Avhør av intersubunit-grensesnittet til den åpne Hv1-protonkanalen med en allosterisk koblet sonde

Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript. Den spenningsstyrte protonkanalen Hv1 er et dimerisk kompleks som består av to spenningsfølende domener (VSD), som hver inneholder en gated protonpermeasjonsvei.Dimerisering kontrolleres av det cytoplasmatiske coiled-coil-domenet.Overgangen fra lukket tilstand til den åpne tilstanden i begge VSD-ene er kjent for å oppstå i samarbeid; men lite er kjent om de underliggende mekanismene. Intersubunit-grensesnitt spiller en nøkkelrolle i allosteriske prosesser; slike grensesnitt har imidlertid ikke blitt identifisert i åpne Hv1-kanaler. Her demonstrerer vi at 2-guanidinotiazolderivater blokkerer to Hv1 VSD-er på en samarbeidende måte og bruker en av disse forbindelsene som en sonde for allosterisk kobling mellom åpne underenheter. Vi fant at den ekstracellulære enden av det første transmembrane fragmentet av VSD danner et intersubunit-grensesnitt som medierer kobling mellom bindingssteder, mens coiled-coil-domenet ikke er direkte involvert i denne prosessen. Vi fant også sterke bevis på at kanalens protonselektive filter kontrollerer blokker-bindende kooperativitet . Spenningsstyrte protonkanaler spiller viktige roller i en rekke organismer, fra planteplankton til mennesker1. I de fleste celler medierer disse kanalene protonutstrømning fra protonmembranen og regulerer aktiviteten til NADPH-oksidase. Den eneste kjente spenningsstyrte protonkanalen hos mennesker er Hv1, som er produktet av HVCN1-genet2,3.Hv1 (aka VSOP) har vist seg å spille en rolle i B-celleproliferasjon4, produksjon av reaktive oksygenarter av det medfødte immunsystemet5,6,7,8, sædcelle motilitet9 og pH-regulering av luftveisoverflatevæske10. Denne kanalen er involvert i flere overuttrykte krefttyper som B-celle-maligniteter4,11 og bryst- og kolorektalkreft12,13. Overdreven Hv1-aktivitet ble funnet å øke det metastatiske potensialet til kreftceller 11, 12. I hjernen uttrykkes Hv1 av mikroglia, og aktiviteten har vist seg å forverre hjerneskade i modeller av iskemisk hjerneslag. Hv1-proteinet inneholder et spenningsfølende domene (VSD), som består av fire transmembrane segmenter kalt S1 til S414. VSD-en ligner de tilsvarende domenene til spenningsstyrte Na+-, K+- og Ca2+-kanaler og spenningssensitive fosfataser, som CiVSP fra Ciona gutis15. I disse andre proteinene er C-terminalen til S4 festet til en effektormodul, poredomenet eller enzymet. I Hv1 er S4 koblet til coiled-coil-domenet (CCD) lokalisert på den cytoplasmatiske siden av membranen .Kanalen er et dimerisk kompleks som består av to VSD-er, som hver inneholder en gated protonpermeasjonsvei16,17,18. Disse to Hv1-underenhetene ble funnet å åpne sammen19,20,21,22, noe som tyder på at allosterisk kobling og inter-subenhet-interaksjoner spiller en viktig rolle i gating-prosessen. Grensesnittet mellom underenhetene i det coiled coil-domenet er veldefinert fordi krystallstrukturene til de to isolerte domenene er tilgjengelige22,23. På den annen side er ikke grensesnittet mellom VSD-er i membranen godt forstått. Krystallstrukturen til det kimære Hv1-CiVSP-proteinet gir ikke informasjon om dette grensesnittet, da den trimere organiseringen av det krystalliserte kanalkomplekset kan være et resultat av erstatningen av den native Hv1 CCD med gjær-leucinglidelåsen GCN424. En fersk studie av underenhetsorganisasjonen til Hv1-kanalen konkluderte med at to S4-helikser går over i CCD uten alvorlig forstyrrelse av sekundærstrukturen, noe som resulterer i lange helikser som starter fra membranen og rager inn i cytoplasmaet. Basert på cystein-tverrbindingsanalyse, denne studien foreslår at Hv1 VSD-er kontakter hverandre langs S4-segmentet. Andre studier har imidlertid foreslått alternative grensesnitt mellom VSD-er. Disse grensesnittene inkluderer S1-segmentene 17, 21, 26 og de ytre endene av S2-segmentet 21. En mulig årsak til konflikten resultatene av disse studiene er at allosterisk kobling mellom VSD-er ble undersøkt i forhold til gating-prosessen, som avhenger av lukkede og åpne tilstander, og grensesnittet mellom VSD-er kan variere i forskjellige tilstandsendringer i konformasjon. Her fant vi at 2-guanidinotiazol hemmer Hv1-kanaler ved synergistisk å binde seg til to åpne VSD-er, og brukte en av forbindelsene, 2-guanidinobenzotiazol (GBTA), for å undersøke interaksjonen mellom underenheter i åpen tilstand. grensesnitt. Vi fant at GBTA-bindingskurven kan beskrives godt av en kvantitativ modell der binding av en inhibitor til én underenhet resulterer i en økning i bindingsaffiniteten til den tilstøtende underenheten. Vi fant også at rester D112, selektivitetsfiltre for kanal 27, 28 og en del av guanidinderivatets bindingssete 29 kontrollerer GBTA-bindingssamarbeidet. Vi viser at kooperativ binding opprettholdes i Hv1-dimeren, hvor CCD-en skiller seg fra S4-segmentet, noe som tyder på at intersubunit-grensesnittet i CCD ikke direkte medierer allosterisk kobling mellom GBTA-bindingsseter. I motsetning finner vi at S1-fragmentet er en del av grensesnittet mellom underenhetene og foreslår et arrangement av tilstøtende VSD-er med den ekstracellulære enden av S4-helixen bort fra sentrum av dimeren for å tillate S1-fragmentet skal være i åpen tilstand. Småmolekylære inhibitorer av Hv1 er nyttige som kreftmedisiner og nevrobeskyttende midler. Men til dags dato har få forbindelser vært i stand til å hemme kanalen30,31,32,33. Blant dem 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, forbindelse [1] i fig. 1a) og dets derivater ble funnet å blokkere VSD29,32-permeasjon av protoner gjennom kanalen. Binding av slike forbindelser antas å skje uavhengig i de to åpne underenhetene.2-guanidinobenzotiazol (GBTA, forbindelse [2] i figur 1a) var tidligere vist å hemme Hv1 nesten like effektivt som 2GBI når den ble testet ved en konsentrasjon på 200 μM (Figur 1b). Vi undersøkte andre tiazolderivater og fant at noen av dem hemmet kanalen med lignende eller større styrke enn GBTA (Fig. 1 og Supplementary) tekst). Vi bestemte konsentrasjonsresponskurvene til fire tiazolderivater (GBTA og forbindelser [3], [6] og [11], fig. 1c) og fant at de var brattere enn for 2GBI. Hill-koeffisientene (h) av tiazolderivater varierte fra 1,109 ± 0,040 til 1,306 ± 0,033 (fig. 1c og tilleggsfigur 1). I motsetning til dette var Hill-koeffisienten for 2GBI 0,975 ± 0,024 29, figur 2a og tilleggsfigur 1). En Hill-koeffisient over 1 indikerer bindende kooperativitet.Fordi hver Hv1-underenhet har sin egen inhibitor- bindingssete,29,32 resonnerte vi at bindingen av et tiazolderivat til én underenhet kunne øke bindingen av et andre inhibitormolekyl til den tilstøtende underenheten. GBTA var testforbindelsen med den høyeste Hill-koeffisienten. Derfor valgte vi denne forbindelsen til å videre studere mekanismen for bindingssynergi og brukte 2GBI som en referanse negativ kontroll. (a) Testforbindelser: [1] Referanse Hv1-hemmer 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluormetyl-1,3-benzotiazol-2-yl)guanidin, [4] nafto[1,2-d][1, 3] tiazol-2-yl -guanidin, [5](4-metyl-1,3-tiazol-2-yl)guanidin, [6](5-brom-4-metyl-1,3-tiazol-2-yl)guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metyl-1,3-tiazol-4-karboksylsyreetylester, [9] 2-guanidino-4-metyletyl-1,3-tiazol-5-karboksylat, [10 ](2-guanidino-4-metyl-1,3-tiazol-5-yl)etylacetat, [11]1-[4-(4-klorfenyl)-1,3-tiazol-2-yl]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksyfenyl)-1,3-tiazol-2-yl]guanidin.(b) Hemming av human Hv1-aktivitet av de angitte guanidinotiazolene og referanseforbindelsen 2GBI (blå-grønne søyler) .Hv1-protonstrømmer ble målt i plakk av Xenopus-oocytter innvendig og ut som respons på depolarisering fra et holdepotensial på -80 mV til +120 mV. Hver inhibitor ble tilsatt badet i en konsentrasjon på 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Data er gjennomsnitt±SEM (n≥4).(c) Konsentrasjonsavhengig hemming av human Hv1 av forbindelsene [2], [3], [6] og [11]. Hvert punkt representerer gjennomsnittlig hemming ± SD på 3 til 15 målinger. Linjen er en Hill-tilpasning brukt for å oppnå de tilsynelatende Kd-verdiene rapportert i tilleggstabell 1. Hill-koeffisienter ble bestemt fra tilpasningene rapportert i tilleggsfigur 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (se Metoder). (a,b) Forbindelser 2GBI og GBTA hemmet dimer og monomer Hv1 på en konsentrasjonsavhengig måte. Hvert punkt representerer gjennomsnittlig hemming ± SD på 3 til 8 målinger og kurven er en Hill-tilpasning. Hill-koeffisientene (h) vist i de innsatte histogrammene ble bestemt fra tilpasningene rapportert i tilleggsfigurene 3 og 4. Konsentrasjonsresponsen til GBTA vist i (a) er den samme som i figur 1c. Se tilleggstabell 1 for tilsynelatende Kd-verdier. (c) Modellering av den kooperative bindingen av GBTA til dimer Hv1. Den heltrukne svarte linjen representerer tilpasningen til de eksperimentelle dataene ved ligning (6), som beskriver bindingsmodellen vist i (d). De stiplede linjene merket Sub 1 og Sub 2 representerer den bimolekylære assosiasjonen -dissosiasjonslikevektskurver for henholdsvis første og andre bindingshendelser (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Skjematisk diagram av den foreslåtte mekanismen til Hv1-blokken. Når det gjelder GBTA, øker binding til en åpen underenhet affiniteten til den tilstøtende åpne underenheten (Kd2 0,05, fig. 5d,i). ). På den annen side reduserte mutasjon D123A Hill-koeffisienten til GBTA signifikant (p 0,05/14). Siden nøytralisering av ladningen ved posisjon 123 på begge underenhetene resulterte i en sterk endring i GBTA-bindende kooperativitet, mens reversering av ladningen på begge underenhetene bare hadde en liten effekt, utvidet vi analysen til å inkludere bare én underenhet med inversjonskanalen for ladning. genererte Hv1-koblede dimerer med D123R-substitusjon i den C-terminale underenheten (fig. 5b) og målte konsentrasjon-respons-hemmingen av GBTA og 2GBI. Vi fant at Hill-koeffisienten for GBTA-binding til WT-D123R-kanaler var betydelig høyere enn det av villtype Hv1 (p 0,05). Vi fant også at i fravær av βME, var Hill-koeffisienten for GBTA-binding til D112E I127C Hv1-dimeren signifikant høyere enn den målt i nærvær av reduksjonsmidler (fig. 6e og tilleggsfig. 4), noe som antyder at D112E-mutasjonen opphevet ikke økningen i GBTA-bindende kooperativitet som følge av tverrbindingen av cystein 127. Hill-koeffisienten for 2GBI-binding til D112E, I127C Hv1-dimerer ble heller ikke signifikant påvirket av D112E-mutasjonen (Figur 1).6d og Supplementary Fig. 3). Til sammen antyder disse funnene at GBTA-binding forsterkes av interaksjonen mellom de ytre endene av S1-fragmenter i tilstøtende Hv1-underenheter gjennom attraktive elektrostatiske interaksjoner eller gjennom dannelsen av kovalente bindinger mellom substituerte cysteiner Allosterisk kobling mellom steder øker og resulterer i bindingssamarbeid. Mens effekten av attraktive elektrostatiske interaksjoner på kooperativitet kan oppheves ved mutasjon D112E, kan ikke effekten av kovalente bindinger. I vår utforskning av det kjemiske rommet som er tilgjengelig for binding av guanidinderivater til Hv1-kanaler, fant vi at 2-guanidinotiazoler som GBTA har en brattere konsentrasjonsavhengighet enn 2-guanidinobenzimidazoler (fig. 1c). Hill-koeffisientanalysen av GBTA-binding til begge de dimeriske og monomere kanaler (fig. 2a,b) og til den dimere kanalen der en underenhet var forhåndsbundet til inhibitoren (fig. 4) førte til at vi konkluderte med at inhiberingen av Hv1 av GBTA. Handlingen er en synergistisk prosess, og bindingsstedene til forbindelsene i de to underenhetene er allosterisk koblet. Oppdagelsen av at GBTA binder seg til den åpne kanalen, som tidligere vist for den relaterte forbindelsen 2GBI32, antyder at allosterisk kobling kan vurderes spesifikt i åpen tilstand. Vår samarbeidsbindingsmodell var i stand til å kvantitativt beskrive hemming av HV1 ved GBTA (fig. 2C) og forklare de forskjellige effektene av 2GBI og GBTA på forfallet av kanalhalestrømmer etter membranrepolarisering, som støtter vår tolkning av bindingsprosessen. Den maksimale bakkekoeffisienten som kan oppnås i et allosterisk protein med to bindingssteder (for eksempel HV1) er 2. Vi målte GBTA for å binde HV1 villtype med en koeffisient på 1,31, som økte til 1,88 i HV1 I127C. Synergistisk fri energi, forskjellen mellom de bindende frie energiene til de laveste og høyeste affinitetsstedene (se metoder), var 1,3 kcal/mol i tilfelle av HV1 villtype og 2,7 kcal/mol i tilfelle av HV1 I127C. Bindingen av oksygen til hemoglobin er det mest kjente og godt studerte eksemplet på samarbeidsprosess38. For humant hemoglobin (en tetramer med fire allosterisk koblede bindingssteder), varierer bakkekoeffisienten fra 2,5-3,0, med verdier fra 1,26 til 3.64 Kcal/mol, avhengig av eksperimentelle forhold38.TUS, når det gjelder global energikk, er kooperativiteten til GBTA -binding til HV1 ikke vesentlig forskjellig fra O2 -binding til hemoglobin når det forskjellige antall proteinunderenheter i de to systemene blir vurdert. I vår synergimodell resulterer bindingen av GBTA -molekyler til en underenhet i en økning i bindingsaffiniteten til den tilstøtende underenhet. Vi ser for oss en prosess der en omorganisering av bindingsmiljøet som følge av den første bindingshendelsen (indusert passform) fører til det bindende miljøet som følge av den første bindende hendelsen (indusert passform) Endringer i samspillet mellom underenheter. I respons på disse endringene endrer tilstøtende underenheter sine bindingssteder, noe ble tidligere vist å være en del av HV1 -protongjennomtrengningen og å fungere som selektivitetsfilter27,28. Resultatene våre viser at selektivitetsfilter i de to HV1 -underenhetene er allosterisk koblet i åpen tilstand. Figur 7A viser den omtrentlige plasseringen av GBTA -bindingsstedet og plasseringen av rester D112, D123, K125 og I127 på en skjematisk av HV1 VSD -basert basert På krystallstrukturen til HV1-CIVSP-chimera. (A) Skjematisk av HV1 VSD. Basert på krystallstrukturen til HV1-CIVSP-kimæren er de spiralformede segmentene vist å være sylindrisk. I denne konfigurasjonen fusjonerer den indre enden av S4-segmentet med CCD (ikke vist). De forutsagte plasseringene av bundne GBTA vises som grå ovaler. Black piler indikerer veier involvert i allosterisk kobling mellom bindingssteder i to tilstøtende underenhet I to forskjellige dimerkonfigurasjoner sett fra den ekstracellulære siden av membranplanet. På venstre panel er dimergrensesnittet dannet av S4 helix.rotasjonen av de to VSD -ene 20 grader med klokken rundt en akse vinkelrett på membranplanet, ledsaget av en akse Separasjon av de ytre ender av de to S4 -helikene (stiplede piler), produserer arrangementet vist til høyre. I denne konfigurasjonen får rester D123 og I127 fra tilstøtende underenheter lov til å komme tett sammen. (C) Skjematisk fremstilling av CIVSP VSD I dimerkonfigurasjonen som er funnet i 4G80 -krystallstrukturen. Posisjon P140 i CIVSP tilsvarer posisjon D123 i HV1. Resultatene våre viser at den frastøtende elektrostatiske interaksjonen mellom rest 123 (123d/123d eller 123R/123R) er assosiert med et "normalt" nivå av GBTA-bindende kooperativitet i åpen tilstand og forskyver samspillet fra frastøtning til tiltrukket (123d/123R) , økt samarbeid (fig. 5G). Det forventes at fjerning av den frastøtende interaksjonen med alaninsubstitusjon også vil føre til økt kooperativitet. Forklaring er at den destabiliserende effekten av å plassere hydrofobe rester i et hydrofilt miljø kan oppveie den stabiliserende effekten på grunn av eliminering av frastøtende interaksjoner mellom D123 -rester, noe Posisjon D171 av Ciona Gutis CI-HV1 (tilsvarende D123 i human HV1) økes ved aktivering, og støtter forestillingen om at D123 er lokalisert i et hydrofilt miljø i åpen tilstand. Gating av HV1-kanaler er kjent for å oppstå gjennom flere overgang , etterfulgt av en distinkt overgang som får protoner til å åpne ledning i begge underenhetene. Forstyrrelsen av det fluorescerende signalet stemmer overens med tilstedeværelsen av elektrostatiske interaksjoner mellom D171 -restene av tilstøtende underenheter på et tidspunkt langs reaksjonskoordinatene til den konformasjonsendringen. Denne tolkningen er i samsvar med vårt funn at D123 -rest elektrostatisk interaksjoner i åpen tilstand og formidler allosterisk kobling mellom GBTA -bindingssteder. Fujiwara et al25 foreslo at dimer-grensesnittet til det cytoplasmatiske kveilede-spole-domenet strekker seg inn i membranen for å inneholde to S4-helikser (fig. 7B, venstre panel). En modell av dette intersubunit-interaksjonen er basert på cystein tverrbindingsanalyse dekket Hele VSD og funksjonell analyse av regionen som forbinder S4 -helixen og CCD -en. I fraværet av en transmembran pH -gradient, krever HV1 -kanaler betydelig membrandepolarisering for å åpne, og cystein -tverrbinding skjer under forhold der kanalen hovedsakelig er stengt. Derfor gjenspeiler det detekterte S4-S4-grensesnittet sannsynligvis off-stat-underenhetskonfigurasjonen. Andre studier har funnet bevis for involvering av S1 og S2 i intersubunit-interaksjoner under gating17,21,26 som antyder at kanaler kan ta i bruk forskjellige underenhetskonfigurasjoner i det åpne og lukkede stater, en idé som stemmer overens med funnene fra Mony et al. S1 beveger seg 39 under gating. Her viser vi at i åpen tilstand er de ekstracellulære endene av S1-helixen nær nok til å støtte direkte elektrostatiske interaksjoner som medierer allosterisk kobling mellom underenheter. I dimerkonfigurasjonen med utvidede S4-S4-interaksjoner er S1-helikene for langt Bortsett fra hverandre for å samhandle direkte. med våre funn (fig. 7b, høyre panel). Vi anbefaler denne konfigurasjonen for kanalen i åpen tilstand. Selv om CIVSP -enzymet antas å fungere som en monomer, blir krystallstrukturen til dets isolerte VSD fanget i en dimertilstand. De ytre ender av S1 -helikser i denne dimeren er romlig tett sammen, og den totale konfigurasjonen er lik den som er foreslått For HV1 (fig. 7C). I CIVSP -dimeren var den nærmeste resten fra den tilstøtende underenheten prolin i posisjon 140 (fig. 7C). og CIVSP -dimerer antyder at VSD -ene til disse proteinene har en egen tendens til å danne et grensesnitt der de ekstracellulære ender av S1 interagerer. Den essensielle rollen til HV1 i sædcelleaktivering gjør denne kanalen til et attraktivt medikamentmål for kontroll av mannlig fruktbarhet. Førstående, har aktivering av HV1 i mikroglia vist seg å forverre utvinning fra iskemisk hjerneslag. Enhansert HV1 -aktivitet ble funnet å være assosiert med lavere Overlevelse hos pasienter med bryst 12 eller tykktarmskreft 13 og antas å bidra til B-celle maligniteter 11. Derfor kan små molekylmedisiner rettet mot HV1 brukes som nevrobeskyttende midler eller antikanserterapeutika. Oppdagelsen av at guanidinothiazol derivat kan indusere konformasjonsoppdateringer som er innvendige innvendige innvendige innvendige innvendige innvendige innvendige innvendige avledninger. Åpen HV1 -underenhet, som fører til økt bindingsaffinitet, kan føre til utvikling av mer potente medisiner rettet mot HV1 -kanaler. Stedsrettet mutagenese av human HV1 ble utført ved bruk av standard PCR-teknikker. I HV1NCCIVSP-konstruksjonen ble rester 1-96 og 228-273 av HV1 erstattet av rester 1-113 og 240-576 av civsp18.in HV1-koblet dimer, C-terminalen til en underenhet er koblet til N-terminalen til den andre underenheten gjennom GGSGGSGGSGSGGGGG-linker T7 mMessage mmachine transkripsjonssett (Ambion) .1-3 dager før elektrofysiologiske målinger ble CRNA injisert i xenopus oocytter (50 nl per celle, 0,3-1,5 μg/μL). Stage V og VI oocytter fra xenopus laevis (NASCO) ble oppnådd VI oocytter Fra økocyttbioscience. Følgende RNA -injeksjon ble celler opprettholdt i ND96 -medium inneholdende 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM pyruvat, 100 μg/ml gentamicin, pH 7.2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzothiazol [2], (4-metyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidin [5], (5-brom-4-metyl-1,3 -thiazol-2-yl) guanidin) [6], etyl 2-guanidino-5-metyl-1,3-thiazol-4-karboksylat [8], etyl 2-guanidino-4-metyl-1,3-thiazol- 5-karboksylat [9] og (2-guanidino-4-metyl-1,3-thiazol-5-yl) etylacetat [10] var fra Sigma-Aldrich.famotidin [7] var fra MP-biomedikaler.1- [4 -(4-klorfenyl) -1,3-thiazol-2-yl] guanidin [11] og 1- [4- (3,4-dimetoksyfenyl) -1,3- thiazol-2-yl] guanidin [12] var var fra matrise vitenskapelige. Disse forbindelsene er av høyeste renhet kommersielt tilgjengelige. De ble oppløst i tørr DMSO for å generere en 100 mm stamoppløsning, som deretter ble fortynnet i opptaksløsningen ved ønsket sluttkonsentrasjon.compounds 3 og 4 ble syntetisert nedenfor med minst 99% renhet. Til en suspensjon av 2-amino-4- (trifluormetyl) benzenetiolhydroklorid (1,02 g, 4,5 mmol) i 25 ml vandig saltsyre (2,5 N) ble tilsatt fast dicyAndiamid (380 mg, 4,5 mmol) og resultatet heterogeneousoususoususheterogenoususheterogenousheterogeneousheterogenousheterogenousheterogenousheterogeneous-blanding (380 mg, 4,5 mmol) og resultatet med fast dicyandiamide ble tilbakeløp med kraftig omrøring i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og nøytralisert ved gradvis tilsetning av 10N kaliumhydroksyd. Det dannede hvite bunnfall ble filtrert, vasket med kaldt vann (3 x 50 ml), tørket i en ovn ( 65 ° C) i flere timer, og omkrystalliseres deretter fra etylacetat/petroleumeter for å gi et hvitt fast stoff (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (lys 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [ppm] = 7,25 (veldig bred S, 4 timer), 7,40 (d, 1 time, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 time), 7,92 (d , 1 H, J = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (Q, J = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5.hrms (ESI): m/z Beregnet verdi. For C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, Found : 261.0419. Nafto [1,2-D] tiazol-2-amin (300 mg, 1,5 mmol), syntetisert som tidligere beskrevet, ble oppvarmet til 200 ° C i et oljebad i et lite testrør.300 mg (stort overskudd) cyanamid og 1,0 ml Conc. til den varme forbindelsen ble tilsatt saltsyre raskt og blandingen ble holdt i oljebadet i ca 2 minutter, i løpet av hvilken tid mesteparten av vannet fordampet. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og det resulterende størknet materiale ble brutt i små biter og vasket med vann for å gi et blekgul amorf faststoff. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [ppm] = 7,59 (t, 1 time, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 time, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 time , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 time, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 time, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 time, j = 8,3 Hz) .13c NMR (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.hrms (ESI): m/z beregnet verdi , funnet: 243.0704. Protonstrømmer ble målt i interne og eksterne lapper av oocytter som uttrykker forskjellige konstruksjoner ved bruk av en Axopatch 200b-forsterker kontrollert av en Axon Digidata 1440A (molekylære enheter) med PCLAMP10-programvare. Intracellulære og ekstracellulære oppløsninger har samme sammensetning: 100 mm 2- (n-Morpholino ) etanesulfonsyre (MES), 30 mM tetraetylammonium (te) mesylat, 5 mM te klorid, 5 mM etylenglykol-bis (2-aminoetyl) -n, n, n ', n'-tetraacdic acid (egta), justert til pH 6,0 med tehydroksyd. Alle målinger ble utført ved 22 ± 2 ° C. Pipetten har en tilgangsmotstand på 1,5–4 MΩ. Strømspor ble filtrert ved 1 kHz, prøvetatt ved 5 kHz og analysert med ClampFit10.2 (molekylære enheter ) og opprinnelse8.1 (OriginLab). Løsninger som inneholder forskjellige konsentrasjoner av HV1-hemmer og i noen tilfeller ble 10 mM βME introdusert i badekaret ved tyngdekraft gjennom et manifold koblet til et VC-6 perfusjonsventilsystem (Warner Instr.), Som ble ført gjennom PCLAMP-programvaren TTL (transistor- Transistorlogikk) signaler. Rapid perfusjonseksperimenter ble utført ved bruk av en multi-rørs perfusjonsblyant (automatisert sci.) Med en leveringspiss på 360 um diameter montert foran en lapppipette. Kanalsinhibisjon ble bestemt ved isokron amperometrisk målinger ved slutten av enden +120 mV depolariserende puls.gv Målinger ble utført som tidligere beskrevet 18,20.Tailstrømmer ble registrert ved -40 mV etter depolariseringstrinn ved forskjellige spenninger fra -20 mV til +120 mV med mindre annet er oppgitt. Referansepulsen før testpulsen er Brukes for å korrigere for gjeldende forfall 18. GV -grafen passer til Boltzmann -ligningen: De tilsynelatende dissosiasjonskonstantene (KD) for forskjellige kombinasjoner av kanaler og hemmere (supplerende tabell 1) ble bestemt ved å montere konsentrasjonsavhengigheten av hemming (gjennomsnittlig %inhibverdier) Med Hill -ligningen: Hvor [i] er konsentrasjonen av hemmer I og H er bakkekoeffisienten. For å beregne bakkekoeffisienten, er ligning (2) omorganisert som: