Atvērtā Hv1 protonu kanāla starpsubvienību saskarnes nopratināšana ar allostēriski savienotu zondi

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu turpināsim atbalstu, mēs parādīsim vietni bez stiliem un JavaScript. Hv1 sprieguma kontrolētais protonu kanāls ir dimērisks komplekss, kas sastāv no diviem sprieguma sensora domēniem (VSD), no kuriem katrs satur bloķētu protonu caurlaidības ceļu. Dimerizāciju kontrolē citoplazmas spirālveida domēns. Pāreja no slēgtā stāvokļa uz ir zināms, ka atvērtais stāvoklis abos VSD notiek kooperatīvi; tomēr maz ir zināms par pamatā esošajiem mehānismiem.Starpvienību saskarnēm ir galvenā loma allosteriskajos procesos; tomēr šādas saskarnes nav identificētas atvērtos Hv1 kanālos.Šeit mēs demonstrējam, ka 2-guanidinotiazola atvasinājumi bloķē divus Hv1 VSD kooperatīvā veidā un izmanto vienu no šiem savienojumiem kā zondi allosteriskai savienošanai starp atvērtām apakšvienībām. Mēs atklājām, ka ārpusšūnu VSD pirmā transmembrānas fragmenta beigas veido starpsubvienību saskarni, kas ir starpnieks starp saistīšanās vietām, turpretim spoles domēns šajā procesā nav tieši iesaistīts. Mēs arī atradām pārliecinošus pierādījumus tam, ka kanāla protonu selektīvais filtrs kontrolē bloķētāju saistīšanas sadarbību. . No sprieguma atkarīgiem protonu kanāliem ir svarīga loma dažādos organismos, sākot no fitoplanktona līdz cilvēkiem1.Lielākajā daļā šūnu šie kanāli veicina protonu izplūdi no protonu membrānas un regulē NADPH oksidāzes aktivitāti. Vienīgais zināmais ar spriegumu atkarīgs protonu kanāls cilvēkiem. ir Hv1, kas ir HVCN1 gēna2,3 produkts. Ir pierādīts, ka Hv1 (pazīstams arī kā VSOP) spēlē lomu B šūnu proliferācijā4, iedzimtas imūnsistēmas reaktīvo skābekļa sugu ražošanā5,6,7,8, spermas šūnās. elpceļu virsmas šķidruma kustīgums9 un pH regulēšana10. Šis kanāls ir iesaistīts vairākos pārmērīgi izteiktos vēža veidos, piemēram, B-šūnu ļaundabīgos audzējos4,11 un krūts un kolorektālajos audzējos12,13. Tika konstatēts, ka pārmērīga Hv1 aktivitāte palielina vēža šūnu metastāžu potenciālu 11, 12 .Smadzenēs Hv1 izpaužas. ar mikrogliju, un ir pierādīts, ka tā darbība pastiprina smadzeņu bojājumus išēmiska insulta modeļos. Hv1 proteīns satur sprieguma uztveršanas domēnu (VSD), kas sastāv no četriem transmembrānas segmentiem, ko sauc par S1 līdz S414. VSD atgādina atbilstošos no sprieguma atkarīgo Na+, K+ un Ca2+ kanālu un sprieguma jutīgo fosfatāžu domēnus, piemēram, CiVSP no. Ciona gutis15.Šajos citos proteīnos S4 C-gals ir pievienots efektora modulim, poru domēnam vai fermentam. Hv1 gadījumā S4 ir saistīts ar coiled-coil domēnu (CCD), kas atrodas membrānas citoplazmas pusē. .Kanāls ir dimērisks komplekss, kas sastāv no diviem VSD, no kuriem katrs satur ierobežotu protonu caurlaidības ceļu16, 17, 18. Tika konstatēts, ka šīs divas Hv1 apakšvienības atveras kooperatīvi19, 20, 21, 22, kas liecina, ka notiek allosteriskā savienošana un starpsubvienību mijiedarbība. svarīga loma vārtu noteikšanas procesā. Interfeiss starp apakšvienībām spoles apgabalā ir labi definēts, jo ir pieejamas divu izolēto domēnu kristāliskās struktūras22,23. No otras puses, saskarne starp VSD membrānā nav labi saprotams.Hv1-CiVSP himēriskā proteīna kristāliskā struktūra nesniedz informāciju par šo saskarni, jo kristalizētā kanālu kompleksa trimeriskā organizācija var rasties, aizstājot native Hv1 CCD ar rauga leicīna rāvējslēdzēju GCN424. Nesenā Hv1 kanāla apakšvienību organizācijas pētījumā secināts, ka divas S4 spirāles pāriet CCD bez nopietniem sekundārās struktūras traucējumiem, kā rezultātā veidojas garas spirāles, kas sākas no membrānas un izvirzās citoplazmā. Pamatojoties uz cisteīna šķērssavienojuma analīzi, šajā pētījumā ir ierosināts, ka Hv1 VSD savā starpā saskaras S4 segmentā. Tomēr citos pētījumos ir ierosinātas alternatīvas saskarnes starp VSD. Šīs saskarnes ietver S1 segmentus 17, 21, 26 un S2 segmenta 21 ārējos galus. Iespējamais pretrunas iemesls. šo pētījumu rezultāti ir tādi, ka allosteriskā savienošana starp VSD tika pārbaudīta saistībā ar vārtošanas procesu, kas ir atkarīgs no slēgtā un atvērtā stāvokļa, un saskarne starp VSD var atšķirties dažādās konformācijas stāvokļa izmaiņās. Šeit mēs noskaidrojām, ka 2-guanidinotiazols inhibē Hv1 kanālus, sinerģiski saistoties ar diviem atvērtiem VSD, un izmantojām vienu no savienojumiem, 2-guanidinobenzotiazolu (GBTA), lai pārbaudītu mijiedarbību starp apakšvienībām atvērtā stāvoklī. Mēs atklājām, ka GBTA saistīšanās līkni var labi aprakstīt ar kvantitatīvu modeli, kurā inhibitora saistīšanās ar vienu apakšvienību palielina blakus esošās apakšvienības saistīšanās afinitāti. Mēs arī atklājām, ka atlikumi D112, selektivitātes filtri kanāls 27, 28 un daļa no guanidīna atvasinājuma saistīšanās vietas 29 kontrolē GBTA saistīšanās kooperativitāti. Mēs parādām, ka kooperatīvā saistīšanās tiek uzturēta Hv1 dimērā, kur CCD atdalās no S4 segmenta, kas liecina, ka starpsubvienību saskarne CCD nav tieši saistīta. mediē allosterisko savienojumu starp GBTA saistošajām vietām. Turpretim mēs atklājam, ka S1 fragments ir daļa no saskarnes starp apakšvienībām, un ierosinām blakus esošo VSD izkārtojumu ar S4 spirāles ekstracelulāro galu prom no dimēra centra, lai nodrošinātu iespēju S1 fragmentam jābūt atvērtā stāvoklī. Hv1 mazo molekulu inhibitori ir noderīgi kā pretvēža zāles un neiroprotektīvi līdzekļi. Tomēr līdz šim tikai daži savienojumi ir spējuši inhibēt kanālu30, 31, 32, 33. To vidū ir 2-guanidinobenzimidazols (2GBI, savienojums [1] attēlā). 1a) un tā atvasinājumi bloķē VSD29,32 protonu caurlaidību caur kanālu. Tiek uzskatīts, ka šādu savienojumu saistīšanās notiek neatkarīgi abās atvērtajās apakšvienībās.2-guanidinobenzotiazols (GBTA, savienojums [2] 1.a attēlā). Iepriekš tika pierādīts, ka tas inhibē Hv1 gandrīz tikpat efektīvi kā 2GBI, pārbaudot 200 μM koncentrācijā (1.b attēls). Mēs pārbaudījām citus tiazola atvasinājumus un atklājām, ka daži no tiem inhibē kanālu ar līdzīgu vai lielāku potenciālu nekā GBTA (1. attēls un papildinājums). teksts).Mēs noteicām četru tiazola atvasinājumu (GBTA un savienojumu [3], [6] un [11], 1.c att.) koncentrācijas reakcijas līknes un konstatējām, ka tās ir stāvākas nekā 2GBI. Hila koeficienti (h) tiazola atvasinājumu diapazons bija no 1,109 ± 0,040 līdz 1,306 ± 0,033 (att. 1.c un papildu 1. att.. Turpretim Hila koeficients 2GBI bija 0,975 ± 0,024 29, 2.a attēls un 1. papildu attēls). Hilla koeficients virs 1 norāda uz saistīšanās kooperativitāti. Tā kā katrai Hv1 apakšvienībai ir savs inhibitors. saistīšanās vieta,29,32, mēs uzskatījām, ka tiazola atvasinājuma saistīšanās ar vienu apakšvienību varētu uzlabot otras inhibitora molekulas saistīšanos ar blakus esošo apakšvienību. GBTA bija testa savienojums ar augstāko Hila koeficientu. Tāpēc mēs izvēlējāmies šo savienojumu, lai turpināt pētīt saistīšanās sinerģijas mehānismu un izmantot 2GBI kā atsauces negatīvo kontroli. a) Testa savienojumi: [1] Atsauces Hv1 inhibitors 2-guanidino-benzimidazols (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazols (GBTA), [3] (5-trifluormetil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidīns, [4] nafto[1,2-d][1,3] tiazol-2-il -guanidīns, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidīns, [6](5-brom-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidīns, [7] famotidīns, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karbonskābes etilesteris, [9] 2-guanidino-4-metil-etil-1,3-tiazol-5-karboksilāts, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etilacetāts, [11]1-[4-(4-hlorfenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidīns, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidīns.(b) Cilvēka Hv1 aktivitātes inhibīcija ar norādītajiem guanidinotiazoliem un atsauces savienojumu 2GBI (zili zaļas joslas) .Hv1 protonu strāvas tika mērītas Xenopus olšūnu plāksnēs uz āru, reaģējot uz depolarizāciju no turēšanas potenciāla -80 mV līdz +120 mV. Katrs inhibitors tika pievienots vannai koncentrācijā 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Dati ir vidēji ± SEM (n≥4).(c) No koncentrācijas atkarīga cilvēka Hv1 inhibīcija ar savienojumiem [2], [3], [6] un [11]. Katrs punkts apzīmē vidējo inhibīciju ± SD 3 līdz 15 mērījumiem. Līnija ir Hill fit, ko izmanto, lai iegūtu šķietamās Kd vērtības, kas norādītas papildu tabulā 1. Hill koeficienti tika noteikti no atbilstības, kas norādītas 1. papildu attēlā: h (1) = 0,975 ± 0,024 h (2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (sk. Metodes). (a,b) Savienojumi 2GBI un GBTA inhibēja dimēru un monomēru Hv1 no koncentrācijas atkarīgā veidā. Katrs punkts atspoguļo vidējo inhibīciju ± SD no 3 līdz 8 mērījumiem, un līkne ir Hill fit. Hill koeficienti (h), kas parādīti ievietotās histogrammas tika noteiktas no saderībām, kas norādītas papildu 3. un 4. attēlā. GBTA koncentrācijas reakcija, kas parādīta (a), ir tāda pati kā 1.c attēlā. Skatiet 1. papildu tabulu, lai uzzinātu šķietamās Kd vērtības. (c) GBTA kooperatīvā saistīšanās ar dimēru Hv1. Cietā melnā līnija apzīmē atbilstību eksperimentālajiem datiem ar (6) vienādojumu, kas apraksta saistīšanās modeli, kas parādīts (d). Pārtrauktās līnijas, kas apzīmētas ar 1. un 2. apakšpunktu, attēlo bimolekulāro asociāciju. -attiecīgi pirmā un otrā saistīšanās notikuma disociācijas līdzsvara līknes (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Piedāvātā Hv1 bloka mehānisma shematiska diagramma. GBTA gadījumā saistīšanās ar vienu atvērtu apakšvienību palielina blakus esošās atvērtās apakšvienības afinitāti (Kd2 0,05, 5.d, i att.) ). No otras puses, mutācija D123A ievērojami samazināja GBTA Hila koeficientu (p 0,05/14). Tā kā lādiņa neitralizēšana 123. pozīcijā abās apakšvienībās izraisīja spēcīgas GBTA saistīšanas kooperativitātes izmaiņas, savukārt lādiņa maiņai abās apakšvienībās bija tikai neliela ietekme, mēs paplašinājām analīzi, iekļaujot tikai vienu apakšvienību ar lādiņa inversijas kanālu. ģenerēja ar Hv1 saistītus dimērus ar D123R aizstāšanu C-gala apakšvienībā (5.b att.) un izmērīja GBTA un 2GBI koncentrācijas-reakcijas inhibīciju. Mēs atklājām, ka GBTA Hila koeficients, kas saistās ar WT-D123R kanāliem, bija ievērojami augstāks nekā tas. savvaļas tipa Hv1 (p 0,05). Mēs arī atklājām, ka bez βME Hila koeficients GBTA saistīšanai ar D112E I127C Hv1 dimēru bija ievērojami augstāks nekā tas, kas tika mērīts reducētāju klātbūtnē (6.e attēls un papildu 4. attēls), kas nozīmē, ka D112E mutācija. neatcēla GBTA saistīšanās kooperativitātes pieaugumu, kas radās cisteīna 127 šķērssaistīšanas rezultātā. Hila koeficientu, kas saistīts ar 2GBI saistīšanos ar D112E, I127C Hv1 dimēriem, arī būtiski neietekmēja D112E mutācija (1. attēls). 6d un papildu 3. att.). Kopumā šie atklājumi liecina, ka GBTA saistīšanos pastiprina mijiedarbība starp S1 fragmentu ārējiem galiem blakus esošajās Hv1 apakšvienībās, izmantojot pievilcīgu elektrostatisko mijiedarbību vai kovalento saišu veidošanos starp aizvietotajiem cisteīniem. Palielinās allosteriskā saite starp vietām un rada saistīšanās kooperativitāti. Lai gan pievilcīgas elektrostatiskās mijiedarbības ietekmi uz kooperativitāti var novērst ar mutāciju D112E, kovalento saišu ietekmi nevar. Izpētot ķīmisko telpu, kas pieejama guanidīna atvasinājumu saistīšanai ar Hv1 kanāliem, mēs atklājām, ka 2-guanidinotiazoliem, piemēram, GBTA, ir lielāka atkarība no koncentrācijas nekā 2-guanidinobenzimidazoliem (1.c attēls). GBTA saistīšanās ar abiem dimēriem Hila koeficienta analīze. un monomēru kanāliem (2.a, b. att.) un dimēriskajam kanālam, kurā viena apakšvienība bija iepriekš saistīta ar inhibitoru (4. att.), lika mums secināt, ka Hv1 inhibīcija ar GBTA. Darbība ir sinerģisks process, un savienojumu saistīšanās vietas abās apakšvienībās ir allostēriski saistītas. Atklājums, ka GBTA saistās ar atvērto kanālu, kā iepriekš parādīts radniecīgajam savienojumam 2GBI32, liecina, ka allosterisko savienojumu var īpaši novērtēt atvērtā stāvoklī.Mūsu kooperatīvā saistīšanās modelis spēja kvantitatīvi aprakstīt HV1 kavēšanu ar GBTA (2.C att.) Un izskaidrot 2GBI un GBTA atšķirīgo iedarbību uz kanāla astes straumju sabrukšanu pēc membrānas repolarizācijas, kas atbalsta mūsu saistīšanas procesa interpretāciju. Maksimālais kalna koeficients, ko var sasniegt allosteriskā olbaltumvielā ar divām saistīšanas vietām (piemēram, HV1), ir 2. Mēs izmērām GBTA, lai saistītu HV1 savvaļas tipu ar koeficientu 1,31, kas HV1 I127c. palielinājās līdz 1,88.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The.The. Sinerģiskā brīvā enerģija, atšķirība starp zemāko un augstāko afinitātes vietu saistošajām brīvajām enerģijām (sk. Metodes) bija 1,3 kcal/mole HV1 savvaļas tipa un 2,7 kcal/mola gadījumā HV1 I127c. Skābekļa līdz hemoglobīnam ir slavenākais un labi izpētītākais sadarbības procesa piemērs38. Hemoglobīnam (tetramers ar četrām allosteriski savienotām saistīšanas vietām), kalna koeficients svārstās no 2,5-3,0, ar vērtībām no 1,26 līdz 3,64 KCAL/mol, atkarībā no eksperimentālajiem apstākļiem38.Tiem, globālās enerģētikas ziņā, GBTA saistīšanās ar HV1 kooperativitāti būtiski neatšķiras no O2 saistīšanās ar hemoglobīnu, ja tiek ņemts vērā atšķirīgais skaits olbaltumvielu apakšvienību abās sistēmās. Mūsu sinerģijas modelī GBTA molekulu saistīšanās ar vienu apakšvienību izraisa blakus esošās apakšvienības saistīšanās afinitātes palielināšanos Izmaiņas mijiedarbībā starp apakšvienībām. Reakcija uz šīm izmaiņām blakus esošās apakšvienības maina to saistīšanās vietas, kā rezultātā rodas stingrāka GBTA saistīšanās. Šim procesam S1 aspartāta D112 ir atbildīga par saistīšanas vietas, kas saistītas ar palielinātu saistīšanas afinitāti, pārkārtošanos.D112 iepriekš tika pierādīts, ka tā ir daļa no HV1 protonu caurlaidības ceļa un darbojas kā selektivitātes filtrs27,28. Mūsu rezultāti rāda, ka selektivitātes filtri divās HV1 apakšvienībās tiek allosteriski savienoti atklātā stāvoklī. 7A attēls parāda GBTA saistīšanās vietas aptuveno atrašanās vietu un atlikumu D112, D123, K125 un I127 atrašanās vietu uz HV1 VSD shēmas shēmas shēmā, kas balstīta uz HV1 VSD shēmu shēmā, kas balstīta uz shēmu. HV1-CIVSP chimera kristāla struktūrā. Izsakāmi virzieni allosteriskai savienošanai, kas saistīta ar S1 ārpusšūnu galu, tiek parādīti ar melnām bultiņām. (A) HV1 VSD shēma, kas balstīta uz HV1-CIVSP chimera kristāla struktūru, tiek pierādīts, ka spirālie segmenti ir cilindriski. Šajā konfigurācijā S4 segmenta iekšējais gals saplūst ar CCD (nav parādīts). Paredzētās saistošās GBTA vietas tiek parādītas kā pelēki ovāli. Bulcijas bultiņas norāda ceļus, kas saistīti ar allosterisko savienojumu starp saistošajām vietām divās blakus esošajās apakšvienībās. Izpētīto S1 atlikumu pozīcijas ir apzīmētas ar krāsainām sfērām. (B) HV1 apakšvienību shematiska ilustrācija. Divās dažādās dimēru konfigurācijās, kā redzams no membrānas plaknes ārpusšūnu puses. Kreisajā panelī dimēra saskarni veido S4 spirāle. Divu VSD 20 grādu pulksteņa rādītāja virzienā ap asi perpendikulāri membrānas plaknei, ko papildina ar membrānas plakni. Divu S4 helices ārējo galu atdalīšana (ar pārtrauktas bultiņas) rada labajā pusē parādīto izkārtojumu. Šajā konfigurācijā atlikumi D123 un i127 no blakus esošajām apakšvienībām ir atļauts tuvināties. (C) CivSP VSD shematisks attēlojums. dimēra konfigurācijā, kas atrodama 4G80 kristāla struktūrā. P140. Mūsu rezultāti rāda, ka atgriešanās elektrostatiskā mijiedarbība starp atlikumu 123 (123D/123D vai 123R/123R) ir saistīta ar "normālu" GBTA saistošās kooperatīva līmeni atklātā stāvoklī un maina mijiedarbību no atgrūšanās līdz piesaistītai (123D/123R) maina (123D/123.) , palielināta sadarbība (5.g attēls). Paredzams, ka atgrūdošās mijiedarbības ar alanīna aizstāšanu noņemšana arī palielinātu kooperatīvu. Tomēr tika novērots 123A/123A dimēra kooperatīva samazināšanās (5.E attēls). Viens iespējamais Paskaidrojums ir tāds, ka hidrofobisko atlieku ievietošanas hidrofilā vidē destabilizējošā ietekme var pārsniegt stabilizējošo efektu, pateicoties atgrūdošas mijiedarbības novēršanai starp D123 atlikumiem, kā rezultātā kopumā samazinās saistošā kooperativitāte.mony et al.39 nesen ziņoja par to, ka šķīdinātāja pieejamība plkst Ciona gutis CI-HV1 (atbilstoši D123-cilvēka HV1) D171 pozīcija tiek palielināta, aktivizējot, atbalstot priekšstatu, ka D123 atrodas hidrofilā vidē atklātā stāvoklī. Ir zināms, ka HV1 kanālu vārti notiek, izmantojot vairākas pārejas19,20,26,39,40,41.Qiu et al26, tika atklāts, ka pēc membrānas depolarizācijas CI-HV1 sprieguma sensors notiek ar konformācijas izmaiņām, kas atstāj kanālu aktivizētu, bet joprojām slēgtu slēgtu , kam sekoja izteikta pāreja, kas izraisa protonu atvēršanu abās apakšvienību ceļā. Sprieguma sensora konformācijas izmaiņas tika uzraudzītas ar sprieguma skavas fluorescenci, un tika atklāts, ka otro pāreju selektīvi traucē mutācija pozīcijā D171. Fluorescējošā signāla perturbācija saskan ar elektrostatiskās mijiedarbības klātbūtni starp blakus esošo apakšvienību D171 atlikumiem kādā brīdī gar konformācijas izmaiņu reakcijas koordinātām. Šī interpretācija atbilst mūsu secinājumam, ka D123 atlikums elektrostatiski mijiedarbojas atklātā stāvoklī un mediē alosterisku savienojumu starp GBTA saistīšanas vietām. Fujiwara et al25 ierosināja, ka citoplazmatiskās spolētās spoles domēna dimēra saskarne stiepjas membrānā, lai saturētu divas S4 helices (7.B att., Kreisais panelis). Šīs starpnozaru mijiedarbības modelis ir balstīts uz cisteīna savstarpējās saistīšanas analīzi, kas aptver Visa reģiona VSD un funkcionālā analīze, kas savieno S4 spirāli, un CCD. Transmembrāna pH gradienta neesamībai HV1 kanāliem ir nepieciešama ievērojama membrānas depolarizācija, lai atvērtu, un cisteīna krustošanās notiek apstākļos, kad kanāls pārsvarā tiek slēgts. Tāpēc atklātais S4-S4 saskarne, iespējams, atspoguļo ārpusstatūras apakšvienību konfigurāciju.Citos pētījumos ir atklājuši pierādījumi par S1 un S2 iesaistīšanos starpnozaru mijiedarbībās, kas saistītas ar Gating17,21,26 laikā, kas liek domāt, ka kanāli var pieņemt dažādas apakšvienības konfigurācijas atklātā un atklātā un atklātā un atklātā apakšvienību konfigurācijās. slēgti stāvokļi, ideja, kas atbilst Mony et al. S1 pārvietojas 39 vārtu guvuma laikā. Šeit mēs parādām, ka atklātā stāvoklī S1 spirāles ārpusšūnu gali ir pietiekami tuvu, lai atbalstītu tiešo elektrostatisko mijiedarbību, kas mediē allosterisko savienojumu starp apakšvienībām. izņemot viens otru, lai tieši mijiedarbotos. Ar mūsu atklājumiem (7.b att., labais panelis). Mēs iesakām šo kanāla konfigurāciju atklātā stāvoklī. Lai arī tiek uzskatīts, ka CivSP enzīms darbojas kā monomērs, tā izolētā VSD kristāla struktūra tiek uztverta dimēra stāvoklī. S1 helices ārējie gali ir šajā dimērā, un kopējā konfigurācija ir līdzīga tai ierosinātajai HV1 (7.c att.). un CIVSP dimēri liecina, ka šo olbaltumvielu VSD ir raksturīga tendence veidot saskarni, kurā mijiedarbojas ārpusšūnu gali. HV1 būtiska loma spermas šūnu aktivizēšanā padara šo kanālu par pievilcīgu zāļu mērķi vīriešu auglības kontrolei. Ir pierādīts, ka, pēc tam ir pierādīts, ka HV1 aktivizēšana mikroglijā pasliktina atveseļošanos no išēmiska insulta. Paaugstināta HV1 aktivitāte ir saistīta ar zemāku Izdzīvošana pacientiem ar 12 vai kolorektālo vēzi 13 un tiek uzskatīts, ka tā veicina B-šūnu ļaundabīgu audzējus 11. Atvērtā HV1 apakšvienība, kas izraisa paaugstinātu saistīšanās afinitāti, var izraisīt spēcīgāku zāļu, kas vērsti uz HV1 kanāliem, var attīstīt. Vietnē vērsta cilvēka HV1 mutagenēze tika veikta, izmantojot standarta PCR metodes. Vienas apakšvienības C-gals ir saistīts ar otrās apakšvienības N-galu caur GGSGGSGGSGSGGSGG Linker. T7 mmessage mmachine transkripcijas komplekts (Ambion) .1-3 dienas pirms elektrofizioloģiskiem mērījumiem CRNS tika ievadīts ksenopusa oocītos (50 nl uz šūnu, 0,3-1,5 μg/μl). Vi un vi oocīti no Xenopus laevis (nasco) (nasco) tika iegūti (nasco)). No ekocītu biozinātnes. Pēc RNS injekcijas, šūnas tika uzturētas ND96 barotnē, kas satur 96 mM NaCl, 2 mm kcl, 1,8 mm CaCl, 1 mm mgcl, 10 mM hepes, 5 mm piruvāts, 100 μg/ml gentamicin, pH 7,2 18 ° C C C C C C C C C Cuvate, 100 μg/ml Gentamicin, pH 7,2 18 ° C C 18 ° C 18 ° C 18 ° C 18 ° C 18 ° C 18 ° C 18 ° C 18 ° C 18 ° C 18 ° 18 ° C 18 ° 18 ° 18 ° CEN 18 ° CEN 18 ° CCL, PĀRBAUDI, KAS PĀRBAUDE ” . 2-guanidino-benzimidazols [1], 2-guanidino-benzotiazols [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidīns [5], (5-bromo-4-metil-1,3,3 -tiazol-2-il) guanidīns) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazola-4-karboksilāts [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-tiazola- 5-karboksilāts [9] un (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) etilacetāts [10] bija no Sigma-Aldrich.Famotidīna [7] bija no MP biomedical.1- [4 -(4-hlorfenil) -1,3-tiazols-2-il] guanidīns [11] un 1- [4- (3,4-dimetoksifenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidīns [12] bija bija [12] no Matrix Scientific. Šie savienojumi ir vislielākā komerciāli pieejamā tīrība. Tie tika izšķīdināti sausā DMSO, lai radītu 100 mm rezerves šķīdumu, kas pēc tam tika atšķaidīts ierakstīšanas šķīdumā vēlamajā galīgajā koncentrācijā. Vismaz 99% tīrība. To a suspension of 2-amino-4-(trifluoromethyl)benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) in 25 mL of aqueous hydrochloric acid (2.5 N) was added solid dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol), and the resulting heterogeneous mixture was refluxed with vigorous stirring for 4 hours.The reaction mixture was cooled to room temperature and neutralized by gradual addition of 10N potassium hydroxide.The white precipitate formed was filtered, washed with cold water (3 × 50 ml), dried in an oven ( 65 ° C) vairākas stundas un pēc tam pārkristalizēt no etilacetāta/naftas ētera, lai iegūtu baltu cietu vielu (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (gaisma 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [PPM] = 7,25 (ļoti plats S, 4 H), 7,40 (D, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (S, 1 H), 7,92 (D , 1 H, J = 8.1 Hz).13C NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 114.2 (d, J = 3.5 Hz), 117.5 (d, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, J = 272 Hz), 126,1 (q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.hrms (ESI): m/z aprēķinātā vērtība.For C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, atrasts : 261.0419. Nafto [1,2-d] tiazol-2-amīns (300 mg, 1,5 mmol), sintezēts, kā aprakstīts iepriekš, tika uzkarsēts līdz 200 ° C eļļas vannā nelielā mēģenē.300 mg (liels liekais) cianamīds un 1,0 ml conc. līdz karsto savienojumu strauji pievienoja sālsskābi un maisījumu turēja eļļas vannā apmēram 2 minūtes, šajā laikā lielākā daļa ūdens iztvaicēja. Pēc tam reakcijas maisījumu atdzesēja līdz istabas temperatūrai, un iegūtais sacietētais materiāls tika atdzesēts līdz istabas temperatūrai, un no tā izrietošais sacietētais materiāls tika atdzesēts un no tā izrietošais sacietēts materiāls atdzesēja un no tā izrietēja sacietējušais materiāls. tika sadalīts mazos gabaliņos un mazgāts ar ūdeni, lai nodrošinātu gaiši dzeltenu amorfu cietu vielu. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13c NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.Hrms (ESI): M/Z Aprēķinātā vērtība.For C12H11N4S (M + H) +: 243.069999 , Atrasts: 243.0704. Protonu strāvas tika izmērītas olšūnu iekšējos un ārējos plāksteros, kas ekspresē dažādas konstrukcijas, izmantojot Axopatch 200B pastiprinātāju, ko kontrolē aksona digidata 1440A (molekulārās ierīces) ar PCLAMP10 programmatūru.Incellular un ārpusšūnu šķīdumiem ir vienāds sastāvs: 100 mM 2- (n-morfolinoīno (N-morfolinoīno (N-morfolinoīno ) etanesulfonskābe (MES), 30 mm tetraetilamonijs (tēja) mezilāts, 5 mM tējas hlorīds, 5 mM etilēnglikola-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraetiķskābe (EGTA), kas pielāgota pH 6,0 ar tējas hidroksīdu. Visi mērījumi tika veikti ar 22 ± 2 ° C. Pipetes piekļuves pretestība ir 1,5–4 MΩ. Pagriezumu pēdas tika filtrētas 1 kHz, parauga 5 kHz frekvencē un analizēja ar skavu 10,2 (molekulārās ierīces ierīces (molekulārās ierīces ) un izcelsme8.1 (OriginLab). Šķīdumi, kas satur dažādas HV1 inhibitora koncentrācijas, un dažos gadījumos 10 mM βME tika ievadīts vannā ar smaguma pakāpi caur kolektoru, kas savienots ar VC-6 perfūzijas vārsta sistēmu (Warner Ingr.), Kas tika izlaists caur PCLAMP programmatūras TTL (tranzistor-- Tranzistora loģika) Signāli.Rapid perfūzijas eksperimenti tika veikti, izmantojot vairāku cauruļu perfūzijas zīmuli (automatizēt Sci.) Ar 360 μm diametra piegādes galu, kas uzstādīts plākstera pipetes priekšā. Kanāla inhibīcija tika noteikta ar izohroniem amperometriskiem mērījumiem, kas ir izohronas amperometriskos mērījumus, galos beigās beigās beigās beigās galā beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās esošie beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās esošie beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās esošie beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās esošais beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās beigās Bauilas beigas beigās beigās beigās beigas +120 mV depolarizējošais impulss.gv mērījumi tika veikti, kā aprakstīts iepriekš aprakstīts18,20.Sta strāvas tika reģistrētas -40 mV pēc depolarizācijas posmiem ar dažādiem spriegumiem no -20 mV līdz +120 mV, ja vien nav norādīts citādi. Izmanto, lai koriģētu pašreizējo sabrukšanu 18. GV grafiks atbilst Boltzmann vienādojumam: šķietamās disociācijas konstantes (KD) dažādām kanālu un inhibitoru kombinācijām (1. papildu tabula) noteica, piestiprinot nomākšanas atkarību no koncentrācijas (vidējās %inhibu vērtības) koncentrācijas atkarība no koncentrācijas (vidējās %inhibu vērtības) Ar kalna vienādojumu: kur [i] ir I un H inhibitora koncentrācija ir kalna koeficients. Lai aprēķinātu kalna koeficientu, vienādojums (2) tiek pārkārtots šādi: