Famotopotorana ny interface intersubunit amin'ny fantsona proton Hv1 misokatra miaraka amin'ny probe mitambatra allosterically

Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Ny kinova mpitety tranonkala ampiasainao dia manana fanohanana voafetra ho an'ny CSS. Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, dia manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na vonoy ny fomba fampifanarahana amin'ny Internet Explorer). fanohizana fanohanana, dia hampiseho ny tranokala tsy misy styles sy JavaScript izahay. Ny fantsona proton misy vavahadin-tseza Hv1 dia complexe dimeric ahitana domaine-sensible roa (VSDs), izay samy misy lalan'ny proton permeation gated. Ny dimerization dia fehezin'ny domaine cytoplasmic coiled-coil. ny fanjakana misokatra amin'ny VSD roa dia fantatra fa miara-miasa; Na izany aza, tsy dia fantatra loatra ny momba ny mekanika fototra. Ny interface intersubunit dia manana anjara toerana lehibe amin'ny fizotry ny allosterika; Na izany aza, ny fifandraisana toy izany dia tsy fantatra amin'ny fantsona Hv1 misokatra. Eto dia asehontsika fa ny derivatives 2-guanidinothiazole dia manakana ny Hv1 VSD roa amin'ny fomba fiaraha-miasa ary mampiasa ny iray amin'ireo fitambarana ireo ho toy ny probe amin'ny fifandraisana allosterika eo amin'ireo subunits misokatra. Ny faran'ny ampahany transmembrane voalohany amin'ny VSD dia mamorona interface intersubunit izay manelanelana ny fifandraisana eo amin'ny tranokala mifamatotra, fa ny sehatra coiled-coil dia tsy tafiditra mivantana amin'ity dingana ity. . Ny fantsona proton misy vavahady dia manana anjara toerana lehibe amin'ny zavamananaina isan-karazany, manomboka amin'ny phytoplankton ka hatramin'ny olombelona1. Amin'ny ankamaroan'ny sela, ireo fantsona ireo dia manelanelana ny fivoahan'ny proton avy amin'ny fonon'ny proton ary mandrindra ny asan'ny NADPH oxidase. dia Hv1, izay vokatra avy amin'ny HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) dia hita fa mitana anjara toerana amin'ny fihanaky ny sela B4, famokarana karazana oksizenina mihetsiketsika avy amin'ny rafitra fiarovana voajanahary5,6,7,8, sela tsirinaina. motility9 sy ny pH fanaraha-maso ny rivotra ambonin'ny fluid10. Ity fantsona ity dia mandray anjara amin'ny karazana homamiadana maro Overexpressed toy ny kanseran'ny sela B4,11 ary ny kanseran'ny nono sy ny colorectal12,13. Ny hetsika Hv1 be loatra dia hita fa mampitombo ny mety ho metastazy amin'ny sela homamiadana 11, 12 . Ao amin'ny atidoha, ny Hv1 dia aseho. amin'ny microglia, ary ny asany dia hita fa mampitombo ny fahasimban'ny ati-doha amin'ny modely amin'ny famelezana ischemic. Ny proteinina Hv1 dia misy sehatra mahatsikaiky (VSD), izay misy fizarana transmembrane efatra antsoina hoe S1 ka hatramin'ny S414. Ny VSD dia mitovy amin'ny sehatra mifandraika amin'ny fantsona Na +, K + ary Ca2 + misy volkano ary ny phosphatase saro-pady, toy ny CiVSP avy amin'ny Ciona gutis15. Ao amin'ireo proteinina hafa ireo, ny C-terminus an'ny S4 dia mifamatotra amin'ny module effector, ny domaine pore na ny enzyme. .Ny fantsona dia complexe dimeric ahitana VSDs roa, izay samy misy vavahady proton permeation pathway16,17,18.Ireo subunits roa Hv1 ireo dia hita fa misokatra miara-miasa19,20,21,22, manoro hevitra fa ny allosteric coupling sy inter-subunits fifaneraserana dia milalao. Ny fifandraisana misy eo amin'ny subunits ao anatin'ny sehatra coil coiled dia voafaritra tsara satria misy ny rafitra kristaly amin'ny sehatra roa mitoka-monina22,23. Amin'ny lafiny iray, ny fifandraisana eo amin'ny VSD ao anatin'ny membrane dia tsy misy. Ny firafitry ny krystaly amin'ny proteinina chimeric Hv1-CiVSP dia tsy manome fampahalalana momba ity interface ity, satria ny fandaminana trimeric amin'ny complex channel crystallized dia mety vokatry ny fanoloana ny Hv1 CCD teratany amin'ny leucine leucine zipper GCN424. Ny fandinihana vao haingana momba ny fikambanan'ny subunit amin'ny fantsona Hv1 dia nanatsoaka hevitra fa ny helices S4 roa dia mivezivezy ao amin'ny CCD tsy misy fanelingelenana mafy amin'ny rafitra faharoa, ka miteraka helika lava izay manomboka amin'ny membrane sy ny tetikasa mankany amin'ny cytoplasma. Ity fanadihadiana ity dia manolotra fa ny Hv1 VSD dia mifandray amin'ny fizarana S4. Na izany aza, ny fanadihadiana hafa dia nanolotra fifandraisana hafa eo amin'ny VSDs. Ireo fifandraisana ireo dia ahitana ny fizarana S1 17, 21, 26 ary ny faran'ny S2 fizarana 21. Ny vokatr'ireo fanadihadiana ireo dia ny fifandraisana allosterika eo amin'ny VSD dia nodinihina mifandraika amin'ny fizotry ny gating, izay miankina amin'ny fanjakana mihidy sy misokatra, ary ny fifandraisana misy eo amin'ny VSD dia mety miovaova amin'ny fiovan'ny fanjakana samihafa amin'ny conformation. Eto izahay dia nahita fa ny 2-guanidinothiazole dia manakana ny fantsona Hv1 amin'ny fifamatorana amin'ny VSD misokatra roa, ary nampiasa ny iray amin'ireo fitambarana, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), mba hanadihady ny fifandraisana misy eo amin'ny subunits amin'ny fanjakana misokatra. Hitanay fa ny curve mamatotra GBTA dia azo faritana tsara amin'ny modely quantitative izay mamatotra ny inhibitor amin'ny subunit iray dia miteraka fitomboan'ny fifandraisana mifamatotra amin'ny subunit mifanila. fantsona 27, 28 ary ampahany amin'ny tranokala fatorana guanidine derivative 29 mifehy ny fiaraha-miasa mifamatotra amin'ny GBTA. Asehontsika fa ny fatoran'ny fiaraha-miasa dia tazomina ao amin'ny dimer Hv1, izay misaraka amin'ny fizarana S4 ny CCD, izay manoro hevitra fa tsy mivantana ny interface intersubunit ao amin'ny CCD. Mifanohitra amin'izany kosa, hitantsika fa ny sombintsombin'ny S1 dia ampahany amin'ny fifandraisana misy eo amin'ireo subunits ary manolotra fandaharana VSD mifanakaiky miaraka amin'ny faran'ny extracellular amin'ny S4 helix lavitra ny afovoan'ny dimer. ny sombintsombiny S1 ho ao amin'ny fanjakana misokatra. Ny inhibitors molekiola kely amin'ny Hv1 dia ilaina amin'ny fanafody antikansera sy ny neuroprotective agents. Na izany aza, hatramin'izao, dia vitsy ny karbaona afaka manakana ny fantsona30,31,32,33. Anisan'izany ny 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, fitambarana [1] ao amin'ny sary. .1a) sy ny derivatives dia hita fa manakana ny VSD29,32 permeation ny protons amin'ny alalan'ny fantsona. naseho teo aloha fa manakana ny Hv1 saika mahomby toy ny 2GBI rehefa notsapaina tamin'ny fifantohana amin'ny 200 μM (sary 1b). Nandinika ny derivatives thiazole hafa izahay ary nahita fa ny sasany tamin'izy ireo dia nanakana ny fantsona mitovy na lehibe kokoa noho ny GBTA (sary 1 sy fanampiny). Nofaritanay ny curve valin'ny fifantohana amin'ny derivatives thiazole efatra (GBTA sy compounds [3], [6] ary [11], Fig. 1c) ary hitanay fa mitsambikina kokoa noho ny an'ny 2GBI. The Hill coefficients (h) Ny derivatives thiazole dia avy amin'ny 1.109 ± 0.040 hatramin'ny 1.306 ± 0.033 (sary 1). 1c sy Supplementary Fig. 1). Mifanohitra amin'izany kosa, ny coefficient Hill ho an'ny 2GBI dia 0.975 ± 0.024 29, Fig. 2a ary Fig. 1 fanampiny). Ny coefficient Hill eo ambonin'ny 1 dia manondro ny fiaraha-miasa mifamatotra. Satria ny subunit Hv1 tsirairay dia manana ny inhibitor-ny. toerana mamatotra, 29,32 dia nieritreritra izahay fa ny fatoran'ny derivative thiazole amin'ny subunit iray dia mety hanatsara ny fatoran'ny molekiola inhibitora faharoa amin'ny subunit mifanakaiky. mandalina bebe kokoa ny mekanisma famatorana synergy ary mampiasa 2GBI ho fanaraha-maso ratsy. (a) Tambajotra fitiliana: [1] Reference Hv1 inhibitor 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10] ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Fanakanana ny asan'ny Hv1 olombelona amin'ny alàlan'ny guanidinothiazoles voalaza sy ny fitambaran'ny reference 2GBI (baro maitso manga) .Hv1 proton currents dia norefesina tao anatin'ny takela-by ivelany Xenopus oocytes ho setrin'ny depolarization avy amin'ny fihazonana mety ny -80 mV ho +120 mV. Ny inhibitor tsirairay dia nampiana tao amin'ny fandroana amin'ny fifantohana amin'ny 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Ny angon-drakitra dia midika hoe ± SEM (n≥4) hatramin'ny 15 refy. Ny tsipika dia havoana iray ampiasaina hahazoana ny soatoavina Kd hita ao amin'ny tabilao fanampiny 1. Ny coefficients Hill dia nofaritana tamin'ny fitsirihana voalaza ao amin'ny sary fanampiny 1: h (1) = 0.975 ± 0.024 h (2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (jereo ny fomba). (a, b) Ny fitambarana 2GBI sy GBTA dia nanakana ny dimeric sy monomeric Hv1 amin'ny fomba miankina amin'ny fifantohana. ny histograms inset dia nofaritana avy amin'ny fitsirihana voalaza ao amin'ny Fig fanampiny 3 sy 4. Ny valin'ny fifantohana amin'ny GBTA aseho ao amin'ny (a) dia mitovy amin'ny an'ny sary 1c. Jereo ny tabilao fanampiny 1 ho an'ny sanda Kd hita maso. (c) Modeling of ny fatoran'ny GBTA amin'ny dimeric Hv1. Ny tsipika mainty mivaingana dia maneho ny mety amin'ny angona andrana amin'ny alàlan'ny equation (6), izay mamaritra ny modely mifamatotra aseho amin'ny (d). -Tsivan'ny equilibrium dissociation amin'ny hetsika mifamatotra voalohany sy faharoa (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Diagrama schematic momba ny mekanika natolotry ny sakana Hv1. Raha ny GBTA, ny fatorana amin'ny subunit misokatra iray dia mampitombo ny fifandraisan'ny subunit misokatra mifanakaiky (Kd2 0.05) amin'ny coefficient Hill amin'ny GBTA mifamatotra amin'ny fantsona GGG raha oharina amin'ny karazana bibidia (sary 5c), manoro hevitra fa na dia eo aza ny anjara asany amin'ny fitazonana ny roa subunits miaraka manan-danja, fa ny CCD dia tsy manelanelana mivantana ny intersubunit allosteric coupling eo amin'ny GBTA mamatotra toerana. (a) Diagrama schematic ny dimer Hv1 miaraka amin'ny mutation triglycine amin'ny faran'ny S4 anatiny natao hanakorontanana ny intersubunit coupling mpanelanelana amin'ny sehatra cytoplasmic coiled-coil (zana-tsipìka manga). Ny fiovan'ny toetr'andro, natao hitsapana ny sombintsombin'ny S1 tafiditra amin'ny fifamatorana eo amin'ny zana-tsipìka (zana-tsipìka manga). ± SD amin'ny fandrefesana 3 hatramin'ny 10. Ny curve dia havoana azo ampiasaina mba hahazoana ny soatoavina Kd (jereo ny tabilao fanampiny 1). Hv1 WT dia aseho ho toy ny tsipika tapaka. Koa satria nolavinay ny CCD ho mpanelanelana mivantana amin'ny fatoran'ny fiaraha-miasa GBTA, dia nanontany izahay raha ny fifandraisana misy eo amin'ny VSD dia tafiditra amin'ny fifamatorana allosterika eo amin'ny tranokala mifamatotra. ao amin'ny fizarana transmembrane S1. Ny S1 dia misy sisa tavela roa hafa miiba, E119 sy D123, izay eo amin'ny lafiny mitovy amin'ny helix amin'ny D112, fa manakaiky kokoa ny faran'ny 24 amin'ny sombiny. mankany D112 amin'ny alàlan'ny waterlines36,37.Noho izany dia nozahanay raha toa ka tafiditra ao anatin'ny fifamatorana allosterika eo amin'ny tranokala mifamatotra GBTA ny E119 sy D123 (sary 5b). fa amin'ny lafiny ilany amin'ny helix S1 (sary 5b). Norefesinay ny fanakanana miankina amin'ny fifantohana amin'ny fantsona E119A, D123A ary K125A amin'ny 2GBI sy GBTA ary hitanay fa ny fiovan'ny E119A sy K125A dia tsy nanova tanteraka ny coefficient Hill amin'ny inhibitor raha oharina amin'ny karazana bibidia (p> 0.05, sary 5d, i). ). Amin'ny lafiny iray, ny mutation D123A dia nampihena be ny haavon'ny Havoanan'ny GBTA (p 0.05/14). Koa satria ny neutralizing ny fiampangana eo amin'ny toerana 123 amin'ny zanatany roa dia niteraka fiovana mahery vaika teo amin'ny fiaraha-miasa mifamatotra GBTA, raha toa ka nisy fiantraikany kely fotsiny ny famerenana ny fiampangana amin'ny zana-tsipìka roa, dia nanitatra ny famakafakana izahay mba hampidirana ampahany iray ihany miaraka amin'ny fantsona fanodikodinam-bola. dia niteraka dimers mifandray Hv1 miaraka amin'ny fanoloana D123R ao amin'ny subunit C-terminal (sary 5b) ary nandrefy ny fanakanana ny valin'ny fifantohana amin'ny GBTA sy 2GBI. Hitanay fa ny coefficient Hill an'ny GBTA mifatotra amin'ny fantsona WT-D123R dia ambony lavitra noho izany. amin'ny karazana Hv1 (p