ओपन एचव्ही1 प्रोटॉन चॅनेलच्या इंटरस्युब्युनिट इंटरफेसची चौकशी ॲलोस्टेरिकली जोडलेल्या प्रोबसह

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेट केलेला ब्राउझर वापरा (किंवा Internet Explorer मधील सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, याची खात्री करण्यासाठी सतत समर्थन, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट प्रदर्शित करू. Hv1 व्होल्टेज-गेटेड प्रोटॉन चॅनेल हे दोन व्होल्टेज-सेन्सिंग डोमेन (व्हीएसडी) असलेले एक डायमेरिक कॉम्प्लेक्स आहे, त्यातील प्रत्येकामध्ये एक गेट्ड प्रोटॉन परमीएशन पाथवे आहे. डायमरायझेशन सायटोप्लाज्मिक कॉइल्ड-कॉइल डोमेनद्वारे नियंत्रित केले जाते. बंद स्थितीतून संक्रमण दोन्ही व्हीएसडीमधील खुली स्थिती सहकारीपणे घडते म्हणून ओळखले जाते; तथापि, अंतर्निहित यंत्रणेबद्दल फारसे माहिती नाही. इंटरसब्युनिट इंटरफेस ॲलोस्टेरिक प्रक्रियांमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावतात; तथापि, खुल्या Hv1 चॅनेलमध्ये असे इंटरफेस ओळखले गेले नाहीत. येथे आम्ही हे दाखवून देतो की 2-guanidinothiazole डेरिव्हेटिव्ह दोन Hv1 VSDs सहकार्याने अवरोधित करतात आणि यापैकी एक संयुगे ओपन सबयुनिट्समधील ॲलोस्टेरिक कपलिंगसाठी प्रोब म्हणून वापरतात. आम्हाला आढळले की बाह्य पेशी व्हीएसडीच्या पहिल्या ट्रान्समेम्ब्रेन फ्रॅगमेंटच्या शेवटी एक इंटरसब्युनिट इंटरफेस तयार होतो जो बाइंडिंग साइट्समधील कपलिंगमध्ये मध्यस्थी करतो, तर कॉइलेड-कॉइल डोमेन या प्रक्रियेत थेट सहभागी होत नाही. आम्हाला चॅनेलचे प्रोटॉन-सिलेक्टिव्ह फिल्टर ब्लॉकर-बाइंडिंग कोऑपरेटिव्हिटी नियंत्रित करते याचाही भक्कम पुरावा आढळला. . व्होल्टेज-गेटेड प्रोटॉन चॅनेल फायटोप्लँक्टनपासून मानवापर्यंत विविध जीवांमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावतात. बहुतेक पेशींमध्ये, या वाहिन्या प्रोटॉन झिल्लीतून प्रोटॉन प्रवाह मध्यस्थी करतात आणि NADPH ऑक्सिडेसच्या क्रियाकलापांचे नियमन करतात. मानवांमध्ये एकमेव ज्ञात व्होल्टेज-गेट प्रोटॉन चॅनेल Hv1 आहे, जे HVCN1 जनुकाचे उत्पादन आहे 2,3. Hv1 (उर्फ VSOP) बी सेल प्रसार 4 मध्ये भूमिका बजावते, जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रणाली 5,6,7,8, शुक्राणू पेशीद्वारे प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींचे उत्पादन करते. गतिशीलता9 आणि वायुमार्गाच्या पृष्ठभागाच्या द्रवपदार्थाचे pH नियमन10. हे चॅनेल बी-सेल मॅलिग्नेंसी 4,11 आणि स्तन आणि कोलोरेक्टल कर्करोग 12,13 सारख्या कर्करोगाच्या अनेक ओव्हरएक्सप्रेसमध्ये सामील आहे. अत्यधिक Hv1 क्रियाकलाप कर्करोगाच्या पेशींची मेटास्टॅटिक क्षमता 11, 12 वाढवत असल्याचे आढळले आहे. मेंदूमध्ये, Hv1 व्यक्त केले जाते. मायक्रोग्लिया द्वारे, आणि त्याची क्रिया इस्केमिक स्ट्रोकच्या मॉडेल्समध्ये मेंदूचे नुकसान वाढवते असे दर्शविले गेले आहे. Hv1 प्रोटीनमध्ये व्होल्टेज-सेन्सिंग डोमेन (VSD) असते, ज्यामध्ये S1 ते S414 असे चार ट्रान्समेम्ब्रेन सेगमेंट असतात. व्हीएसडी व्होल्टेज-गेटेड Na+, K+ आणि Ca2+ चॅनेल आणि व्होल्टेज-संवेदनशील फॉस्फेटेसेस मधील व्होल्टेज-संवेदनशील फॉस्फेटेसेस, जसे की, Ciona gutis15.या इतर प्रथिनांमध्ये, S4 चे C-टर्मिनस एका प्रभावक मॉड्यूलशी, छिद्र डोमेन किंवा एन्झाइमशी जोडलेले आहे. Hv1 मध्ये, S4 हे झिल्लीच्या सायटोप्लाज्मिक बाजूला असलेल्या कॉइलड-कॉइल डोमेन (CCD) शी जोडलेले आहे. .चॅनेल हे दोन VSDs असलेले एक डायमेरिक कॉम्प्लेक्स आहे, ज्यामध्ये प्रत्येकामध्ये गेट केलेला प्रोटॉन पारमीशन पाथवे आहे 16,17,18. हे दोन Hv1 सबयुनिट्स 19,20,21,22 सहकारी रीतीने उघडलेले आढळले, जे सूचित करते की ॲलोस्टेरिक कपलिंग आणि इंटर-सब्युनिट परस्परसंवाद खेळतात. गेटिंग प्रक्रियेत महत्त्वाची भूमिका. कॉइल केलेल्या कॉइल डोमेनमधील सबयुनिट्समधील इंटरफेस चांगल्या प्रकारे परिभाषित केला जातो कारण दोन वेगळ्या डोमेनच्या क्रिस्टल स्ट्रक्चर्स उपलब्ध आहेत 22,23. दुसरीकडे, पडद्यामधील VSDs दरम्यान इंटरफेस नाही. चांगले समजले. Hv1-CiVSP chimeric प्रोटीनची क्रिस्टल स्ट्रक्चर या इंटरफेसबद्दल माहिती देत ​​नाही, कारण क्रिस्टलाइज्ड चॅनेल कॉम्प्लेक्सच्या ट्रायमेरिक संस्थेचा परिणाम मूळ Hv1 CCD च्या यीस्ट ल्यूसीन झिपर GCN424 द्वारे बदलू शकतो. Hv1 चॅनेलच्या सब्यूनिट संस्थेच्या अलीकडील अभ्यासातून असा निष्कर्ष निघाला की दोन S4 हेलिकेस CCD मध्ये दुय्यम संरचनेत गंभीर व्यत्यय न आणता संक्रमण करतात, परिणामी लांब हेलीसेस झिल्लीपासून सुरू होतात आणि साइटोप्लाझममध्ये प्रक्षेपित होतात. सिस्टीन क्रॉसलिंकिंग विश्लेषणावर आधारित, हा अभ्यास प्रस्तावित करतो की Hv1 VSDs S4 विभागासह एकमेकांशी संपर्क साधतात. तथापि, इतर अभ्यासांनी VSDs दरम्यान पर्यायी इंटरफेस प्रस्तावित केले आहेत. या इंटरफेसमध्ये S1 विभाग 17, 21, 26 आणि S2 खंड 21 च्या बाह्य टोकांचा समावेश आहे. विरोधाचे संभाव्य कारण या अभ्यासांचे परिणाम असे आहेत की गेटिंग प्रक्रियेच्या संबंधात व्हीएसडीमधील ॲलोस्टेरिक कपलिंगची तपासणी केली गेली, जी बंद आणि खुल्या स्थितींवर अवलंबून असते आणि व्हीएसडीमधील इंटरफेस वेगवेगळ्या स्थितीतील बदलांमध्ये बदलू शकतात. येथे, आम्हाला आढळले की 2-ग्वानिडिनोथियाझोल Hv1 चॅनेलला दोन ओपन व्हीएसडीला सिनेर्जिस्टली बंधनकारक करून प्रतिबंधित करते आणि खुल्या अवस्थेतील सबयुनिट्समधील परस्परसंवाद तपासण्यासाठी 2-ग्वानिडिनोबेन्झोथियाझोल (जीबीटीए) या संयुगांपैकी एक वापरले. इंटरफेस.आम्हाला आढळले की GBTA बंधनकारक वक्र परिमाणात्मक मॉडेलद्वारे चांगले वर्णन केले जाऊ शकते ज्यामध्ये एका सबयुनिटला अवरोधक बांधल्याने समीप सबयुनिटच्या बंधनकारक आत्मीयतेमध्ये वाढ होते. आम्हाला असेही आढळले की अवशेष D112, निवडक फिल्टर चॅनेल 27, 28 आणि ग्वानिडाइन डेरिव्हेटिव्ह बाइंडिंग साइटचा भाग 29 GBTA बंधनकारक सहकारिता नियंत्रित करते. आम्ही दाखवतो की सहकारी बंधन Hv1 डायमरमध्ये राखले जाते, जेथे CCD S4 विभागापासून वेगळे होते, हे सूचित करते की CCD मधील इंटरसब्युनिट इंटरफेस थेट होत नाही. जीबीटीए-बाइंडिंग साइट्स दरम्यान ॲलोस्टेरिक कपलिंग मध्यस्थी करा. याउलट, आम्हाला आढळले की S1 तुकडा हा सबयुनिट्समधील इंटरफेसचा भाग आहे आणि अनुमती देण्यासाठी डायमरच्या मध्यभागी असलेल्या S4 हेलिक्सच्या बाह्य टोकासह समीप व्हीएसडीची व्यवस्था प्रस्तावित करतो. S1 तुकडा खुल्या स्थितीत असेल. Hv1 चे छोटे रेणू इनहिबिटर कॅन्सरविरोधी औषधे आणि न्यूरोप्रोटेक्टिव्ह एजंट म्हणून उपयुक्त आहेत. तथापि, आजपर्यंत, काही संयुगे चॅनेल 30,31,32,33 प्रतिबंधित करण्यास सक्षम आहेत. त्यापैकी, 2-ग्वानिडिनोबेन्झिमिडाझोल (2GBI, कंपाऊंड [1] चित्रात आहे. 1a) आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह चॅनेलद्वारे प्रोटॉनचे व्हीएसडी29,32 प्रवेश अवरोधित करणारे आढळले. अशा संयुगांचे बंधन दोन खुल्या उपयुनिट्समध्ये स्वतंत्रपणे होते असे मानले जाते. 2-ग्वानिडिनोबेन्झोथियाझोल (GBTA, संयुग [2] आकृती 1a मध्ये) यापूर्वी 200 μM (आकृती 1b) च्या एकाग्रतेवर चाचणी केली असता Hv1 2GBI प्रमाणे प्रभावीपणे प्रतिबंधित केल्याचे दर्शविले आहे.आम्ही इतर थियाझोल डेरिव्हेटिव्ह्ज तपासले आणि आढळले की त्यांच्यापैकी काहींनी GBTA (चित्र 1 आणि पूरक) पेक्षा समान किंवा जास्त सामर्थ्य असलेल्या चॅनेलला प्रतिबंधित केले. मजकूर).आम्ही चार थियाझोल डेरिव्हेटिव्ह्ज (GBTA आणि संयुगे [3], [6] आणि [11], Fig. 1c) च्या एकाग्रता प्रतिसाद वक्र निर्धारित केले आणि आढळले की ते 2GBI पेक्षा जास्त आहेत. हिल गुणांक (h) थियाझोल डेरिव्हेटिव्ह्जची श्रेणी 1.109 ± 0.040 ते 1.306 ± 0.033 (चित्र. 1c आणि पूरक अंजीर 1). याउलट, 2GBI साठी हिल गुणांक 0.975 ± 0.024 29, अंजीर 2a आणि पूरक आकृती 1 होता. 1 वरील हिल गुणांक बंधनकारक सहकारिता दर्शवतो. कारण प्रत्येकाची स्वतःची Hv1 उप-अनबिट आहे. binding site,29,32 आम्ही असा तर्क केला की थियाझोल डेरिव्हेटिव्हचे एका सबयुनिटला बंधनकारक दुस-या इनहिबिटर रेणूचे समीप सबयुनिटला बंधनकारक वाढवू शकते. GBTA हे सर्वोच्च हिल गुणांक असलेले चाचणी कंपाऊंड होते. म्हणून, आम्ही हे कंपाऊंड निवडले बंधनकारक समन्वयाच्या यंत्रणेचा पुढील अभ्यास केला आणि संदर्भ नकारात्मक नियंत्रण म्हणून 2GBI चा वापर केला. (a) चाचणी संयुगे: [1] संदर्भ Hv1 इनहिबिटर 2-ग्वानिडिनो-बेंझिमिडाझोल (2GBI).[2] 2-ग्वानिडिनो-बेंझोथियाझोल (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -ग्वानिडाइन, [५](४-मिथाइल-१,३-थियाझोल-२-एल)ग्वानिडाइन, [६](५-ब्रोमो-४-मिथाइल-१,३-थियाझोल- २-एल)ग्वानिडाइन, [७] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-गुआनिडिनो-4-मिथाइल-1,3-थियाझोल-5-yl)इथिल एसीटेट, [11]1-[4-(4 -क्लोरोफेनिल)-1,3-थियाझोल-2-yl]ग्वानिडाइन, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) सूचित ग्वानिडिनोथियाझोल आणि संदर्भ कंपाऊंड 2GBI (निळ्या-हिरव्या पट्ट्या) द्वारे मानवी Hv1 क्रियाकलाप रोखणे. .Hv1 प्रोटॉन प्रवाह -80 mV ते +120 mV च्या होल्डिंग क्षमतेच्या विध्रुवीकरणाच्या प्रतिसादात Xenopus oocytes च्या आतील-बाहेरच्या प्लेक्समध्ये मोजले गेले. प्रत्येक अवरोधक 200 μM.pHi = pHo = 6.0 च्या एकाग्रतेने बाथमध्ये जोडला गेला. .डेटा म्हणजे ±SEM (n≥4).(c) संयुगे [2], [3], [6] आणि [11] यौगिकांद्वारे मानवी Hv1 चे एकाग्रता-आश्रित प्रतिबंध. प्रत्येक बिंदू ± SD च्या 3 च्या सरासरी अवरोधाचे प्रतिनिधित्व करतो. 15 मोजमाप करण्यासाठी. रेषा ही एक हिल फिट आहे जी पूरक तक्ता 1 मध्ये नोंदवलेली स्पष्ट Kd मूल्ये मिळविण्यासाठी वापरली जाते. हिल गुणांक पूरक आकृती 1 मध्ये नोंदवलेल्या फिट्सवरून निर्धारित केले गेले होते. h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (पद्धती पहा). (a,b) संयुगे 2GBI आणि GBTA एकाग्रता-आश्रित पद्धतीने डायमेरिक आणि मोनोमेरिक Hv1 प्रतिबंधित करतात. प्रत्येक बिंदू 3 ते 8 मोजमापांचा सरासरी अवरोध ± SD दर्शवतो आणि वक्र हिल फिट आहे. हिल गुणांक (h) मध्ये दर्शविलेले आहे पूरक अंजीर 3 आणि 4 मध्ये नोंदवलेल्या फिट्सवरून इनसेट हिस्टोग्राम निर्धारित केले गेले. (a) मध्ये दर्शविलेल्या GBTA चा एकाग्रता प्रतिसाद अंजीर 1c मध्ये दर्शविल्याप्रमाणेच आहे. उघड Kd मूल्यांसाठी पूरक तक्ता 1 पहा. (c) चे मॉडेलिंग GBTA चे dimeric Hv1 चे सहकारी बंधन. घन काळी रेषा प्रायोगिक डेटाला समीकरण (6) द्वारे फिट दर्शवते, जी (d) मध्ये दर्शविलेल्या बंधनकारक मॉडेलचे वर्णन करते. सब 1 आणि सब 2 लेबल केलेल्या डॅश रेषा द्विमोलेक्युलर असोसिएशनचे प्रतिनिधित्व करतात. -अनुक्रमे पहिल्या आणि दुसऱ्या बंधनकारक घटनांचे विघटन समतोल वक्र (उप 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; उप 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Hv1 ब्लॉकच्या प्रस्तावित यंत्रणेचे योजनाबद्ध आकृती. GBTA च्या बाबतीत, एका खुल्या सबयुनिटला बंधनकारक केल्याने समीप असलेल्या ओपन सबयुनिटची (Kd2 0.05) घट आढळून आली आहे, असे सुचविते की ती राखण्यात भूमिका असूनही दोन सबयुनिट्स एकत्र महत्वाचे आहेत, परंतु CCD थेट GBTA बंधनकारक साइट्स दरम्यान इंटरस्युब्युनिट ॲलोस्टेरिक कपलिंगमध्ये मध्यस्थी करत नाही. (a) सायटोप्लाज्मिक कॉइल्ड-कॉइल डोमेन (निळा बाण) द्वारे मध्यस्थी केलेल्या इंटरस्युब्युनिट कपलिंगमध्ये व्यत्यय आणण्यासाठी डिझाइन केलेले S4 च्या आतील बाजूस ट्रायग्लिसीन उत्परिवर्तनासह Hv1 डायमरचे योजनाबद्ध आकृती (b) Hv1 डायमर आणि लिगेशन डायमरचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व उपयुनिट (निळे बाण) मधील कपलिंगमध्ये गुंतलेल्या S1 तुकड्यांची चाचणी करण्यासाठी डिझाइन केलेले संकेतित उत्परिवर्तन.(c–h) 2GBI (निळसर) आणि GBTA (गडद लाल) एकाग्रता-आश्रित पद्धतीने सूचित रचनांना प्रतिबंधित करतात. प्रत्येक बिंदू सरासरी प्रतिबंध दर्शवतो. ± SD 3 ते 10 मोजमाप. स्पष्ट Kd मूल्ये प्राप्त करण्यासाठी वक्र एक हिल फिट होता (पूरक तक्ता 1 पहा). इंटरपोलेटेड हिस्टोग्राममधील हिल गुणांक पद्धती विभागात वर्णन केल्याप्रमाणे निर्धारित केले गेले होते (पूरक अंजीर 3 आणि 4 पहा). साठी संदर्भ h मूल्ये Hv1 WT डॅश केलेल्या रेषा म्हणून दर्शविल्या जातात. एस्टेरिस्क उत्परिवर्ती आणि WT परिच्छेदांमधील सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (p 0.05, Fig 5d) च्या तुलनेत कोणत्याही इनहिबिटरच्या हिल गुणांकात लक्षणीय बदल केला नाही. ). दुसरीकडे, उत्परिवर्तन D123A ने GBTA (p 0.05/14). दोन्ही सबयुनिट्सवरील 123 स्थानावर शुल्क तटस्थ केल्यामुळे GBTA बंधनकारक सहकारीतेमध्ये मजबूत बदल झाला, दोन्ही सबयुनिटवरील शुल्क उलट केल्याने फक्त थोडासा परिणाम झाला, आम्ही चार्जच्या उलथापालथ चॅनेलसह फक्त एक सबयुनिट समाविष्ट करण्यासाठी विश्लेषण वाढवले. C-टर्मिनल सबयुनिट (Fig. 5b) मध्ये D123R प्रतिस्थापनासह Hv1-लिंक केलेले डायमर व्युत्पन्न केले आणि GBTA आणि 2GBI द्वारे एकाग्रता-प्रतिसाद प्रतिबंधाचे मोजमाप केले. आम्हाला आढळले की GBTA चा हिल गुणांक WT-D123R चॅनेलपेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होता. वाइल्ड-प्रकार Hv1 (p 0.05). आम्हाला असेही आढळून आले की βME च्या अनुपस्थितीत, D112E I127C Hv1 dimer ला GBTA बंधनकारक असलेले हिल गुणांक कमी करणारे घटक (Fig. 6e आणि पूरक Fig. 4) च्या उपस्थितीत मोजल्या गेलेल्या पेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होते, हे सूचित करते की D112E उत्परिवर्तन सिस्टीन 127 च्या क्रॉस-लिंकिंगमुळे GBTA बंधनकारक सहकारिता वाढ रद्द केली नाही. D112E, I127C Hv1 dimers ला 2GBI बंधनकारक असलेले हिल गुणांक देखील D112E उत्परिवर्तनाने (आकृती 1) 6d आणि सप्लीमेंटने लक्षणीयरित्या प्रभावित झाले नाही. अंजीर 3). एकत्रितपणे, हे निष्कर्ष सूचित करतात की आकर्षक इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाद्वारे किंवा प्रतिस्थापित सिस्टीनमधील सहसंयोजक बंधांच्या निर्मितीद्वारे समीप Hv1 उपघटकांमधील S1 तुकड्यांच्या बाह्य टोकांमधील परस्परसंवादाद्वारे GBTA बंधनकारक वाढविले जाते आणि साइट्समधील ॲलोस्टेरिक जोडणी वाढते आणि परिणामी सहकारिता बंधनकारक होते. सहकारितावरील आकर्षक इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाचा प्रभाव उत्परिवर्तन D112E द्वारे रद्द केला जाऊ शकतो, सहसंयोजक बंधांचा प्रभाव नाही. ग्वानिडाइन डेरिव्हेटिव्ह्ज Hv1 चॅनेलवर बंधनकारक करण्यासाठी उपलब्ध असलेल्या रासायनिक जागेच्या आमच्या शोधात, आम्हाला आढळले की GBTA सारख्या 2-guanidinothiazoles मध्ये 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c) पेक्षा जास्त एकाग्रता अवलंबित्व आहे .जीबीटीए दोन्ही डायबिनिकचे हिल गुणांक विश्लेषण. आणि मोनोमेरिक चॅनेल (Fig. 2a,b) आणि डायमेरिक चॅनेल ज्यामध्ये एक सबयुनिट इनहिबिटरशी पूर्व-बांधलेला होता (चित्र 4) यामुळे आम्हाला असा निष्कर्ष काढता आला की GBTA द्वारे Hv1 चे प्रतिबंध ही क्रिया एक समन्वयात्मक प्रक्रिया आहे आणि दोन उपयुनिट्समधील संयुगांची बंधनकारक स्थळे ॲलोस्टरिकली जोडलेली आहेत. जीबीटीए ओपन चॅनेलला जोडते असा शोध, आधी संबंधित कंपाऊंड 2GBI32 साठी दर्शविल्याप्रमाणे, असे सूचित करतो की ॲलोस्टेरिक कपलिंगचे मूल्यांकन खुल्या स्थितीत केले जाऊ शकते. आमचे सहकारी बंधनकारक मॉडेल जीबीटीए (अंजीर. 2 सी) द्वारे एचव्ही 1 च्या प्रतिबंधाचे परिमाणात्मक वर्णन करण्यास सक्षम होते आणि झिल्लीच्या पुनरुज्जीवनानंतर चॅनेल शेपटीच्या प्रवाहाच्या क्षय वर 2 जीबीआय आणि जीबीटीएचे भिन्न प्रभाव स्पष्ट करतात, जे बंधनकारक प्रक्रियेच्या आमच्या स्पष्टीकरणास समर्थन देते. दोन बंधनकारक साइट (जसे की एचव्ही 1) असलेल्या os लोस्टेरिक प्रोटीनमध्ये साध्य करता येणारी कमाल हिल गुणांक 2. आम्ही एचव्ही 1 वाइल्ड-टाइपला 1.31 च्या गुणांकसह बांधण्यासाठी जीबीटीए मोजले आहे, जे एचव्ही 1 आय 127 सी मध्ये 1.88 पर्यंत वाढले आहे. समन्वयवादी मुक्त उर्जा, सर्वात कमी आणि सर्वोच्च आत्मीयतेच्या साइट्सच्या बंधनकारक मुक्त उर्जेमधील फरक (पद्धती पहा), एचव्ही 1 वाइल्ड-प्रकार आणि 2.7 किलोकॅलरी/तीळ एचव्ही 1 आय 127 सी च्या बाबतीत 1.3 किलो केसीएल/तीळ होती. बंधनकारक हिमोग्लोबिन ते ऑक्सिजनचे सहयोगी प्रक्रिया 38 चे सर्वात प्रसिद्ध आणि चांगले-अभ्यासाचे उदाहरण आहे. मानवी हिमोग्लोबिनसाठी (चार अ‍ॅलोस्टिकली जोडलेल्या बंधनकारक साइट्ससह टेट्रॅमर), डोंगर गुणांक 2.5-3.0 पर्यंतचे आहे, ज्याची मूल्ये 1.26 ते 3.64 पर्यंत आहेत. केसीएल/मोल, प्रायोगिक अटींवर अवलंबून 38. जागतिक ऊर्जावानांच्या दृष्टीने, एचव्ही 1 ला जीबीटीए बंधनकारकतेची सहकार्य दोन सिस्टममधील प्रोटीन सब्यूनिट्सच्या वेगवेगळ्या संख्येचा विचार केला जातो तेव्हा एचव्ही 1 ला ओ 2 बंधनकारकपेक्षा भिन्न नाही. आमच्या सिनर्जी मॉडेलमध्ये, जीबीटीए रेणूंच्या एका सब्यूनिटला बंधनकारक परिणामी समीप सब्यूनिटच्या बंधनकारक आत्मीयतेत वाढ होते. आम्ही अशा प्रक्रियेची कल्पना करतो ज्यामध्ये पहिल्या बंधनकारक घटनेमुळे (प्रेरित फिट) परिणामी बंधनकारक वातावरणाची पुनर्रचना होते. सब्यूनिट्स दरम्यानच्या परस्परसंवादामध्ये बदल. या बदलांच्या प्रतिसादामध्ये, समीप सब्यूनिट्स त्यांच्या बंधनकारक साइट्स बदलतात, परिणामी जीबीटीए बंधनकारक होते. या प्रक्रियेनुसार, एस 1 एस्पार्टेट डी 112 वाढीव बंधनकारक आत्मीयतेशी संबंधित बंधनकारक साइटच्या पुनर्रचनासाठी जबाबदार आहे. डी 112 यापूर्वी एचव्ही 1 प्रोटॉन परमिशन मार्गाचा भाग असल्याचे दर्शविले गेले होते आणि सिलेक्टिव्हिटी फिल्टर 27,28 म्हणून कार्य करण्यासाठी. आमचे परिणाम दर्शविते की दोन एचव्ही 1 सब्यूनिट्समधील सिलेक्टिव्हिटी फिल्टर्स ओपन स्टेटमध्ये अलोस्टिकली जोडल्या जातात. फिगर 7 ए जीबीटीए बंधनकारक साइटचे अंदाजे स्थान आणि एचव्ही 1 व्हीएसडी आधारित डी 112, डी 123, के 125 आणि आय 127 चे स्थान दर्शविते. एचव्ही 1-सीआयव्हीएसपी चाइमेराच्या क्रिस्टल स्ट्रक्चरवर. एस 1 च्या बाह्य सेल्युलर एंडसह अ‍ॅलोस्टेरिक कपलिंगसाठी सुशिक्षित दिशानिर्देश काळ्या बाणांसह दर्शविले आहेत. आणि बाउंड जीबीटीएची भविष्यवाणी केलेली स्थाने राखाडी अंडाकृती म्हणून दर्शविली आहेत. ब्लॅक बाण दोन जवळच्या सब्यूनिट्समधील बंधनकारक साइट्स दरम्यान अ‍ॅलोस्टेरिक जोड्यात गुंतलेले मार्ग दर्शवितात. तपास केलेल्या एस 1 अवशेषांची स्थिती रंगीत गोलाकारांनी चिन्हांकित केली आहे. पडद्याच्या विमानाच्या बाहेरील बाजूने पाहिल्याप्रमाणे दोन भिन्न डायमर कॉन्फिगरेशनमध्ये. डाव्या पॅनेलवर, डायमर इंटरफेस एस 4 हेलिक्सद्वारे तयार केला जातो. दोन व्हीएसडी 20 डिग्रीच्या घड्याळाच्या दिशेने झिल्लीच्या विमानाच्या लंब. दोन एस 4 हेलिकल्स (डॅशड बाण) च्या बाह्य टोकांचे पृथक्करण, उजवीकडे दर्शविलेली व्यवस्था तयार करते. या कॉन्फिगरेशनमध्ये, समीप सब्यूनिट्समधून डी 123 आणि आय 127 चे अवशेष एकत्र येण्याची परवानगी आहे. (सी) सीआयव्हीएसपी व्हीएसडीचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 4 जी 80 क्रिस्टल स्ट्रक्चरमध्ये आढळलेल्या डायमर कॉन्फिगरेशनमध्ये. सीआयव्हीएसपी मधील पी 140 एचव्ही 1 मधील डी 123 स्थितीशी संबंधित आहे. आमचे परिणाम दर्शविते की अवशेष १२3 (१२3 डी/१२3 डी किंवा १२3 आर/१२3 आर) दरम्यानचे प्रतिकूल इलेक्ट्रोस्टेटिक संवाद खुल्या स्थितीत जीबीटीए-बाइंडिंग सहकार्याच्या "सामान्य" पातळीशी संबंधित आहे आणि विकृतीपासून ते आकर्षित करण्यासाठी (123 डी/123 आर) पर्यंतचा संवाद बदलतो (123 डी/123 आर) . स्पष्टीकरण असे आहे की हायड्रोफिलिक वातावरणात हायड्रोफोबिक अवशेष ठेवण्याचा अस्थिरता प्रभाव डी 123 अवशेषांमधील प्रतिकूल संवादांच्या निर्मूलनामुळे स्थिर परिणामापेक्षा जास्त असू शकतो, परिणामी बंधनकारक सहकार्यात एकूणच घट झाली आहे. सीओना गुटिस सीआय-एचव्ही 1 ची स्थिती डी 171 (मानवी एचव्ही 1 मधील डी 123 शी संबंधित) सक्रियतेनंतर वाढविली जाते, ज्यामुळे डी 123 मुक्त स्थितीत हायड्रोफिलिक वातावरणात स्थित आहे या कल्पनेचे समर्थन करते. एचव्ही 1 चॅनेलचे गेटिंग एकाधिक संक्रमणांद्वारे उद्भवते. , त्यानंतर एक वेगळा संक्रमण ज्यामुळे प्रोटॉन दोन्ही सब्यूनिट्स मार्गात ओपनिंग करण्यास कारणीभूत ठरतात. व्होल्टेज सेन्सरच्या रचनात्मक बदलाचे व्होल्टेज-क्लॅम्प फ्लूरोसेंसद्वारे परीक्षण केले गेले आणि असे आढळले की दुसरे संक्रमण निवडकपणे डी 171 च्या स्थितीत उत्परिवर्तनाने गोंधळलेले होते. फ्लोरोसेंट सिग्नलची छेडछाड रचनात्मक बदलाच्या प्रतिक्रियेच्या समन्वयांच्या बाजूने जवळच्या सब्यूनिट्सच्या डी 171 अवशेषांमधील इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाच्या उपस्थितीशी सुसंगत आहे. हे स्पष्टीकरण आमच्या शोधण्याशी सुसंगत आहे की डी 123 अवशेष इलेक्ट्रोस्टेटिकली मुक्त स्थितीत संवाद साधतात. आणि जीबीटीए बंधनकारक साइट्स दरम्यान os लोस्टेरिक कपलिंगमध्ये मध्यस्थी करते. फुजीवारा एट अल 25 ने असा प्रस्ताव दिला की साइटोप्लाझमिक कॉइलड-कॉइल डोमेनचा डायमर इंटरफेस झिल्लीमध्ये दोन एस 4 हेलिकल्स (चित्र. 7 बी, डावा पॅनेल) समाविष्ट करते. एस 4 हेलिक्स आणि सीसीडीला जोडणार्‍या प्रदेशाचे संपूर्ण व्हीएसडी आणि कार्यात्मक विश्लेषण. ट्रान्समेम्ब्रेन पीएच ग्रेडियंटच्या अनुपस्थितीत, एचव्ही 1 चॅनेलला उघडण्यासाठी सिंहाचा झिल्लीचे अवनती आवश्यक असते आणि सिस्टीन क्रॉसलिंकिंग अशा परिस्थितीत उद्भवते जेथे चॅनेल प्रामुख्याने बंद आहे. म्हणूनच, आढळलेला एस 4-एस 4 इंटरफेस कदाचित ऑफ-स्टेट सब्यूनिट कॉन्फिगरेशन प्रतिबिंबित करतो. इतर अभ्यासानुसार गेटिंग 17,21,26 दरम्यान इंटरसब्यूनिट परस्परसंवादामध्ये एस 1 आणि एस 2 च्या सहभागाचा पुरावा सापडला आहे की चॅनेल ओपन आणि ओपनमध्ये भिन्न सब्यूनिट कॉन्फिगरेशन स्वीकारू शकतात बंद राज्ये, मनी एट अलच्या निष्कर्षांशी सुसंगत कल्पना. एस 1 गेटिंग दरम्यान 39 हलवते. येथे, आम्ही दर्शवितो की, खुल्या स्थितीत, एस 1 हेलिक्सच्या बाह्य टोकांमध्ये थेट इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाचे समर्थन करण्यासाठी पुरेसे आहे जे सब्यूनिट्स दरम्यान अ‍ॅलोस्टेरिक कपलिंगमध्ये मध्यस्थी करते. विस्तारित एस 4-एस 4 परस्परसंवादासह डायमर कॉन्फिगरेशनमध्ये, एस 1 हेलिस खूप दूर आहेत. एकमेकांव्यतिरिक्त थेट संवाद साधण्यासाठी. तथापि, दोन एस 4 हेलिकल्सच्या बाह्य टोकांच्या विभक्ततेसह, झिल्लीच्या विमानाच्या लंबवत असलेल्या दोन व्हीएसडी सब्यूनिट्सचे 20 ° घड्याळाच्या दिशेने फिरणे, एस 1-एस 1 कॉन्फिगरेशन सुसंगत प्राप्त झाले. आमच्या निष्कर्षांसह (अंजीर. 7 बी, उजवे पॅनेल) .आपल ओपन स्टेटमधील चॅनेलसाठी या कॉन्फिगरेशनची शिफारस करतो. जरी सीआयव्हीएसपी एंजाइम मोनोमर म्हणून कार्य करते असे मानले जाते, परंतु त्याच्या वेगळ्या व्हीएसडीची क्रिस्टल स्ट्रक्चर एका डायमर अवस्थेत हस्तगत केली जाते. या डायमरमधील एस 1 हेलिकल्सचे बाह्य टोक स्थानिकपणे जवळ असतात आणि एकूणच कॉन्फिगरेशन प्रस्तावित प्रमाणेच आहे एचव्ही 1 (अंजीर. 7 सी) साठी. सीआयव्हीएसपी डायमरमध्ये, जवळच्या सब्यूनिटमधील सर्वात जवळचे अवशेष प्रोलिन होते 140 (चित्र 7 सी). आणि सीआयव्हीएसपी डायमर सूचित करतात की या प्रोटीनच्या व्हीएसडीमध्ये इंटरफेस तयार करण्याची आंतरिक प्रवृत्ती असते जिथे एस 1 च्या एक्स्ट्रासेल्युलर टोकांचा संवाद असतो. शुक्राणूंच्या सेल एक्टिवेशनमध्ये एचव्ही 1 ची आवश्यक भूमिका या चॅनेलला पुरुष प्रजननक्षमतेच्या नियंत्रणासाठी एक आकर्षक औषध लक्ष्य बनवते. फुर्थर्मोर, मायक्रोग्लियामध्ये एचव्ही 1 ची सक्रियता इस्केमिक स्ट्रोकमधून पुनर्प्राप्ती खराब करते. स्तन 12 किंवा कोलोरेक्टल कर्करोग असलेल्या रूग्णांमध्ये अस्तित्व आणि बी-सेल विकृती 11 मध्ये योगदान देण्याचे मानले जाते. म्हणूनच, एचव्ही 1 ला लक्ष्य करणारी लहान रेणू औषधे न्यूरोप्रोटेक्टिव्ह एजंट्स किंवा अँटीकँसर थेरपीटिक्स म्हणून वापरली जाऊ शकतात. हा शोध असा आहे की गुआनिडिनोथिझोल डेरिव्हेटिव्ह्ज कॉन्फॉर्मेशनल रीरेंजमेंट्सला उत्तेजन देऊ शकतात. ओपन एचव्ही 1 सब्यूनिट, ज्यामुळे बंधनकारक आत्मीयता वाढते, यामुळे एचव्ही 1 चॅनेलला लक्ष्य करणार्‍या अधिक सामर्थ्यवान औषधांचा विकास होऊ शकतो. मानव एचव्ही 1 चे साइट-निर्देशित म्यूटेजेनेसिस मानक पीसीआर तंत्राचा वापर करून केले गेले. एचव्ही 1 एनसीसीआयएसपी कन्स्ट्रक्शनमध्ये, एचव्ही 1 च्या अवशेष 1-96 आणि 228-273 ची जागा सीआयव्हीएसपी 18 च्या अवशेष 1-113 आणि 240-576 ने बदलली. एका सब्यूनिटचा सी-टर्मिनस जीजीएसजीजीजीजीएसजीजीएसजीजीजीजीजीजी लिंकरद्वारे दुसर्‍या सब्यूनिटच्या एन-टर्मिनसशी जोडला गेला आहे. विविध कन्स्ट्रक्शन्स असलेले पीजीईएमएचई प्लाझ्मिड्स एनएचई 1 किंवा एसपीएच 1 निर्बंध एंजाइम (न्यू इंग्लंड बायोलाब्स) सह रेखीय केले गेले (न्यू इंग्लंड बायोलाब) टी 7 एममेसेज एममॅचिन ट्रान्सक्रिप्शन किट (अँबियन) .1-3 दिवस आधी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मोजमापाच्या, सीआरएनएला झेनोपस ओयोसाइट्स (प्रति सेल 50 एनएल, 0.3-1.5 μg/μl) मध्ये इंजेक्शन दिले गेले. इकोसाइट बायो सायन्स.फोलॉव्हिंग आरएनए इंजेक्शनपासून, एनडी 96 मध्यम मध्ये 96 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम केसीएल, 1.8 एमएम सीएसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल, 10 एमएम हेप्स, 5 एमएम पायरुवेट, 100 μg/एमएल हेंटॅमिकिन, पीएच 7.2 18 ° से. . 2-गुआनिडिनो-बेंझिमिडाझोल [1], 2-ग्वानिडिनो-बेंझोथियाझोल [2], (4-मिथाइल -1,3-थियाझोल-2-येल) ग्वानिडाइन [5], (5-ब्रोमो -4-मिथाइल -1,3 -थियाझोल -2-येल) ग्वानिडाइन) []], इथिल 2-ग्युनिडिनो -5-मिथाइल -1,3-थियाझोल -4-कार्बोक्लेट [8], इथिल 2-गॅनिडिनो -4- मिथाइल -1,3-थियाझोल- 5-कार्बोक्लेट [9] आणि (2-ग्वेनिडिनो -4-मिथाइल -1,3-थियाझोल -5 -एल) इथिल एसीटेट [10] सिग्मा- ld ल्ड्रिच.फॅमोटिडाइन []] चे होते. -(4-क्लोरोफेनिल) -1,3-थियाझोल-2-येल] ग्वानिडाइन [11] आणि 1- [4- (3,4-डायमेथॉक्सिफेनिल) -1,3- थियाझोल-2 -एल] ग्वानिडाइन [12] होते मॅट्रिक्स सायंटिफिक पासून. हे संयुगे व्यावसायिकदृष्ट्या उपलब्ध आहेत. ते कोरड्या डीएमएसओमध्ये 100 मिमी स्टॉक सोल्यूशन तयार करण्यासाठी विरघळले गेले होते, जे नंतर इच्छित अंतिम एकाग्रता.पाऊंड 3 आणि 4 वर रेकॉर्डिंग सोल्यूशनमध्ये पातळ केले गेले. कमीतकमी 99% शुद्धता. 2-अमीनो -4- (ट्रायफ्लोरोमेथिल) बेंझेनेथिओल हायड्रोक्लोराईड (1.02 ग्रॅम, 4.5 मिमीोल) च्या निलंबनास 25 मिलीलीटर जलीय हायड्रोक्लोरिक acid सिड (2.5 एन) मध्ये घन डायसिअनामाइड (380 मिलीग्राम, 4.5 मिमीोल) जोडले गेले आणि परिणामी हेटरोगेनियस मिक्स Hours तास जोमदार ढवळत होते. प्रतिक्रिया मिश्रण खोलीच्या तपमानावर थंड केले गेले आणि 10 एन पोटॅशियम हायड्रॉक्साईडच्या हळूहळू जोडल्यामुळे तटस्थ केले गेले. पांढरे वर्षाव तयार केले गेले, थंड पाण्याने (3 × 50 मिली) धुऊन, ओव्हनमध्ये वाळवले (3 × 50 मिली) 65 डिग्री सेल्सियस) कित्येक तास, आणि नंतर पांढरा घन (500 मिलीग्राम, 48 %) देण्यासाठी इथिल एसीटेट/पेट्रोलियम इथरमधून पुन्हा स्थापित केले; एमपी 221–222 डिग्री सेल्सियस (प्रकाश 225–226 डिग्री सेल्सियस) 45; 1 एच एनएमआर (500 मेगाहर्ट्झ, डीएमएसओ-डी 6): Δ [पीपीएम] = 7.25 (खूप ब्रॉड एस, 4 एच), 7.40 (डी, 1 एच, जे = 8.1 हर्ट्ज), 73.7373 (एस, १ एच), 7.92 (डी . = 272 हर्ट्ज), 126.1 (क्यू, जे = 272 हर्ट्ज) = 31.6 हर्ट्ज), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): एम/झेड कॅल्क्युलेटेड मूल्य. : 261.0419. नॅफथो [१,२-डी] थियाझोल-२-अमिन (mg०० मिलीग्राम, १. mm मिमीोल), पूर्वी वर्णन केल्यानुसार संश्लेषित, लहान चाचणी ट्यूबमध्ये तेल बाथमध्ये 200 डिग्री सेल्सियस पर्यंत गरम केले गेले. १.० मि.ली. कॉंक. गरम कंपाऊंडला हायड्रोक्लोरिक acid सिड वेगाने जोडले गेले आणि मिश्रण तेलाच्या बाथमध्ये सुमारे २ मिनिटे ठेवण्यात आले, त्या काळात बहुतेक पाण्याचे बाष्पीभवन झाले. प्रतिक्रियेचे मिश्रण नंतर खोलीच्या तपमानावर थंड केले गेले आणि परिणामी दृढ सामग्री फिकट गुलाबी पिवळ्या रंगाचे अनाकार घन प्रदान करण्यासाठी लहान तुकडे केले आणि पाण्याने धुतले. (38 मिलीग्राम, 10%) एमपी 246-250 डिग्री सेल्सियस; 1 एच एनएमआर (500 मेगाहर्ट्झ, डीएमएसओ-डी 6, डी 2 ओ): Δ [पीपीएम] = 7.59 (टी, 1 एच, जे = 8.2 हर्ट्ज), 7.66 (टी, 1 एच, जे = 8.3 हर्ट्ज), 7777 (डी, 1 एच) . मेगाहर्ट्झ, डीएमएसओ-डी 6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): एम/झेड. , सापडला: 243.0704. पीसीएलएएमपी 10 सॉफ्टवेअरसह अ‍ॅक्सॉन डिजीडाटा 1440 ए (आण्विक डिव्हाइस) द्वारे नियंत्रित अ‍ॅक्सोपॅच 200 बी एम्पलीफायरचा वापर करून ओयोसाइट्सच्या अंतर्गत आणि बाह्य पॅचमध्ये प्रोटॉन प्रवाह मोजले गेले. . चहा हायड्रॉक्साईडसह पीएच 6.0. सर्व मोजमाप 22 ± 2 डिग्री सेल्सिअस तापमानात केले गेले. पिपेटचा प्रवेश प्रतिरोधक 1.5-4 एमए. ) आणि मूळ 8.1 (ओरिजिनलॅब). एचव्ही 1 इनहिबिटरची विविध सांद्रता असलेले सोल्यूशन्स आणि काही प्रकरणांमध्ये 10 मिमी β एमई बाथमध्ये गुरुत्वाकर्षणाने व्हीसी -6 परफ्यूजन वाल्व्ह सिस्टम (वॉर्नर इन्स्ट.) शी जोडलेल्या मॅनिफोल्डद्वारे ओळखले गेले, जे पीसीएलएएमपी सॉफ्टवेअर टीटीएल (ट्रान्झिस्टर- ट्रान्झिस्टर लॉजिक) सिग्नल.रापिड परफ्यूजन प्रयोग मल्टी-ट्यूब परफ्यूजन पेन्सिल (ऑटोमेट साय.) वापरुन केले गेले. यापूर्वी वर्णन केल्यानुसार +120 एमव्ही डिपोलायझिंग पल्स.जी.व्ही मोजमाप केले गेले. टेल प्रवाह -20 एमव्ही ते +120 एमव्ही पर्यंत भिन्न व्होल्टेजवर डिप्लोलेरायझेशन चरणानंतर -40 एमव्हीवर नोंदवले गेले. अन्यथा नमूद केल्याशिवाय. चाचणी नाडीच्या आधीचा संदर्भ नाडी आहे सध्याच्या क्षय 18 साठी दुरुस्त करण्यासाठी वापरले जाते. जीव्ही आलेख बोल्टझमॅन समीकरणास अनुकूल आहे: चॅनेल आणि इनहिबिटरच्या वेगवेगळ्या संयोजनांसाठी (पूरक सारणी 1) स्पष्ट पृथक्करण स्थिरता (केडी) निर्धारित केले गेले (म्हणजे %इनहिब व्हॅल्यूज) (म्हणजे %इनहिब व्हॅल्यूज) टेकडीच्या समीकरणासह: जेथे [i] इनहिबिटर I आणि h चे एकाग्रता आहे हिल गुणांक. टेकडी गुणांक मोजण्यासाठी, समीकरण (2) पुन्हा व्यवस्थित केले आहे: