv1 Aktivitéit duerch déi uginn Guanidinothiazolen an der Referenzverbindung 2GBI (blo-gréng Baren) .Hv1 Proton Stréimunge goufen an bannen-eraus plaques vun Xenopus oocytes an Äntwert op depolarization vun engem Holding Potential vun -80 mV zu +120 mV.Each inhibitor gemooss an d'Bad bei enger Konzentratioun vun 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Date si mëttlerer ± SEM (n≥4). (c) Konzentratioun-ofhängeg Inhibitioun vum Mënsch Hv1 duerch Verbindungen [2], [3], [6] an [11]. All Punkt stellt d'Moyenne Hemmung ± SD vun 3 duer. zu 15 Miessunge. D'Linn ass eng Hill Fit benotzt fir déi anscheinend Kd Wäerter ze kréien, déi an der Zousaztabelle 1 gemellt goufen. 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (kuckt Methoden). (a,b) Compounds 2GBI and GBTA inhibited dimeric and monomeric Hv1 in a concentration-dependent manner.All Punkt stellt d'Moyenne Hemmung ± SD vun 3 bis 8 Miessunge duer an d'Kurve ass eng Hill fit.The Hill coefficients (h) shown in der inset histograms sech aus der passt gemellt an Zousaz Lalumi 3 an 4.D'Konzentratioun Äntwert vun GBTA gewisen an (a) ass déi selwecht wéi déi an Lalumi 1c.See Zousaz Table 1 fir scheinbar Kd Wäerter. (c) Modelléierung vun déi kooperativ Bindung vun GBTA zu dimeric Hv1. Déi zolidd schwaarz Linn duerstellt der fit un d'experimentell Donnéeën vun Equatioun (6), déi beschreift de verbindlechen Modell gewisen an (d). -Dissoziatioun Gläichgewiicht Kurven vun den éischten an zweete Bindungsevenementer respektiv (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Schematesch Diagramm vum virgeschloene Mechanismus vum Hv1-Block.Am Fall vun der GBTA erhéicht d'Bindung un eng oppe Subunit d'Affinitéit vun der ugrenzend oppener Ënnerunitéit (Kd2 Fir quantitativ d'kooperativ Bindung vun GBTA op de Kanal ze beschreiwen, hu mir e Modell benotzt an deem entweder Ënnerunitéit déi éischt Inhibitormolekül no enger bimolekulärer Reaktioun mat enger Dissoziatiounskonstant Kd1 binde kann (Figebam. 2c, Sub 1, OO + B ⇆ BO * ). Bindung bewierkt datt de Kanal e Staat adoptéiert, an deem déi verbleiwen eidel Ënnerunitéiten un den Inhibitor binden no enger eenzegaarteger bimolekulärer Reaktioun mat enger Dissoziatiounskonstant Kd2, wou Kd2 Wann déi zweet Inhibitor Molekül gebonnen ass, hunn béid Ënnerunitéiten eng Dissoziatiounskonstant Kd2 (Fig. 2d).Channel Hemmung gouf ënner depolariséierende Konditiounen (+120 mV) gemooss. OO an der Fig. 2d) ware virdru fonnt datt se vernoléisseg zum Hv1 Stroum ënner dëse Konditioune bäidroen19,20 an dofir waren se net am verbindleche Modell abegraff. Déi zolidd schwaarz Linn an der Figur 2c ass d'Passung vun der Modellequatioun op d'experimentell Konzentratiouns-Äntwertkurve, déi e Kd1 vun ~290 μM an e Kd2 vun ~29 μM (Methoden Sektioun, Equatioun (6)) erliewt. De Modell beschreift och d'Bindung vun 2GBI, wou Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). Am monomere Hv1 gëtt et nëmmen eng Bindungsplaz an eng Kdm (O° + B ⇆ B°). Am Fall vun GBTA ass Kdm ëm 54 μM, wat méi ähnlech wéi Kd1 ass wéi Kd2 (Fig. 2d).An anere Wierder, d'Bindungsplaz vum Monomer ass an enger Konfiguratioun (O°) méi ähnlech wéi den Héichaffinitéitszoustand (BO*) wéi de Low- Affinitéitszoustand (OO) vum Dimer, héchstwahrscheinlech wéinst der Eliminatioun vun der Interface tëscht Ënnerunitéiten. Wéi virdru fir 2GBI32 gewisen, hu mir festgestallt datt GBTA Hv1 Stréim ënnerdréckt huet andeems de Kanal blockéiert wann et op war anstatt datt et méi schwéier ass fir opzemaachen (Supplementary Fig. 2a, b, d). als Äntwert op d'Membranrepolariséierung, awer dëst Phänomen gouf net an der GBTA observéiert (Ergänzlech Fig. 2c). An der Präsenz vun der Hv1 Inaktivéierung an der Präsenz vun 2GBI kënnen d'Paarten an all Ënnerunitéit net zoumaachen, bis de Blocker de Bindungsplaz verléisst (d' " foot gate" Mechanismus), an 2GBI entbindt méi lues wéi d'Paart zoumaachen.Wann een Hv1-Ënnerunitéit deblockéiert an zou ass, während déi ugrenzend Ënnerunitéit blockéiert bleift, gëtt d'Ofbindung vun de verbleiwen 2GBI-Moleküle méi lues (Blocker-Fang). nëmmen eng blockéiert Ënnerunitéit féiert Protonen transient virum Zoumaache a mécht e wesentleche Bäitrag zum lues zerfallende Schwanzstroum. D'Entdeckung datt den Zerfall vun Hv1 Schwänzstroum net wesentlech an der Präsenz vu GBTA verlangsamt gouf (Ergänzungsbild 2c) ass konsequent mat engem synergistesche Bindungsmechanismus fir dësen Blocker (Fig. 2d). , fällt d'Affinitéit vum Blocker zu der ugrenzend Ënnerunitéit ongeféier 10-fach erof, wat den onverbindleche Prozess favoriséiert.Dëst bedeit datt déi zweet Molekül vu GBTA eng vill méi héich Chance huet fir sech z'entwéckelen ier se an de Kanal gefaange gëtt.Long-lived channel species that produzéiere nëmmen eng Spär subunit ginn erwaart vill méi reichend an der Präsenz vun GBTA wéi an der Präsenz vun 2GBI, doraus zu méi séier Schwäif aktuell Zerfall. Fir datt GBTA kooperativ mat béiden Hv1 Ënnerunitéiten bindet, mussen d'Bindungsplazen allosteresch gekoppelt sinn. Iwwergank vun niddereg-affinity zu héich-affinity binding.We begrënnt, datt wann spezifesch Reschter bannent der bindender Site zu der kooperativer Prozess bäigedroen, hir Mutatioun soll den Hill Koeffizient vun der Konzentratioun-Äntwert Kéier vun GBTA inhibition vun Hv1 änneren. , S181 an R211 sech virdrun als Deel vun der 2GBI29 bindender Ëmwelt gewisen a mir hypothesiséiert, datt se ähnlech an GBTA bindend involvéiert ginn (Figebam. 3A). Mir gemooss inhibitory Konzentratioun-Äntwert Kéiren vun GBTA fir mutant Channels D112E, F150A, S181A , an R211S (Figur 3) an Verglach hir Hill Koeffizienten zu deenen vun Hv1 Wild-Typ, benotzt 2GBI als Referenz.Residue V109 ass op der selwechter Gesiicht vun der S1 Segment wéi D112 an huet een extra helical Tour bannent der Zell.Since V109 war net an der Bindung vun 2GBI29 involvéiert, mir benotzt de V109A mutant als Kontroll (Figebam. 3b). (a) Suggested Hv1 Reschter involvéiert an der Guanidin-Derivatbindung.Dashed blo Kéiren ëmginn virdru proposéiert Säitketten, déi mat verschiddenen Deeler vun der Verbindung 2GBI29 interagéieren. donkel rout).All Punkt stellt d'Moyenne Inhibitioun vun 3 bis 12 Miessunge ± SD V109 als negativ Kontroll duerstellt.Curves sinn Hill passt benotzt fir scheinbar Kd Wäerter ze kréien (kuckt Zousaz Table 1).The Hill coefficients (h) shown in D'Inset Histogramme goufen aus de Passen, déi an den Ergänzungsfiguren 3 a 4 gemellt goufen, bestëmmt. . Mir hunn erausfonnt datt d'D112E Mutatioun den Hill Koeffizient wesentlech reduzéiert huet (p 0,05) Ofsenkung vun der Hill Koeffizient vun GBTA bindend zu GGG Channels Verglach mat wëll Typ (Figebam. 5c), suggeréiert, datt trotz senger Roll an hält zwou Ënnerunitéiten zesummen wichteg, awer CCD vermëttelt net direkt intersubunit allosteresch Kupplung tëscht GBTA Bindungsplazen. (a) Schematesch Diagramm vum Hv1-Dimer mat enger Triglycin-Mutatioun am banneschten Enn vum S4 entworf fir d'Intersubunit-Kopplung ze stéieren, déi duerch d'zytoplasmatesch coiled-coil-Domain vermëttelt gëtt (blo Pfeiler).(b) Schematesch Representatioun vun Hv1-Dimeren a Ligatiounsdimer mat ugewisen Mutatiounen, entworf fir S1 Fragmenter ze testen, déi an der Kopplung tëscht Ënnerunitéiten involvéiert sinn (blo Pfeiler).(c–h) 2GBI (Cyan) an GBTA (donkelrout) hemmen déi uginn Konstruktiounen op eng konzentratiounsofhängeg Manéier. All Punkt representéiert d'Moyenne Inhibitioun ± SD vun 3 bis 10 Miessunge. D'Kurve war eng Hill Fit benotzt fir scheinbar Kd Wäerter ze kréien (kuckt Ergänzungstabell 1).Hill Koeffizienten an den interpoléierten Histogramme goufen festgeluecht wéi an der Methode Sektioun beschriwwen (kuckt Ergänzungsfiguren 3 a 4). Referenz h Wäerter fir Hv1 WT sinn als gestiermt Linnen gewisen.Asterisks weisen statistesch bedeitend Differenzen tëscht mutant an WT Passagen (p 0,05/14). Zanter neutralizing der charge op Positioun 123 op béide subunits zu enger staarker Ännerung vun GBTA bindender Kooperativitéit gefouert, iwwerdeems ëmgedréint der charge op béid subunits hat nëmmen e klengen Effekt, mir verlängert der Analyse nëmmen eng subunit mat der inversion Kanal vun charge. generéiert Hv1-verbonne dimers mat D123R Substitutioun an der C-terminal subunit (Figebam. 5b) a gemooss der Konzentratioun-Äntwert inhibition vun GBTA an 2GBI. vun Wild-Typ Hv1 (p 0,05). Mir hunn och fonnt datt an der Verontreiung vu βME den Hill Koeffizient vun der GBTA bindend un den D112E I127C Hv1 Dimer wesentlech méi héich war wéi dat gemooss an der Präsenz vun Reduzéierungsmëttelen (Figebam. 6e an Ergänzungs Fig. 4), wat implizéiert datt d'D112E Mutatioun. huet d'Erhéijung vun der GBTA bindender Kooperativitéit net ofgeschaaft, déi aus der Kräizverbindung vu Cystein 127 resultéiert.Den Hill Koeffizient vun 2GBI bindend un D112E, I127C Hv1 Dimer war och net wesentlech vun der D112E Mutatioun beaflosst (Figure 1).6d an Zousaz. Fig. 3). Zesummegefaasst suggeréieren dës Erkenntnisser datt d'GBTA Bindung verbessert gëtt duerch d'Interaktioun tëscht de baussenzegen Enden vun S1 Fragmenter an ugrenzend Hv1 Ënnerunitéiten duerch attraktiv elektrostatesch Interaktiounen oder duerch d'Bildung vu kovalente Bindungen tëscht substituéierten Cysteinen Allosteresch Kopplung tëscht Site erhéicht a resultéiert an bindend Kooperativitéit. Wärend den Effekt vun attraktiven elektrostateschen Interaktiounen op Kooperativitéit duerch Mutatioun D112E ofgeschaaft ka ginn, kann den Effekt vu kovalente Bindungen net. An eiser Exploratioun vum chemesche Raum verfügbar fir Guanidin-Derivate op Hv1-Kanäl ze binden, hu mir festgestallt datt 2-guanidinothiazoles wéi GBTA eng méi steif Konzentratiounsofhängegkeet hunn wéi 2-guanidinobenzimidazolen (Fig. 1c). an monomeric Channels (Figebam. 2a, b) an der dimeric Kanal an deem eent subunit war Pre-gebonnen un der inhibitor (Figebam. 4) gefouert eis ze schléissen, datt d'inhibition vun Hv1 vun GBTA D'Aktioun ass eng synergistic Prozess, an d'Bindungsplaze vun de Verbindungen an den zwou Ënnerunitéiten sinn allosteresch gekoppelt.D'Entdeckung datt GBTA un den oppene Kanal bindt, wéi virdru fir déi verwandte Verbindung 2GBI32 gewisen, suggeréiert datt allosteresch Kupplung speziell am oppene Staat bewäert ka ginn. Eise kooperative Bindungsmodell konnt fäeg sinn d'Inhibitioun vum HV1 vum HBTA ze beschreiwen (Fig. 2c) an erkläert sech déi verschidden Effekter vun 2GBI an de Kante vum Kanalisatioun vum Kanalisatioun vum Kanalisatioun vum Kanalisatioun De maximale Hiwwel Koeffizient deen an engem allosteresche Protein mat zwee bindende Säiten erreecht ka ginn (sou wéi HV1) ass 2. Mir gemoossene GBTA, déi HV1 Wilds-Typ mat engem Ko18 am HV1,8 an den 1.31 I11CE Synergistesch Energie, den Ënnerscheed tëscht de verbindlechen gratis Energienen vun der niddregster an héchster Affinitéits Websäiten (kuck Methode), war 1,3 KCAL / Mol am Fall vun HV1-Cleval- vu Sauerstoff zu Hemoglobin ass dee bekanntsten a gutt studéiert Beispill vun der kollaborativer Prozess-fir mënschlech Hemoglobin (en Tetramer mat véier allos Koppelen vun 1.26 KCAL / MOL, ofhängeg vun experimentellen Bedings38. Denhus, a punktuell Activiker, d'Koffer vun der GBTADING AN HECKOBINS AN DE PROCALS AN DER ZËNNERS GESCHAFFT GESCHAFFT. An eisem Synergie Model, d'Verbindung vum GBTA Molekülen zu engem Subnitresultater an enger Erhéijung vun der Bindendialitéit vun der ugrenzende Subniting, fuert zu deem en Awëllegen Ännerungen an den Interaktiounen tëscht Ënnerdeelung.in Äntwert op dës Ännerungen, niewentruzem gouf virdru fir en Deel vum HV1 Praton Permon Permatioun Wee ze sinn an als Secondity Filter >77,28 ze handelen. Eis Resultater weisen datt d'Selektiven Filteren an den zwee HV1 Subventiounen an der oppener Stativ gekoppelt hunn. Weist 7a déi ongeféier Plaz vum GBTA op enger schmebungsender Säit an I12C32. Op der Kristallstruktur vun der HV1-civrap Chimera.Suggested Richtungen fir Alloster-Kupplung mat dem extcollular Enn vum S1 ginn mat schwaarze Pfeile. (a) Schemkuratioun vum HV1 VSD.baden an de kuerze Segment vum Hv1-Certrec Chiminer ginn. Déi virausgesot Plaze vu gebonnenen GBTA ginn als groer Ovals opgeworf ginn. Pfeile bedenkt Weeër an der Alloster-Kupplung tëscht bindendem Senktioun. an zwee aneren Dimer Konfigururatioune wéi aus der extcollulärer Säit vun der Membranpläng gesinn. An der lénker Panel gëtt mat der S.Rämesch an der S4 Gradifter. Trennung vun de Baussent Enden vun deenen zwee S4holike (gebrannt Pfeile), produzéiert d'Arrangement op der rietser.in Dës Konfiguratioun, Rescht, Rescht, Rescht, reift d'D123 an I123 an I123 an I123. An der Dimer Configurque huet der 4G80 kräifzeer mat Spirc43 a Betriber fiert fir d'Plaz D123 u HV1. Eis Resultater weisen datt déi repulsiv elektrostatesch Interaktioun tëscht dem Reméit 123 (123d / 123r / 123r / 123r) ass mat engem "normalen" verréckelte gelooss an 123r. gëtt Zesummenaarbecht erhéicht (123a 5G) erwaart (Fig. 5e) .one méiglech mat der Alanine Ernärung. Erklärung ass zum Destéierung vun der bindender Kooperinitéit.mothy et am Hydrophings an engem hydrophiliescht Ëmfeld, déi wéinst der Emprikung vun der Emprokdéierend ass Aktioun D171 VUN CionA Gutis C®is CI-HV1 (entsprécht D123 bei engem heologeschen Ëmfeld um oppent Staaten, erhéicht D13) D171 (entsprécht D123 bei engem heeschen Hviveau am Ophuelung. Derhag vun HV1 Kanälegelen ass bekannt fir d'Kanalungen ze verschwannen, awer nach ëmmer zougeschriwwen ass , gefollegt vun engem ënnerschiddleche Iwwerschlag, deen d'Präsentéierunge vu begeeschterenen Opfahrt stehäit hunn, déi verrechent d'Rechnung vum Volidgplangbelder, déi vun de Volendéierungsschlag ausgeschmoossend ass an dat ass erëm gepriot. D'Penurfation vum flexivem Signative ass konsequent fir d'Präsenz vun engem oppenen Zoustand interagéiert a mediéiert alloster Kupplung tëscht GBTA Bindestänn. FujiWara et Al25 proposéiert datt den Dimer Interface vum Zytoplamesche COILUACE-COIL Domain op d'Membran verlängert gëtt (Figebunnen Dat vertrueden dat ganzt a Funktrelzäit vun der Regioun wou d'Kanal verbënnt ass agefouert ze loossen. Dofir huet de festgeluechte S4-S4 Interface méiglecherweis verschidden Subunit Konfiguratiounen an der oppener Feinde fir d'Bedeelegung fonnt zougemaach Staaten, eng Iddi konsequent mat de Wendunge vu Moyon et al. S1 beweegt sech 39 wärend der Gate. Hei, mir weisen dat, an deem oppenen Staat, an deem offenseille Enn vum S1 Helm seng formell elektresch Kekoliten, déi op laangfristeg Erzielung tëscht Ënneraarkatiounen zoufend handhafte fir eng rechtzäitlech Konzeptioun tëscht Ënnerwahlungen tëscht Ënneraarkatiounen ze ënnerstëtzen déi ze riichten apart from each other to interact directly.However, a 20° clockwise rotation of the two VSD subunits around an axis perpendicular to the membrane plane, combined with the separation of the outer ends of the two S4 helices, yielded an S1-S1 configuration consistent Mat eise Resultater (Fig. 7b, Rischten Panel). Mir recommandéieren dës Konfiguratioun fir de Kanal an den oppenen Zoustand. Och wann d'Civp Enzyme geduecht ass als Monomarer ze funktionéieren, d'Kristallstruktur vu sengem isoléierte VSD ass an engem Dimer State gefaangen. Dee Baussent ass an dësem Séiere vun den Saller. fir HV1 (Fig. 7c) .in de Civunit Dime-Konfiguratioun tëscht HV1 sinn. a Civsp DIMMER SUGGESTS DAT DÉI VSDS VUN DER PROSSINEN E INRSINSE Tendenz fir en Interface ze bilden, wou déi extrakellular Enn vum S1 Interaktioun bilden. Déi wesentlech Roll vun HV1 an der Spermaem Zellaktioun mécht dëse Kanal en attraktiven Drogen Zil fir d'Kontroll vu männleche Fruchtbarkeet, Aktivéierung vun der Micsa, Aktivéierung vun der Micnaphen vun der Micnaphen vun der Micsa, Aktivéierung vun der Micalerheit vun der Micshoctomien Iwwerliewe vun de Patienten mat Broscht 12 oder Coloridalkriminéieren 13 an ass geduecht fir d'B-Zellmalatrieder ze droen, déi fir kleng Molzeigerungen an der NevoPole sinn Open HV1 subunit, féiert op eng erhéicht Verbindung zur Verfügung zur Verfügung, kann op d'Entwécklung vu méi potenziellen Drogen zielt hv1 Channels. Site-Rezented Mateenese vun herno De C-Terminus vun engem Suunit ass mat dem N-Terminus vum zweeten Ënnerdeel duerch de GGSGGSGGSGGGGGGGGBlazglazen geläschte fonnt, déi méi verschidde Konstruktioune verbonne goufen mat der T7 mminage mmachen Zréckziicht fréieren (amo OOChoten vum Xenopus Laevioshousen (Nasco) goufen an Xenopus oozi ooopus ooopus oozi ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooopus ooenopus ooenopus ooopus ooopus ooopus ooenopus ooenopus ooopus Ooopus OOCT. from Ecocyte Bioscience.Following RNA injection, cells were maintained in ND96 medium containing 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml gentamicin, pH 7.2 18°C . 2.JAP Phoudthiketzler tzimial-1,3-Z), (5-Ziman-30], "" 2-Z) -Diazol-2-yl) Guanidine) [6], Ethyl 2-Guanidino-5-Methyl-1.3-Thizodino-4-Pigyl-4-Pigyl. 5-CarboxyLylate [9] an (2-GUANDANDINO-4-METHYL-1.3-Thiazol-5-Yl) Ecethich.Frathir Acetime.Fam ACTAMBIGIDIDIDINE war vu 5] War aus MP BIBEDIALS.1-- - 4-CLLOPHYL)-THIAIZOL-2-YL] Guanidine [11- [4- (3.4 -4 -4 -4-Dimethoxylyl)-yalloDOLAXAXAXOXL)-yal] vun Matrix wëssenschaftlech.Tsese Verbindunge sinn vun der héchster Puritéit kommerziell verfügbar.De ginn op dréchen Dmso fir eng 100 mm Stock Léisung ze generéieren op d'mannst 99% Rengheet. Op eng Suspensioun vum 2-Amino-4- (Trifluomethyl) Benzenthelyl), an der resultéierter MMOL) an 25 ml Paldratesch Hydrochoratiksäger (25 N) gouf staark Dicyandiamid (380 mmothioliol) an der resultéierter MMOL) bäigefüügt gouf mat kräftege Rörper fir 4 Stonnen zréckbezunn. D'Reaktiounsmëschung gouf an Raumtemperatur ofgekillt an neadraliséierten Zousatz vun 10n Kaldafhaft. D'Waarmung huet geformt, mat kale 50 min 65 ° C) fir e puer Stonnen, an dann errchtert aus Ithyl Acetate / Petréier / Petréienz Eher, fir eng wäiss zolidd ze ginn (500 MG, 48%); MP 291-222 ° C (hell 225.° connrict C))) 1h NMR (500 mhz, dmso-D6): Δ [ppm] = 7.25 (ganz breet dro, 4 H) (D, 7.73 (D, 7.73 (D, 7.73 (D, 7.79 , 1 h, j = 8.1 HZ) .3C Nmr (200 mhz, dmso-d6): Δ = 114.2 HZ), 12,5 HZ) 12,5 HZ) 12,5 HZT ).5 (Dδ = 3,5 HZE, 1 H, J = 12.1 HMR (200 MHZ, DMSO-D6): Δ = 114.2 = 272 HZ), 126.1 (Q, J = 272 HZ) = 31.6 HZ), Lafe fonnt : 261.0419. Naaphthho [1,2-D] Thiazol-2-Amine (300 mg, 1,5 mmol), synthetiséiert, gouf op 200 ° CG an engem klengen Training an engem klenge Testbad an engem klengen Uto an 1.0 ML CONT. Dee waarme Verbindung gouf hydrochloric säuscht an d'Mëschung am Uelegbad gemaach fir ongeféier 2 Minutten, während der Zäit am Zesummenhang an der Zäit. gouf zu klenge Stécker gebrach a mat Waasser gewascht fir e hell giel amorphesche Amorphus ze liwweren. (38 mg, 10% MP 246 ° 4, 1h NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8,7 --,76 (TZ). 2 H , J = 8. H, J = 889 (D Levelc Nm (1502 (D, 2,2 HZ) Mhz, dmso-d3): Δ = 119.9, 123.4, 123.6, 126.7, 142.7, 142.7, 132.7, 132.7, 142.2019, 142.7, 142.7, 142.7, 142.7 fonnt: 243.0704. Proton Stréimunge goufen an der interner an extern Flecken vun ooCytes, déi anescht Konstruktioun déi 100- (n-morpholina gesinn (Moldraclata 1440A ) EtHaveshyly Sait (Mes), 30 mm Tetraadethylammonium (Téi), ugepasst, 5 mmat Telatole Glytholen Glycolole, 5-Amineshyl ph 6.0 mat Téi Hydroxiden.all Miessunge goufen am 22 ± 2 ° C.Dette Pipete vun 1,5-4 analyséiert an analyséiert ) an Hierkonft8.1 (Originlab). Sinn Léisunge mat verschiddene Konzentratioune vun HV1 Inhibrement an an de puer Fäll 10m tiven an der Gravis duerchgefouert ginn (Iwwerraschung Transistesch Logik) Signaler.rapid Permusor-Experimenter goufen um Enn vun der +120 MV Depolorizing Puffer.gv Miessunge goufen als virdru beschriwwen18,20.20.20.ET-Stréimunge opgeholl, da gëtt den Testpulsatioun vu -20 mv benotzt fir d'Konzentratiounshängegkeet ze korrigéieren. D'GVT VIDITATIOUNEN (mëttleren% Hemmung) Mat der Hiwwel Equatioun: Wou [i] ass d'Konzentratioun vum Inhibror I an h ass den Hill Koeffizin.to coder ze berechnen, gëtt d'Equatioun (2) hannerlooss