Atviro Hv1 protonų kanalo tarpsubvienetinės sąsajos su allosteriškai sujungtu zondu apklausa

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojama naršyklės versija ribotai palaiko CSS. Kad gautumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, norėdami užtikrinti toliau palaikome, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“. Hv1 įtampa valdomas protonų kanalas yra dimerinis kompleksas, susidedantis iš dviejų įtampos jutimo domenų (VSD), kurių kiekviename yra apribotas protonų prasiskverbimo kelias. Dimerizaciją valdo citoplazmos suvyniotos ritės domenas. Perėjimas iš uždaros būsenos į žinoma, kad atvira būsena abiejuose VSD atsiranda bendradarbiaujant; tačiau mažai žinoma apie pagrindinius mechanizmus. Intersubunit sąsajos vaidina pagrindinį vaidmenį allosteriniuose procesuose; tačiau atviruose Hv1 kanaluose tokios sąsajos nebuvo nustatytos. Čia parodome, kad 2-guanidinotiazolo dariniai bendradarbiaudami blokuoja du Hv1 VSD ir naudoja vieną iš šių junginių kaip zondą alosteriniam ryšiui tarp atvirų subvienetų.Nustatėme, kad tarpląstelinis pirmojo transmembraninio VSD fragmento galas sudaro tarpsubvienetinę sąsają, kuri tarpininkauja sujungimui tarp surišimo vietų, o suvyniotos ritės domenas tiesiogiai nedalyvauja šiame procese. Taip pat radome tvirtų įrodymų, kad kanalo protonų selektyvus filtras kontroliuoja blokatorių surišimo bendradarbiavimą. . Nuo įtampos priklausomi protonų kanalai vaidina svarbų vaidmenį įvairiuose organizmuose, pradedant fitoplanktonu ir baigiant žmonėmis1.Daugelyje ląstelių šie kanalai tarpininkauja protonų nutekėjimui iš protonų membranos ir reguliuoja NADPH oksidazės aktyvumą.Vienintelis žinomas nuo įtampos priklausomas protonų kanalas žmonėms. yra Hv1, kuris yra HVCN1 geno produktas2,3. Nustatyta, kad Hv1 (dar žinomas kaip VSOP) vaidina svarbų vaidmenį B ląstelių proliferacijoje4, įgimtos imuninės sistemos reaktyviųjų deguonies rūšių gamyboje5,6,7,8, spermatozoidų ląstelėse. kvėpavimo takų paviršiaus skysčio judrumas9 ir pH reguliavimas10. Šis kanalas yra susijęs su keletu per daug išreikštų vėžio tipų, tokių kaip piktybiniai B ląstelių navikai4,11 ir krūties bei gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys12,13. Nustatyta, kad per didelis Hv1 aktyvumas padidina vėžio ląstelių metastazavimo potencialą 11, 12. Smegenyse ekspresuojamas Hv1. mikroglia, ir įrodyta, kad jo aktyvumas padidina smegenų pažeidimą išeminio insulto modeliuose. Hv1 baltyme yra įtampos jutimo domenas (VSD), kurį sudaro keturi transmembraniniai segmentai, vadinami S1–S414. VSD primena atitinkamus nuo įtampos priklausančių Na+, K+ ir Ca2+ kanalų ir įtampai jautrių fosfatazių domenus, pvz., CiVSP nuo Ciona gutis15. Šiuose kituose baltymuose S4 C galas yra prijungtas prie efektoriaus modulio, porų domeno arba fermento. Hv1 atveju S4 yra susietas su coiled-coil domenu (CCD), esančiu citoplazminėje membranos pusėje. .Kanalas yra dimerinis kompleksas, susidedantis iš dviejų VSD, kurių kiekviename yra uždaras protonų prasiskverbimo kelias16, 17, 18. Nustatyta, kad šie du Hv1 subvienetai atsidaro bendradarbiaujant19, 20, 21, 22, o tai rodo, kad vyksta allosterinis ryšys ir subvienetų sąveika. Sąsaja tarp subvienetų suvyniotos ritės srityje yra aiškiai apibrėžta, nes yra dviejų izoliuotų domenų kristalinės struktūros22, 23. Kita vertus, sąsaja tarp VSD membranoje nėra Hv1-CiVSP chimerinio baltymo kristalinė struktūra nesuteikia informacijos apie šią sąsają, nes kristalizuoto kanalo komplekso trimerinė struktūra gali atsirasti dėl natūralaus Hv1 CCD pakeitimo mielių leucino užtrauktuku GCN424. Neseniai atliktas Hv1 kanalo subvieneto organizavimo tyrimas padarė išvadą, kad dvi S4 spiralės pereina į CCD be didelių antrinės struktūros sutrikimų, todėl susidaro ilgos spiralės, kurios prasideda nuo membranos ir išsikiša į citoplazmą. Remiantis cisteino kryžminio ryšio analize, šiame tyrime siūloma, kad Hv1 VSD kontaktuotų vienas su kitu išilgai S4 segmento. Tačiau kituose tyrimuose buvo pasiūlytos alternatyvios sąsajos tarp VSD. Šios sąsajos apima S1 segmentus 17, 21, 26 ir išorinius S2 segmento 21 galus. Galima prieštaravimo priežastis. Šių tyrimų rezultatai rodo, kad allosterinis ryšys tarp VSD buvo ištirtas atsižvelgiant į blokavimo procesą, kuris priklauso nuo uždaros ir atviros būsenos, o sąsaja tarp VSD gali skirtis dėl skirtingų konformacijos būsenų pokyčių. Čia mes nustatėme, kad 2-guanidinotiazolas slopina Hv1 kanalus, sinergiškai prisijungdamas prie dviejų atvirų VSD, ir panaudojo vieną iš junginių, 2-guanidinobenzotiazolą (GBTA), kad ištirtų sąveiką tarp subvienetų atviroje būsenoje. sąsaja.Mes nustatėme, kad GBTA surišimo kreivė gali būti gerai aprašyta kiekybiniu modeliu, kuriame inhibitorių prisijungimas prie vieno subvieneto padidina gretimo subvieneto surišimo afinitetą. Taip pat nustatėme, kad liekanos D112, selektyvumo filtrai 27, 28 kanalai ir dalis guanidino darinio surišimo vietos 29 kontroliuoja GBTA surišimo kooperatyvą. Mes parodome, kad bendradarbiaujantis jungimasis palaikomas Hv1 dimeryje, kur CCD atsiskiria nuo S4 segmento, o tai rodo, kad tarpsubvienetinė sąsaja CCD tiesiogiai nesusijusi. tarpininkauja alosteriniam ryšiui tarp GBTA surišančių vietų. Priešingai, mes nustatėme, kad S1 fragmentas yra sąsajos tarp subvienetų dalis ir siūlome gretimų VSD išdėstymą, kai ekstraląstelinis S4 spiralės galas yra toliau nuo dimero centro, kad būtų galima S1 fragmentas turi būti atviroje būsenoje. Mažos molekulės Hv1 inhibitoriai yra naudingi kaip vaistai nuo vėžio ir neuroprotekcinės medžiagos. Tačiau iki šiol nedaug junginių sugebėjo slopinti kanalą30, 31, 32, 33. Tarp jų yra 2-guanidinobenzimidazolas (2GBI, junginys [1] pav. 1a) ir jo dariniai blokuoja VSD29,32 protonų prasiskverbimą per kanalą. Manoma, kad tokie junginiai jungiasi nepriklausomai dviejuose atviruose subvienetuose.2-guanidinobenzotiazolas (GBTA, junginys [2] 1a pav.). Anksčiau buvo įrodyta, kad Hv1 slopina beveik taip pat veiksmingai kaip 2GBI, kai buvo išbandyta esant 200 μM koncentracijai (1b pav.). Ištyrėme kitus tiazolo darinius ir nustatėme, kad kai kurie iš jų slopina kanalą panašiai arba stipriau nei GBTA (1 pav. ir papildomas). tekstas).Nustatėme keturių tiazolo darinių (GBTA ir junginių [3], [6] ir [11], 1c pav.) koncentracijos atsako kreives ir nustatėme, kad jos buvo statesnės nei 2GBI. Hillo koeficientai (h) tiazolo darinių svyravo nuo 1,109 ± 0,040 iki 1,306 ± 0,033 (1 pav.). 1c ir 1 papildomas pav. Priešingai, 2GBI Hillo koeficientas buvo 0,975 ± 0,024 29, 2a pav. ir 1 papildomas pav. Hilo koeficientas, didesnis nei 1, rodo surišimo kooperatyvumą. Kadangi kiekvienas Hv1 subvienetas turi savo inhibitorių, surišimo vieta,29,32, mes samprotavome, kad tiazolo darinio prisijungimas prie vieno subvieneto gali sustiprinti antrosios inhibitoriaus molekulės prisijungimą prie gretimo subvieneto. GBTA buvo tiriamasis junginys, turintis didžiausią Hillo koeficientą. Todėl pasirinkome šį junginį. toliau tyrė surišimo sinergijos mechanizmą ir naudojo 2GBI kaip etaloninę neigiamą kontrolę. a) Bandomieji junginiai: [1] Etaloninis Hv1 inhibitorius 2-guanidino-benzimidazolas (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazolas (GBTA), [3] (5-trifluormetil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidinas, [4] nafto[1,2-d][1,3] tiazol-2-ilas -guanidinas, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidinas, [6](5-brom-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidinas, [7] famotidinas, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksirūgšties etilo esteris, [9] 2-guanidino-4-metiletil-1,3-tiazol-5-karboksilatas, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etilacetatas, [11]1-[4-(4-chlorfenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidinas, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidinas. (b) Žmogaus Hv1 aktyvumo slopinimas nurodytais guanidinotiazolais ir etaloniniu junginiu 2GBI (mėlynai žalios juostos) .Hv1 protonų srovės buvo išmatuotos Xenopus oocitų plokštelėse, reaguojant į depoliarizaciją nuo -80 mV iki +120 mV sulaikymo potencialo. Kiekvienas inhibitorius buvo pridėtas į vonią 200 μM koncentracijoje.pHi = pHo = 6,0 .Duomenys yra vidurkis ± SEM (n≥4).(c) Nuo koncentracijos priklausomas žmogaus Hv1 slopinimas junginiais [2], [3], [6] ir [11]. Kiekvienas taškas reiškia vidutinį slopinimą ± SD 3 iki 15 matavimų. Linija yra Hill atitikimas, naudojamas norint gauti tariamąsias Kd reikšmes, nurodytas 1 papildomoje lentelėje. Kalno koeficientai buvo nustatyti pagal atitikmenis, nurodytus 1 papildomame paveikslėlyje: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,024 h (2) 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (žr. Metodus). (a,b) Junginiai 2GBI ir GBTA slopino dimerinį ir monomerinį Hv1 priklausomai nuo koncentracijos. Kiekvienas taškas rodo vidutinį slopinimą ± SD nuo 3 iki 8 matavimų, o kreivė yra Hilo derinys. Hillo koeficientai (h) parodyti įterptos histogramos buvo nustatytos pagal atitikimus, pateiktus papildomuose 3 ir 4 paveiksluose. GBTA koncentracijos atsakas, parodytas (a) yra toks pat kaip ir 1c pav. Tariamas Kd vertes žr. 1 papildomoje lentelėje. (c) Modeliavimas bendras GBTA prisijungimas prie dimerinio Hv1. Ištisinė juoda linija rodo atitikimą eksperimentiniams duomenims pagal (6) lygtį, kuri apibūdina d punkte parodytą surišimo modelį. Brūkšninės linijos, pažymėtos Sub 1 ir Sub 2, reiškia bimolekulinę asociaciją -atitinkamai pirmojo ir antrojo susiejimo įvykių disociacijos pusiausvyros kreivės (1 sub: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; 2 sub: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Siūlomo Hv1 bloko mechanizmo schema. GBTA atveju prisijungimas prie vieno atviro subvieneto padidina gretimo atviro subvieneto afinitetą (Kd2 0,05, 5d, i pav.). ). Kita vertus, mutacija D123A reikšmingai sumažino GBTA Hillo koeficientą (p 0,05/14). Kadangi neutralizavus krūvį 123 padėtyje abiejuose subvienetuose stipriai pasikeitė GBTA surišimo kooperatyvas, o abiejų subvienetų krūvio keitimas turėjo tik nedidelį poveikį, išplėtėme analizę įtraukdami tik vieną subvienetą su inversiniu įkrovos kanalu. sukūrė su Hv1 susietus dimerus su D123R pakaitalu C-galo subvienete (5b pav.) ir išmatavo GBTA ir 2GBI koncentracijos ir atsako slopinimą. Nustatėme, kad GBTA prisijungimo prie WT-D123R kanalų Hillo koeficientas buvo žymiai didesnis nei tas. laukinio tipo Hv1 (p 0,05). Taip pat nustatėme, kad nesant βME, GBTA jungimosi su D112E I127C Hv1 dimeru Hill koeficientas buvo žymiai didesnis nei išmatuotas esant redukuojantiems agentams (6e pav. ir papildomas 4 pav.), o tai reiškia, kad D112E mutacija. nepanaikino GBTA surišimo kooperatyvo padidėjimo, atsirandančio dėl cisteino 127 kryžminio susiejimo. 2GBI prisijungimo prie D112E, I127C Hv1 dimerų Hill koeficiento D112E mutacija taip pat reikšmingai nepaveikė (1 pav.). 6d ir papildomas. 3 pav.). Visi šie atradimai rodo, kad GBTA surišimą sustiprina sąveika tarp išorinių S1 fragmentų galų gretimuose Hv1 subvienetuose dėl patrauklios elektrostatinės sąveikos arba dėl kovalentinių ryšių tarp pakeistų cisteinų susidarymo. Nors patrauklios elektrostatinės sąveikos poveikį bendradarbiavimui galima panaikinti mutacija D112E, kovalentinių ryšių poveikis negali būti. Tyrinėdami cheminę erdvę, skirtą guanidino dariniams prijungti prie Hv1 kanalų, nustatėme, kad 2-guanidinotiazolai, tokie kaip GBTA, turi didesnę priklausomybę nuo koncentracijos nei 2-guanidinobenzimidazolai (1c pav.). GBTA jungimosi su abiem dimerais Hillo koeficiento analizė ir monomeriniai kanalai (2a, b pav.) ir dimerinis kanalas, kuriame vienas subvienetas buvo iš anksto susietas su inhibitoriumi (4 pav.), leido daryti išvadą, kad Hv1 slopinimas GBTA Veiksmas yra sinergetinis procesas ir junginių surišimo vietos dviejuose subvienetuose yra alosteriškai susietos. Atradimas, kad GBTA jungiasi prie atviro kanalo, kaip anksčiau parodyta susijusiam junginiui 2GBI32, rodo, kad alosterinį ryšį galima konkrečiai įvertinti atviroje būsenoje.Mūsų kooperacinio surišimo modelis sugebėjo kiekybiškai apibūdinti HV1 slopinimą GBTA (2c pav.) Ir paaiškinti skirtingą 2GBI ir GBTA poveikį kanalo uodegos srovių skilimui po membranos repoliarizacijos, kuri palaiko mūsų surišimo proceso aiškinimą. Maksimalus kalvos koeficientas, kurį galima pasiekti alosteriniame baltyme su dvi Sinergetinė laisvoji energija, skirtumas tarp žemiausio ir aukščiausio afiniteto vietų surišimo laisvosios energijos (žr. Metodus), buvo 1,3 kcal/mol, jei HV1 laukinio tipo ir 2,7 kcal/mol, esant HV1 I127C. Surišimas Iš deguonies iki hemoglobino yra garsiausias ir gerai ištirtas bendradarbiavimo proceso38 pavyzdys. Kcal/mol, atsižvelgiant į eksperimentines sąlygas38.Tai, kalbant apie pasaulinę energiją, GBTA jungimosi su HV1 kooperatumas iš esmės nesiskiria nuo O2 prisijungimo prie hemoglobino, kai svarstomas skirtingas baltymų subvienetų skaičius dviejose sistemose. Mūsų sinergijos modelyje GBTA molekulių surišimas su vienu subvienetu padidina gretimo subvieneto surišimo afinitetą. Mes įsivaizduojame procesą, kurio metu surišimo aplinkos pertvarkymas, atsirandantis dėl pirmojo surišimo įvykio (sukeltas pritaikymas), veda prie veda prie pirmojo surišimo įvykio (sukeltas pritaikymas). Subvienetų sąveikos pokyčiai. Reaguojant į šiuos pokyčius gretimi subvienetai keičia savo surišimo vietas, todėl GBTA suriša griežtesnį GBTA. anksčiau buvo parodyta, kad jis buvo HV1 protonų prasiskverbimo kelio dalis ir jis veikia kaip selektyvumo filtras27,28. Our results show that selectivity filters in the two Hv1 subunits are allosterically coupled in the open state.Figure 7a shows the approximate location of the GBTA binding site and the location of residues D112, D123, K125 and I127 on a schematic of the Hv1 VSD based Ant HV1-CIVSP chimera kristalų struktūros. Papildomos alosterinės jungties kryptys, apimančios tarpląstelinį S1 galą, parodytos juodomis rodyklėmis. (A) HV1 VSD schema. Pagaminta ant HV1-CIVSP chimeros kristalų struktūros, spiraliniai segmentai parodyta, kad yra cilindrinė. Ši konfigūracija, vidinis S4 segmento galas susilieja su CCD (neparodyta). Prognozuojamos surištos GBTA vietos parodytos kaip pilkos spalvos ovalai. Juodos rodyklės rodo būdus, susijusius su alosterine jungtimi tarp surišimo vietų dviejuose gretimuose subvienetuose. Tiriamų S1 likučių pozicijos pažymėtos spalvotomis sferomis. (B) Schema. HV1 subvienetų išdėstytų iliustracija. Dviejose skirtingose ​​dimerų konfigūracijose, matomose iš tarpląstelinės membranos plokštumos pusės. Kairiajame skydelyje dimerio sąsaja sudaro S4 spiralė. Dviejų S4 spiralių išorinių galų atskyrimas (brūkšniuotomis rodyklėmis) sukuria dešinėje nurodytą išdėstymą. Šioje konfigūracijoje, liekanos D123 ir I127 iš gretimų subvienetų leidžiama artimas Dimerio konfigūracijoje, rastoje 4G80 kristalų struktūroje.Pozicija P140 CIVSP atitinka D123 padėtį HV1. Mūsų rezultatai rodo, kad atstumianti elektrostatinė sąveika tarp 123 liekanos (123D/123D arba 123R/123R) yra susijusi su „normaliu“ GBTA surišančio kooperatyvo lygiu atviroje būsenoje ir perkelia sąveiką nuo atstumimo prie traukiamos (123D/123R). , padidėjęs bendradarbiavimas (5G pav.). Tikimasi, kad pašalinus atstumiančią sąveiką su alanino pakeitimu, taip pat padidės bendradarbiavimas. Tačiau pastebėtas 123A/123A dimerio kooperatyvo sumažėjimas (5E pav.). explanation is that the destabilizing effect of placing hydrophobic residues in a hydrophilic environment may outweigh the stabilizing effect due to the elimination of repulsive interactions between D123 residues, resulting in an overall reduction in binding cooperativity.Mony et al.39 recently reported that solvent accessibility at Ciona Gutis CI-HV1 (atitinkančios D123 žmogaus HV1) D171 padėtis padidėja suaktyvinus, palaikant nuostatą, kad D123 yra hidrofilinėje aplinkoje atviroje būsenoje. Yra žinoma, kad HV1 kanalų kankinimas vyksta per daugybę perėjimų19,20,26,39,40,41.Qiu ir kt. , po kurio seka aiškus perėjimas, dėl kurio protonai atidaro laidumą abiejuose subvienetų kelyje. Įtampos jutiklio konformacinis pokytis buvo stebimas įtampos spaustuko fluorescencija ir nustatyta, kad antrąjį perėjimą selektyviai sutriuškino mutacija D171 padėtyje. Fluorescencinio signalo pasipiktinimas atitinka gretimų subvienetų D171 likučių elektrostatinę sąveiką tam tikru metu išilgai konformacinio pokyčio reakcijos koordinates. Šis aiškinimas atitinka mūsų išvadą, kad D123 liekanos elektrostatiškai sąveikauja atviroje būsenoje atviroje būsenoje. ir tarpininkauja alosteriniam sujungimui tarp GBTA surišimo vietų. Fujiwara ir kt. Visa regiono, jungiančio S4 spiralė ir CCD, VSD ir funkcinė analizė. Kadangi nėra transmembraninio pH gradiento, HV1 kanalams reikia didelės membranos depoliarizacijos, o cisteino kryžminimas vyksta tokiomis sąlygomis, kai kanalas daugiausia uždarytas. Todėl aptikta S4-S4 sąsaja greičiausiai atspindi ne būsenos subvieneto konfigūraciją. Kiti tyrimai rado įrodymų, kad S1 ir S2 dalyvauja „Intersubunit“ sąveikoje, kai buvo galima 197,21,26 teigti, kad kanalai gali priimti skirtingas subvienetų konfigūracijas atviroje ir Uždarytos valstybės, idėja, atitinkanti Mony ir kt. Išvadas. S1 juda 39 vartų metu. Čia parodome, kad atviroje būsenoje tarpląsteliniai S1 spiralės galai yra pakankamai arti, kad palaikytų tiesioginę elektrostatinę sąveiką, tarpininkaujančią alosterinei jungčiai tarp subvienetų. Be vienas kito sąveikos tiesiogiai. Tačiau dviejų VSD subvienetų aplink ašies, statmenos membranos plokštumai, sukimasis pagal laikrodžio rodyklę, kartu su dviejų S4 sraigtų išorinių galų atskyrimu, davė S1-S1 konfigūracijos nuoseklumą. Su mūsų išvadomis (7b pav., Dešinysis skydelis). Mes rekomenduojame šią kanalo konfigūraciją atviroje būsenoje. Nors manoma, kad CIVSP fermentas veikia kaip monomeras, jo izoliuoto VSD kristalų struktūra yra užfiksuota dimero būsenoje. Išoriniai S1 spiralių galai šiame dimere yra erdvėje arti, o bendra konfigūracija yra panaši į siūlomą siūlomą siūlomą. Hv1 (7 pav. C). CIVSP dimere artimiausias liekanas iš gretimo subvieneto buvo prolinas 140 padėtyje (7c pav.). Įdomiai p140 CIVSP atitinka D123 padėtį HV1. ir „CivSp“ dimerai teigia, kad šių baltymų VSD yra vidinis polinkis sudaryti sąsają, kurioje sąveikauja tarpląsteliniai S1 galai. Esminis HV1 vaidmuo spermos ląstelių aktyvacijoje daro šį kanalą patraukliu vaisto taikiniu kontroliuoti vyrų vaisingumą. Įrodyta, kad HV1 aktyvinimas mikroglijose pablogėjo po išeminio insulto. Nustatyta, kad padidintas HV1 aktyvumas yra susijęs su mažesniu. Pacientų, sergančių 12 ar kolorektaliniu vėžiu 13, išgyvenimas 13 ir, kaip manoma, prisideda prie B ląstelių piktybinių navikų 11. Todėl mažų molekulių vaistai, nukreipti į HV1 Atviras HV1 subvienetas, dėl kurio padidėja surišimo afinitetas, gali sukelti stipresnių vaistų, nukreiptų į HV1 kanalus, vystymąsi. Žmogaus HV1 mutagenezė vietoje buvo atlikta naudojant standartinius PGR metodus. HV1NCCIVSP konstrukcijoje, HV1 1-96 ir 228-273 liekanos buvo pakeistos CIVSP18 liekanomis 1-113 ir 240-576. the C-terminus of one subunit is linked to the N-terminus of the second subunit through the GGSGGSGGSGSGGSGG linker.The pGEMHE plasmids containing the various constructs were linearized with Nhe1 or Sph1 restriction enzymes (New England Biolabs) and RNA synthesis was performed with the T7 MMessage Mmachine transkripcijos rinkinys (ambionas) .1–3 Dienos iki elektrofiziologinių matavimų, CRNR buvo įpurškiama į Xenopus oocitus (50 nL vienai ląstelei, 0,3–1,5 μg/μl) .STAGE V ir VI oocituose iš Xenopus Laevis (NASCO). Iš ekocitų bioscience. Vykdant RNR injekciją, ląstelės buvo palaikomos ND96 terpėje, kurioje yra 96 ​​mM NaCl, 2 mM kcl, 1,8 mM CACL, 1 mM mgCL, 10 mM HEPES, 5 mM piruvate, 100 μg/ml gentamicin, pH 7,2 18 ° C. . 2-guanidino-benzimidazolas [1], 2-guanidino-benzotiazolas [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidinas [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -Thiazol-2-il) guanidinas) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilatas [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-tiazol- 5-karboksilatas [9] ir (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) etilo acetatas [10] buvo iš Sigma-Aldrich.famotidino [7] buvo iš MP biomedicinos.1- [4 -(4-chlorfenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidinas [11] ir 1- [4- (3,4-dimetoksifenil) -1,3- tiazol-2-il] guanidinas [12] buvo iš „Matrix Scientific“. Šie junginiai yra didžiausio grynumo komerciškai. Jie buvo ištirpinti sausame DMSO, kad būtų generuojamas 100 mm atsargų tirpalas, kuris vėliau buvo praskiedytas įrašymo tirpale norimoje galutinėje koncentracijoje.compounds 3 ir 4 buvo susintetinti žemiau, su Bent 99% grynumo. Į 2-amino-4- (trifluormetil) benzenetiolio hidrochlorido (1,02 g, 4,5 mmol) suspensiją 25 ml vandeninės druskos rūgšties (2,5 N) buvo pridėta kietas dicandiamidas (380 mg, 4,5 mmol), o gautas heterogeninis mišinys) ir gautas heterogeninis mišinys. 4 valandas buvo reflituotas energingai maišant. Reakcijos mišinys buvo atvėsintas iki kambario temperatūros ir neutralizuotas palaipsniui pridedant 10N kalio hidroksido. Susidariusios baltos nuosėdos buvo filtruojamos, plaunamos šaltu vandeniu (3 × 50 ml), išdžiovintos orkaitėje ( 65 ° C) kelioms valandoms, o po to perkristalizuotas iš etilo acetato/naftos eterio, kad būtų balta kieta medžiaga (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (šviesa 225–226 ° C) 45; 1. , 1. = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.hrms (ESI): m/z apskaičiuota vertė. : 261.0419. Nafto [1,2-D] tiazol-2-aminas (300 mg, 1,5 mmol), susintetintas, kaip aprašyta anksčiau, buvo kaitinamas iki 200 ° C aliejaus vonioje mažame bandomame vamzdyje.300 mg (didelis perteklius) cianamidas ir 1,0 ml koncentracijos, kad būtų galima greitai pridėti karšto junginio, o mišinys buvo laikomas alyvos vonioje maždaug 2 minutes, per tą laiką išgaravo didžioji dalis vandens. Po to reakcijos mišinys buvo atvėsintas iki kambario temperatūros, o gauta sukietėjusi medžiaga - sukietėjusi medžiaga buvo suskaidytas į mažus gabalėlius ir plaunamas vandeniu, kad būtų šviesiai geltona amorfinė kieta medžiaga. (38 mg, 10%) MP 246–250 ° C; 1. , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13C NMR (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.Hrms (ESI): M/Z apskaičiuota vertė.FOR C12H11N4S (M + H) +: 243,0699 , rastas: 243.0704. Protonų srovės buvo matuojamos vidiniuose ir išoriniuose oocitų pleistruose, ekspresuojančiuose skirtingas konstrukcijas, naudojant „AxoPatch 200b“ stiprintuvą, kontroliuojamą „Axon Digidata 1440A“ (molekulinių įtaisų) su PCLAMP10 programine įranga. Įsidrakelininiai ir tarpląsteliniai tirpalai turi tą pačią kompoziciją: 100 mm 2- (N-Morfolino. ) Etanesulfonrūgšties (MES), 30 mM tetraetilammonio (arbatos) mezilatas, 5 mM arbatos chloridas, 5 mM etilenglikolio-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraacto rūgštis (EGTA), sureguliuoti prie PH 6,0 su arbatos hidroksidu. Visi matavimai buvo atlikti esant 22 ± 2 ° C temperatūrai. ) ir kilmė8.1 („OriginLab“). Sprendimai, kuriuose yra įvairių HV1 inhibitorių koncentracijų, ir kai kuriais atvejais 10 mM βME buvo įvesti į vonią sunkio jėgos per kolektorių, prijungtą prie VC-6 perfuzijos vožtuvo sistemos („Warner Instr.“), Kuris buvo perduotas per „Pclamp“ programinę įrangą TTL (tranzistoriaus- Tranzistorinės logikos) signalai.Rapidų perfuzijos eksperimentai buvo atlikti naudojant daugialypės vamzdelio perfuzijos pieštuką (automatizuotas sci.) Su 360 μm skersmens tiekimo antgaliu, pritvirtintu priešais pleistro pipetę. Channel Slophition buvo nustatytas izochroniniu amperometriniais matavimais, esančiais esant izohronaliniams amperometriniams matavimams, esančiuose esant izohronaliniams amperometriniams matavimams, esant izochroninių amperometrinių matavimų matavimams, esant izochroninių amperometrinių matavimų matavimams, esant izochroninių amperometrinių matavimų matavimams, esant izochronaliniams amperometriniams matavimams, esant priešais pleistro pipetę. +120 mV depoliarizuojantis impulse.GV matavimai buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau. Naudojamas taisyti dabartinį skilimą 18. GV grafikas tinka Boltzmanno lygčiai: akivaizdžios disociacijos konstantos (KD) skirtingiems kanalų ir inhibitorių deriniams (1 papildoma lentelė) buvo nustatyta pritaikant slopinimo priklausomybės nuo koncentracijos (vidutinės %slopinimo vertės). Su kalvos lygtimi: kur [i] yra I ir H inhibitoriaus koncentracija. Norėdami apskaičiuoti kalvos koeficientą, 2 lygtis yra pertvarkyta taip: