Soal siasat antara muka intersubunit saluran proton Hv1 terbuka dengan probe berganding alosterik

Terima kasih kerana melawati Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan terhad untuk CSS.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau matikan mod keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan tapak tanpa gaya dan JavaScript. Saluran proton berpagar voltan Hv1 ialah kompleks dimerik yang terdiri daripada dua domain pengesan voltan (VSD), setiap satunya mengandungi laluan resapan proton berpagar. Dimerisasi dikawal oleh domain gegelung bergelung sitoplasma. Peralihan daripada keadaan tertutup kepada keadaan terbuka dalam kedua-dua VSD diketahui berlaku secara kooperatif; walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang mekanisme asas. Antara muka intersubunit memainkan peranan penting dalam proses alosterik; walau bagaimanapun, antara muka sedemikian tidak dikenal pasti dalam saluran Hv1 terbuka. Di sini kami menunjukkan bahawa derivatif 2-guanidinothiazole menyekat dua VSD Hv1 secara kooperatif dan menggunakan salah satu sebatian ini sebagai probe untuk gandingan alosterik antara subunit terbuka. Kami mendapati bahawa ekstraselular penghujung serpihan transmembran pertama VSD membentuk antara muka intersubunit yang menjadi pengantara gandingan antara tapak pengikat, manakala domain gegelung bergelung tidak terlibat secara langsung dalam proses ini. Kami juga menemui bukti kukuh bahawa penapis selektif proton saluran mengawal kerjasama pengikat penyekat . Saluran proton berpagar voltan memainkan peranan penting dalam pelbagai organisma, daripada fitoplankton kepada manusia1. Dalam kebanyakan sel, saluran ini mengantara efluks proton daripada membran proton dan mengawal aktiviti NADPH oksidase. Satu-satunya saluran proton berpagar voltan yang diketahui pada manusia ialah Hv1, yang merupakan hasil daripada gen HVCN12,3.Hv1 (aka VSOP) telah ditunjukkan memainkan peranan dalam percambahan sel B4, pengeluaran spesies oksigen reaktif oleh sistem imun semula jadi5,6,7,8, sel sperma motilitas9 dan peraturan pH cecair permukaan saluran udara10. Saluran ini terlibat dalam beberapa Terlebih Tekan dalam jenis kanser seperti keganasan sel B4,11 dan payudara dan kanser kolorektal12,13.Aktiviti Hv1 yang berlebihan didapati meningkatkan potensi metastatik sel kanser 11, 12 .Di dalam otak, Hv1 dinyatakan oleh microglia, dan aktivitinya telah ditunjukkan untuk memburukkan lagi kerosakan otak dalam model strok iskemia. Protein Hv1 mengandungi domain pengesan voltan (VSD), yang terdiri daripada empat segmen transmembran yang dipanggil S1 hingga S414. VSD menyerupai domain sepadan saluran Na+, K+ dan Ca2+ berpagar voltan dan fosfatase sensitif voltan, seperti CiVSP daripada Ciona gutis15.Dalam protein lain ini, terminal-C S4 dilekatkan pada modul efektor, domain liang atau enzim. Dalam Hv1, S4 dikaitkan dengan domain gegelung bergelung (CCD) yang terletak pada bahagian sitoplasma membran .Saluran ialah kompleks dimerik yang terdiri daripada dua VSD, setiap satu mengandungi laluan resapan proton berpagar16,17,18. Kedua-dua subunit Hv1 ini didapati terbuka secara kooperatif19,20,21,22, menunjukkan bahawa gandingan alosterik dan interaksi antara subunit bermain peranan penting dalam proses gating. Antara muka antara subunit dalam domain gegelung bergelung ditakrifkan dengan baik kerana struktur kristal dua domain terpencil tersedia22,23. Sebaliknya, antara muka antara VSD dalam membran tidak difahami dengan baik.Struktur kristal protein chimeric Hv1-CiVSP tidak memberikan maklumat tentang antara muka ini, kerana organisasi trimerik kompleks saluran terhablur mungkin terhasil daripada penggantian CCD Hv1 asli oleh zip leucine yis GCN424. Kajian terbaru mengenai organisasi subunit saluran Hv1 menyimpulkan bahawa dua heliks S4 beralih ke CCD tanpa gangguan teruk pada struktur sekunder, mengakibatkan heliks panjang yang bermula dari membran dan mengunjur ke dalam sitoplasma. Berdasarkan analisis silang silang sistein, kajian ini mencadangkan supaya VSD Hv1 menghubungi satu sama lain di sepanjang segmen S4. Walau bagaimanapun, kajian lain telah mencadangkan antara muka alternatif antara VSD. Antara muka ini termasuk segmen S1 17, 21, 26 dan hujung luar segmen S2 21. Satu sebab yang mungkin untuk konflik hasil kajian ini ialah gandingan alosterik antara VSD telah diperiksa berhubung dengan proses gating, yang bergantung pada keadaan tertutup dan terbuka, dan antara muka antara VSD mungkin berbeza dalam perubahan keadaan yang berbeza dalam konformasi. Di sini, kami mendapati bahawa 2-guanidinothiazole menghalang saluran Hv1 dengan mengikat secara sinergistik kepada dua VSD terbuka, dan menggunakan salah satu sebatian, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), untuk menyiasat interaksi antara subunit dalam keadaan terbuka. antara muka. Kami mendapati bahawa lengkung pengikatan GBTA boleh digambarkan dengan baik oleh model kuantitatif di mana pengikatan perencat kepada satu subunit menghasilkan peningkatan dalam pertalian pengikatan subunit bersebelahan. Kami juga mendapati bahawa sisa D112, penapis selektiviti untuk saluran 27, 28 dan sebahagian daripada tapak pengikatan terbitan guanidine 29 mengawal kerjasama pengikatan GBTA. Kami menunjukkan bahawa pengikatan koperasi dikekalkan dalam dimer Hv1, di mana CCD memisahkan daripada segmen S4, menunjukkan bahawa antara muka intersubunit dalam CCD tidak secara langsung menengahkan gandingan alosterik antara tapak pengikat GBTA. Sebaliknya, kami mendapati bahawa serpihan S1 adalah sebahagian daripada antara muka antara subunit dan mencadangkan susunan VSD bersebelahan dengan hujung ekstraselular heliks S4 jauh dari pusat dimer untuk membolehkan serpihan S1 berada dalam keadaan terbuka. Perencat molekul kecil Hv1 berguna sebagai ubat antikanser dan ejen neuroprotektif. Walau bagaimanapun, sehingga kini, beberapa sebatian telah dapat menghalang saluran30,31,32,33. Antaranya, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, kompaun [1] dalam Rajah .1a) dan derivatifnya didapati menyekat VSD29,32 resapan proton melalui saluran. Pengikatan sebatian tersebut dianggap berlaku secara bebas dalam dua subunit terbuka.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, sebatian [2] dalam Rajah 1a) adalah sebelum ini ditunjukkan untuk menghalang Hv1 hampir sama berkesan dengan 2GBI apabila diuji pada kepekatan 200 μM (Rajah 1b). Kami memeriksa derivatif thiazole lain dan mendapati bahawa sesetengah daripada mereka menghalang saluran dengan potensi yang sama atau lebih besar daripada GBTA (Rajah 1 dan Tambahan). teks). Kami menentukan keluk tindak balas kepekatan empat derivatif tiazol (GBTA dan sebatian [3], [6] dan [11], Rajah 1c) dan mendapati bahawa ia lebih curam daripada 2GBI. Pekali Bukit (h) derivatif thiazole berjulat antara 1.109 ± 0.040 hingga 1.306 ± 0.033 (Rajah 1). 1c dan Rajah Tambahan 1). Sebaliknya, pekali Bukit untuk 2GBI ialah 0.975 ± 0.024 29, Rajah 2a dan Rajah Tambahan 1). Pekali Bukit di atas 1 menunjukkan kerjasama yang mengikat. Kerana setiap subunit Hv1 mempunyai perencat-nya sendiri. tapak pengikatan,29,32 kami memberi alasan bahawa pengikatan derivatif tiazol kepada satu subunit boleh meningkatkan pengikatan molekul perencat kedua kepada subunit bersebelahan. GBTA ialah sebatian ujian dengan pekali Bukit tertinggi. Oleh itu, kami memilih sebatian ini untuk mengkaji lagi mekanisme sinergi yang mengikat dan menggunakan 2GBI sebagai kawalan negatif rujukan. (a) Sebatian ujian: [1] Rujukan perencat Hv1 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)etil asetat, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Perencatan aktiviti Hv1 manusia oleh guanidinothiazoles yang ditunjukkan dan sebatian rujukan 2GBI (bar biru-hijau) .Arus proton Hv1 diukur dalam plak dalaman-keluar oosit Xenopus sebagai tindak balas kepada penyahkutuban daripada potensi pegangan -80 mV hingga +120 mV. Setiap perencat ditambahkan ke dalam tab mandi pada kepekatan 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Data adalah min±SEM (n≥4).(c) Perencatan bergantung kepekatan Hv1 manusia oleh sebatian [2], [3], [6] dan [11].Setiap titik mewakili perencatan min ± SD sebanyak 3 kepada 15 ukuran. Garisan tersebut ialah padanan Bukit yang digunakan untuk mendapatkan nilai Kd yang jelas yang dilaporkan dalam Jadual Tambahan 1. Pekali bukit ditentukan daripada padanan yang dilaporkan dalam Rajah Tambahan 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (lihat Kaedah). (a,b) Sebatian 2GBI dan GBTA menghalang Hv1 dimerik dan monomerik dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Setiap titik mewakili perencatan min ± SD bagi 3 hingga 8 ukuran dan lengkung adalah padanan Bukit. Pekali Bukit (h) ditunjukkan dalam histogram inset ditentukan daripada padanan yang dilaporkan dalam Rajah Tambahan 3 dan 4. Tindak balas kepekatan GBTA yang ditunjukkan dalam (a) adalah sama seperti dalam Rajah 1c. Lihat Jadual Tambahan 1 untuk nilai Kd yang jelas.(c) Pemodelan bagi pengikatan koperasi GBTA kepada dimerik Hv1. Garis hitam pepejal mewakili kesesuaian kepada data eksperimen dengan persamaan (6), yang menerangkan model pengikatan yang ditunjukkan dalam (d). Garis putus-putus berlabel Sub 1 dan Sub 2 mewakili persatuan bimolekul -lengkung keseimbangan pemisahan peristiwa ikatan pertama dan kedua, masing-masing (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Gambarajah skematik mekanisme yang dicadangkan bagi blok Hv1. Dalam kes GBTA, pengikatan kepada satu subunit terbuka meningkatkan pertalian subunit terbuka bersebelahan (Kd2 0.05) dalam pekali Bukit GBTA mengikat saluran GGG berbanding dengan jenis liar (Rajah 5c), menunjukkan bahawa walaupun peranannya dalam mengekalkan dua subunit bersama-sama penting, tetapi CCD tidak secara langsung menjadi pengantara gandingan alosterik antara subunit antara tapak pengikatan GBTA. (a) Gambarajah skematik dimer Hv1 dengan mutasi triglisin pada hujung dalam S4 direka bentuk untuk mengganggu gandingan antara subunit yang dimediasi oleh domain gegelung bergelung sitoplasma (anak panah biru).(b) Perwakilan skematik dimer Hv1 dan dimer ligation dengan mutasi yang ditunjukkan, direka untuk menguji serpihan S1 yang terlibat dalam gandingan antara subunit (anak panah biru).(c–h) 2GBI (cyan) dan GBTA (merah gelap) menghalang binaan yang ditunjukkan dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Setiap titik mewakili perencatan min ± SD 3 hingga 10 ukuran. Lengkung adalah padanan Bukit yang digunakan untuk mendapatkan nilai Kd yang jelas (lihat Jadual Tambahan 1). Pekali bukit dalam histogram interpolasi ditentukan seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah (lihat Rajah Tambahan 3 dan 4). Rujukan nilai h untuk Hv1 WT ditunjukkan sebagai garis putus-putus. Asterisk menunjukkan perbezaan ketara secara statistik antara laluan mutan dan WT (p 0.05, Rajah 5d, i ) ). Sebaliknya, mutasi D123A mengurangkan dengan ketara pekali Bukit GBTA (p 0.05/14). Memandangkan meneutralkan caj pada kedudukan 123 pada kedua-dua subunit mengakibatkan perubahan kukuh dalam kerjasama mengikat GBTA, manakala pembalikan caj pada kedua-dua subunit hanya mempunyai kesan kecil, kami melanjutkan analisis untuk memasukkan hanya satu subunit dengan saluran penyongsangan cas. Kami menjana dimer berkaitan Hv1 dengan penggantian D123R dalam subunit terminal C (Rajah 5b) dan mengukur perencatan tindak balas kepekatan oleh GBTA dan 2GBI. Kami mendapati bahawa pekali Hill GBTA mengikat kepada saluran WT-D123R adalah jauh lebih tinggi daripada itu Hv1 jenis liar (p 0.05). Kami juga mendapati bahawa dengan ketiadaan βME, pekali Bukit GBTA yang mengikat kepada dimer D112E I127C Hv1 adalah jauh lebih tinggi daripada yang diukur dengan kehadiran agen pengurangan (Rajah 6e dan Rajah Tambahan 4), membayangkan bahawa mutasi D112E tidak memansuhkan peningkatan kerjasama mengikat GBTA yang terhasil daripada pemautan silang cysteine ​​​​127. Koefisien Hill 2GBI mengikat kepada D112E, I127C Hv1 dimer juga tidak terjejas dengan ketara oleh mutasi D112E (Rajah 1).6d dan Tambahan. Rajah 3). Diambil bersama, penemuan ini mencadangkan bahawa pengikatan GBTA dipertingkatkan dengan interaksi antara hujung luar serpihan S1 dalam subunit Hv1 bersebelahan melalui interaksi elektrostatik yang menarik atau melalui pembentukan ikatan kovalen antara sistein yang digantikan Gandingan alosterik antara tapak meningkat dan menghasilkan kerjasama yang mengikat. Walaupun kesan interaksi elektrostatik yang menarik pada kerjasama boleh dimansuhkan dengan mutasi D112E, kesan ikatan kovalen tidak boleh. Dalam penerokaan kami terhadap ruang kimia yang tersedia untuk mengikat derivatif guanidine ke saluran Hv1, kami mendapati bahawa 2-guanidinothiazoles seperti GBTA mempunyai pergantungan kepekatan yang lebih curam daripada 2-guanidinobenzimidazoles (Rajah 1c). Analisis pekali Hill bagi GBTA yang mengikat kedua-dua dimerik dan saluran monomerik (Rajah 2a, b) dan kepada saluran dimerik di mana satu subunit dipra-terikat kepada perencat (Rajah 4) membawa kami untuk membuat kesimpulan bahawa perencatan Hv1 oleh GBTA Tindakan itu adalah proses sinergistik, dan tapak pengikatan sebatian dalam dua subunit digandingkan secara alosterik. Penemuan bahawa GBTA terikat pada saluran terbuka, seperti yang ditunjukkan sebelum ini untuk sebatian berkaitan 2GBI32, menunjukkan bahawa gandingan alosterik boleh dinilai secara khusus dalam keadaan terbuka. Model pengikatan koperasi kami dapat secara kuantitatif menggambarkan perencatan HV1 oleh GBTA (Rajah 2C) dan menerangkan kesan yang berbeza dari 2GBI dan GBTA pada pereputan arus ekor saluran selepas repolarization membran, yang menyokong tafsiran kami tentang proses mengikat. Koefisien bukit maksimum yang boleh dicapai dalam protein allosteric dengan dua tapak mengikat (seperti HV1) adalah 2. kami diukur GBTA untuk mengikat jenis liar HV1 dengan pekali 1.31, yang meningkat kepada 1.88 dalam HV1 I127C.The. Tenaga bebas sinergi, perbezaan antara tenaga bebas yang mengikat tapak afiniti terendah dan tertinggi (lihat kaedah), adalah 1.3 kcal/mole dalam hal jenis liar Hv1 dan 2.7 kcal/mole dalam hal Hv1 i127c.The mengikat oksigen ke hemoglobin adalah contoh yang paling terkenal dan dipelajari dengan baik dari proses kolaboratif38.Untuk hemoglobin manusia (tetramer dengan empat tapak pengikat yang digabungkan secara allosterically), pekali bukit dari 2.5-3.0, dengan nilai dari 1.26 hingga 3.64 KCAL/MOL, bergantung kepada keadaan eksperimen38. Oleh itu, dari segi energetik global, koperasi GBTA yang mengikat kepada HV1 tidak jauh berbeza daripada O2 yang mengikat kepada hemoglobin apabila bilangan subunit protein yang berlainan dalam kedua -dua sistem dipertimbangkan. Dalam model sinergi kami, pengikatan molekul GBTA kepada satu subunit menghasilkan peningkatan dalam pertalian mengikat subunit bersebelahan.Kami membayangkan proses di mana penyusunan semula persekitaran yang mengikat yang terhasil daripada peristiwa mengikat pertama (disebabkan oleh Fit) perubahan dalam interaksi antara subunits.in tindak balas terhadap perubahan ini, subunit bersebelahan mengubah tapak mengikat mereka, mengakibatkan pengikatan GBTA yang lebih ketat. Mengenai proses ini, aspartat S1 D112 bertanggungjawab untuk penyusunan semula tapak mengikat yang dikaitkan dengan peningkatan afiniti mengikat.D112 sebelum ini ditunjukkan sebagai sebahagian daripada laluan permeasi proton HV1 dan bertindak sebagai penapis selektiviti27,28. Keputusan kami menunjukkan bahawa penapis selektiviti dalam dua subunit Hv1 secara allosterically ditambah di negeri terbuka. Figure 7a menunjukkan lokasi anggaran tapak pengikat GBTA dan lokasi residu D112, D123, K125 dan I127 pada skema HV1 VSD berdasarkan Pada struktur kristal HV1-CIVSP chimera. Arah yang digabungkan untuk gandingan allosteric yang melibatkan hujung ekstraselular S1 ditunjukkan dengan anak panah hitam. (a) Skematik HV1 VSD. Berdasarkan struktur kristal chimera HV1-CIVSP, segmen heliks ditunjukkan sebagai silinder. Lokasi yang diramalkan GBTA terikat ditunjukkan sebagai oval kelabu. Anak panah Black menunjukkan laluan yang terlibat dalam gandingan allosteric antara tapak mengikat di dua subunit bersebelahan. Kedudukan sisa -sisa S1 yang diselidiki ditandakan dengan sfera berwarna. Dalam dua konfigurasi dimer yang berbeza seperti yang dilihat dari sisi ekstrasel dari pesawat membran. Pada panel kiri, antara muka dimer dibentuk oleh helix s4.Rotation dari dua VSDS 20 darjah mengikut arah jam di sekitar paksi berserenjang dengan pesawat membran, disertai oleh Pemisahan hujung luar dua helikopter S4 (anak panah putus -putus), menghasilkan susunan yang ditunjukkan di sebelah kanan. Dalam konfigurasi ini, residu D123 dan I127 dari subunit bersebelahan dibenarkan untuk mendekati. (c) Dalam konfigurasi dimer yang terdapat dalam struktur kristal 4G80.Posisi P140 dalam CIVSP sepadan dengan kedudukan D123 dalam HV1. Keputusan kami menunjukkan bahawa interaksi elektrostatik yang menjijikkan antara residu 123 (123D/123D atau 123R/123R) dikaitkan dengan tahap "normal" koperasi yang mengikat GBTA dalam keadaan terbuka dan mengalihkan interaksi dari penolakan untuk tertarik (123D/123R) , peningkatan kerjasama (Rajah 5G). Ia dijangka bahawa penyingkiran interaksi yang menjijikkan dengan penggantian alanine juga akan membawa kepada peningkatan koperasi. Namun, penurunan koperasi dimer 123a/123a diperhatikan (Rajah 5e). Penjelasan adalah bahawa kesan ketidakstabilan meletakkan sisa -sisa hidrofobik dalam persekitaran hidrofilik mungkin melebihi kesan penstabilan disebabkan oleh penghapusan interaksi yang menjijikkan antara residu D123, mengakibatkan pengurangan keseluruhan dalam koperasi yang mengikat. Kedudukan D171 CIONA GUTIS CI-HV1 (sepadan dengan D123 dalam HV1 manusia) meningkat apabila pengaktifan, menyokong tanggapan bahawa D123 terletak dalam persekitaran hidrofilik di negeri terbuka. Gating saluran HV1 diketahui berlaku melalui pelbagai peralihan19,20,26,39,40,41.qiu et al26 mendapati bahawa apabila depolarization membran, sensor voltan CI-HV1 mengalami perubahan konformasi yang meninggalkan saluran diaktifkan tetapi masih ditutup , diikuti dengan peralihan yang berbeza yang menyebabkan proton membuka konduksi di kedua-dua laluan subunit. Perubahan konformasi sensor voltan dipantau oleh pendarfluor voltan-clamp, dan didapati bahawa peralihan kedua secara selektif terganggu oleh mutasi pada kedudukan D171. Perturbasi isyarat pendarfluor adalah konsisten dengan kehadiran interaksi elektrostatik antara sisa -sisa D171 subunit bersebelahan pada satu ketika di sepanjang koordinat reaksi perubahan konformasi. Tafsiran ini selaras dengan penemuan kita bahawa residu D123 secara elektrostatik berinteraksi dalam keadaan terbuka dan mengantara gandingan allosteric antara tapak mengikat GBTA. Fujiwara et al25 mencadangkan bahawa antara muka dimer domain coil-coil sitoplasmik meluas ke dalam membran untuk mengandungi dua helai S4 (Rajah 7b, panel kiri). Keseluruhan VSD dan analisis fungsi rantau yang menghubungkan helix S4 dan CCD.in ketiadaan kecerunan pH transmembran, saluran HV1 memerlukan depolarization membran yang besar untuk dibuka, dan silang silang sistein berlaku di bawah keadaan di mana saluran itu kebanyakannya ditutup. Oleh itu, antara muka S4-S4 yang dikesan mungkin mencerminkan konfigurasi subunit di luar negeri. Kajian lain telah menemui bukti untuk penglibatan S1 dan S2 dalam interaksi intersubunit semasa gating17,21,26 menunjukkan bahawa saluran boleh mengadopsi konfigurasi subunit yang berbeza di terbuka dan Negeri tertutup, idea yang selaras dengan penemuan Mony et al. S1 bergerak 39 semasa gating. Di sini, kami menunjukkan bahawa, dalam keadaan terbuka, hujung ekstraselular helix S1 cukup dekat untuk menyokong interaksi elektrostatik langsung yang memeterai gandingan allosteric antara subunits. Dalam konfigurasi dimer dengan interaksi S4-S4 yang dilanjutkan, helai S1 terlalu jauh selain antara satu sama lain untuk berinteraksi secara langsung. Namun, putaran mengikut arah jam dari dua subunit VSD di sekitar paksi serenjang dengan satah membran, digabungkan dengan pemisahan hujung luar dua helai S4, menghasilkan konfigurasi S1-S1 yang konsisten dengan penemuan kami (Rajah 7b, panel kanan). Kami mengesyorkan konfigurasi ini untuk saluran di negeri terbuka. Walaupun enzim civsp dianggap berfungsi sebagai monomer, struktur kristal VSD terpencil ditangkap dalam keadaan dimer. Hujung luar heliks S1 dalam dimer ini secara rapat rapat, dan konfigurasi keseluruhannya sama dengan yang dicadangkan Untuk Hv1 (Rajah 7c). Dalam dimer Civsp, residu terdekat dari subunit bersebelahan adalah proline pada kedudukan 140 (Rajah 7c). Dan dimer Civsp menunjukkan bahawa VSD protein ini mempunyai kecenderungan intrinsik untuk membentuk antara muka di mana hujung ekstraselular S1 berinteraksi. Peranan penting HV1 dalam pengaktifan sel sperma menjadikan saluran ini sebagai sasaran ubat yang menarik untuk mengawal kesuburan lelaki. survival pada pesakit dengan payudara 12 atau kanser kolorektal 13 dan dianggap menyumbang kepada keganasan sel B 11. Oleh itu, ubat molekul kecil yang mensasarkan HV1 boleh digunakan sebagai agen neuroprotektif atau terapeutik antikans. Subunit terbuka HV1, yang membawa kepada peningkatan pertalian mengikat, boleh membawa kepada pembangunan ubat -ubatan yang lebih kuat yang mensasarkan saluran HV1. Mutagenesis yang diarahkan oleh tapak manusia HV1 dilakukan menggunakan teknik PCR standard. Dalam pembinaan HV1NCCIVSP, residu 1-96 dan 228-273 HV1 digantikan oleh sisa-sisa 1-113 dan 240-576 dari Avsp18. C-terminus satu subunit dikaitkan dengan N-terminus subunit kedua melalui ggsggsggsgsgggsgg linker.the plasmid pgemHE yang mengandungi pelbagai pembinaan telah linearized dengan enzim sekatan NHE1 atau SPH1 (New England) T7 mmessage kit transkripsi mmachine (ambion) .1-3 hari sebelum pengukuran elektrofisiologi, cRNA disuntik ke dalam oosit xenopus (50 nl per sel, 0.3-1.5 μg/μl). Dari biosains ekosit. Suntikan RNA, sel -sel dikekalkan dalam medium ND96 yang mengandungi 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml gentamicin, pH 7.2 18 ° C . 2-Guanidino-Benzimidazole [1], 2-Guanidino-Benzothiazole [2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidine [5], (5-bromo-4-4-metil-1,3 -thiazol-2-yl) guanidine) [6], etil 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-karboksilat [8], etil 2-guanidino-4- metil-1,3-thiazole- 5-karboksilat [9] dan (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) etil asetat [10] berasal dari sigma-aldrich.famotidine [7] adalah dari bioperubatan MP.1- [4 -(4-chlorophenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidine [11] dan 1- [4- (3,4-dimethoxyphenyl) -1,3- thiazol-2-yl] guanidine [12] dari matriks saintifik. Sebatian ini adalah kesucian tertinggi yang tersedia secara komersil. sekurang -kurangnya 99% kesucian. Kepada penggantungan 2-amino-4- (trifluoromethyl) benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) dalam 25 ml asid hidroklorik berair (2.5 N) ditambah pepejal dicyandiamide (380 mg, 4.5 mmol) telah refluks dengan kacau yang kuat selama 4 jam. Campuran tindak balas disejukkan ke suhu bilik dan dinetralkan oleh penambahan secara beransur -ansur kalium hidroksida. 65 ° C) selama beberapa jam, dan kemudian direkristalisasi dari etil asetat/petroleum eter untuk memberikan pepejal putih (500 mg, 48 %); MP 221-222 ° C (cahaya 225-226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7.25 (sangat luas S, 4 h), 7.40 (d, 1 h, j = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 h), 7.92 (d , 1 h, j = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114.2 (D, J = 3.5 Hz), 117.5 (D, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (Q, J, = 272 Hz), 126.1 (q, j = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): m/z dikira nilai.for C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, : 261.0419. Naphtho [1,2-d] thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), disintesis seperti yang dinyatakan sebelum ini, dipanaskan hingga 200 ° C dalam mandi minyak dalam tiub ujian kecil.300 mg (kelebihan besar) cyanamide dan dan 1.0 ml conc.to Compound panas ditambah asid hidroklorik dengan cepat dan campuran disimpan di dalam mandi minyak selama kira -kira 2 minit, di mana masa kebanyakan air disejat. telah dipecah menjadi kepingan kecil dan dibasuh dengan air untuk memberikan pepejal amorf kuning pucat. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 h, J = 8.3 Hz), 7.77 (d, 1 h , J = 8.6 Hz), 7.89 (D, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (D, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (D, 1 H, J = 8.3 Hz) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): m/z , dijumpai: 243.0704. Arus proton diukur dalam tompok dalaman dan luaran oosit yang mengekspresikan pembinaan yang berbeza menggunakan penguat axopatch 200b yang dikawal oleh axon digidata 1440a (peranti molekul) dengan perisian pclamp10. ) asid etanesulfonik (MES), 30 mM tetraethylammonium (TEA) mesylate, 5 mM teh klorida, 5 mM etilena glikol-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', asid n'-tetraacetic (egta) pH 6.0 dengan teh hidroksida. Pengukuran semua dilakukan pada 22 ± 2 ° C. Pipet mempunyai rintangan akses 1.5-4 MΩ. Jejak semasa ditapis pada 1 kHz, sampel pada 5 kHz dan dianalisis dengan ClampFit10.2 (peranti molekul ) dan asal8.1 (Originlab). Penyelesaian yang mengandungi pelbagai kepekatan perencat Hv1 dan dalam beberapa kes 10 mm βme diperkenalkan ke dalam mandi dengan graviti melalui manifold yang disambungkan ke sistem injap perfusi vc-6 (Warner Instr.), Yang diluluskan melalui perisian Pclamp TTL (transistor- Logik transistor) isyarat. Eksperimen perfusion rapid dilakukan menggunakan pensil perfusi multi-tiub (Automate Sci.) Dengan hujung penghantaran diameter 360 μm dipasang di hadapan pipet patch. Perencatan saluran ditentukan oleh pengukuran amperometrik isochronal pada akhir +120 mV depolarizing pulse.gv pengukuran dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya18,20. Arus ttail direkodkan pada -40 mV selepas langkah -langkah depolarization pada voltan yang berlainan dari -20 mV hingga +120 mV melainkan dinyatakan sebaliknya. Pulse rujukan sebelum nadi ujian adalah Digunakan untuk membetulkan perebutan semasa 18. Grafik GV sesuai dengan persamaan Boltzmann: pemalar pemisahan yang jelas (kd) untuk kombinasi saluran dan inhibitor yang berlainan (Jadual Tambahan 1) ditentukan dengan menyesuaikan kebergantungan kepekatan perencatan (nilai %inhib) Dengan persamaan bukit: di mana [i] adalah kepekatan perencat I dan H ialah pekali bukit. Untuk mengira pekali bukit, Persamaan (2) disusun semula sebagai: