Interrogatório da interface intersubunidades do canal de prótons Hv1 aberto com uma sonda alostericamente acoplada

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Aqui demonstramos que os derivados de 2-guanidinotiazol bloqueiam dois VSDs Hv1 de maneira cooperativa e usam um desses compostos como sonda para acoplamento alostérico entre subunidades abertas. A extremidade do primeiro fragmento transmembranar do VSD forma uma interface intersubunidade que medeia o acoplamento entre os locais de ligação, enquanto o domínio da bobina enrolada não está diretamente envolvido neste processo. Também encontramos fortes evidências de que o filtro seletivo de prótons do canal controla a cooperatividade de ligação ao bloqueador . Os canais de prótons dependentes de voltagem desempenham papéis importantes em uma variedade de organismos, do fitoplâncton aos humanos1. Na maioria das células, esses canais medeiam o efluxo de prótons da membrana de prótons e regulam a atividade da NADPH oxidase. é Hv1, que é o produto do gene HVCN12,3. Foi demonstrado que Hv1 (também conhecido como VSOP) desempenha um papel na proliferação de células B4, produção de espécies reativas de oxigênio pelo sistema imunológico inato5,6,7,8, espermatozóides motilidade9 e regulação do pH do fluido da superfície das vias aéreas10. Este canal está envolvido em vários tipos de câncer superexpressos, como malignidades de células B4,11 e cânceres de mama e colorretal12,13. Descobriu-se que a atividade excessiva de Hv1 aumenta o potencial metastático de células cancerígenas 11, 12. No cérebro, Hv1 é expresso pela microglia, e sua atividade demonstrou exacerbar o dano cerebral em modelos de acidente vascular cerebral isquêmico. A proteína Hv1 contém um domínio sensor de voltagem (VSD), que consiste em quatro segmentos transmembrana chamados S1 a S414. O VSD se assemelha aos domínios correspondentes dos canais de Na+, K+ e Ca2+ dependentes de voltagem e fosfatases sensíveis à voltagem, como CiVSP de Ciona gutis15. Nessas outras proteínas, o terminal C de S4 está ligado a um módulo efetor, o domínio de poro ou enzima. Em Hv1, S4 está ligado ao domínio de bobina enrolada (CCD) localizado no lado citoplasmático da membrana .O canal é um complexo dimérico que consiste em dois VSDs, cada um contendo uma via de permeação de prótons controlada . Descobriu-se que essas duas subunidades Hv1 se abrem cooperativamente , sugerindo que o acoplamento alostérico e as interações entre subunidades desempenham um papel um papel importante no processo de disparo. A interface entre as subunidades dentro do domínio da bobina enrolada é bem definida porque as estruturas cristalinas dos dois domínios isolados estão disponíveis. Por outro lado, a interface entre VSDs dentro da membrana não é bem compreendido.A estrutura cristalina da proteína quimérica Hv1-CiVSP não fornece informações sobre esta interface, pois a organização trimérica do complexo de canal cristalizado pode resultar da substituição do CCD Hv1 nativo pelo zíper de leucina de levedura GCN424. Um estudo recente da organização da subunidade do canal Hv1 concluiu que duas hélices S4 fazem a transição para o CCD sem ruptura grave da estrutura secundária, resultando em hélices longas que partem da membrana e se projetam no citoplasma. Com base na análise de reticulação de cisteína, este estudo propõe que os VSDs Hv1 entrem em contato entre si ao longo do segmento S4. No entanto, outros estudos propuseram interfaces alternativas entre os VSDs. Essas interfaces incluem os segmentos S1 17, 21, 26 e as extremidades externas do segmento S2 21. Uma possível razão para o conflito Os resultados desses estudos são que o acoplamento alostérico entre VSDs foi examinado em relação ao processo de disparo, que depende dos estados fechado e aberto, e a interface entre VSDs pode variar em diferentes mudanças de estado na conformação. Aqui, descobrimos que o 2-guanidinotiazol inibe os canais Hv1 ligando-se sinergicamente a dois VSDs abertos, e usamos um dos compostos, 2-guanidinobenzotiazol (GBTA), para sondar a interação entre subunidades no estado aberto. interface. Descobrimos que a curva de ligação do GBTA pode ser bem descrita por um modelo quantitativo no qual a ligação de um inibidor a uma subunidade resulta em um aumento na afinidade de ligação da subunidade adjacente. os canais 27, 28 e parte do sítio de ligação do derivado de guanidina 29 controlam a cooperatividade de ligação do GBTA. Mostramos que a ligação cooperativa é mantida no dímero Hv1, onde o CCD se separa do segmento S4, sugerindo que a interface intersubunidade no CCD não ocorre diretamente mediar o acoplamento alostérico entre locais de ligação ao GBTA. Em contraste, descobrimos que o fragmento S1 faz parte da interface entre as subunidades e propomos um arranjo de VSDs adjacentes com a extremidade extracelular da hélice S4 longe do centro do dímero para permitir o fragmento S1 esteja no estado aberto. Inibidores de moléculas pequenas de Hv1 são úteis como medicamentos anticâncer e agentes neuroprotetores. No entanto, até o momento, poucos compostos foram capazes de inibir o canal30,31,32,33. Entre eles, o 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, composto [1] na Fig. 1a) e seus derivados bloqueiam a permeação de prótons VSD29,32 através do canal. Acredita-se que a ligação de tais compostos ocorra independentemente nas duas subunidades abertas. anteriormente mostrado inibir Hv1 quase tão eficazmente quanto 2GBI quando testado em uma concentração de 200 μM (Figura 1b). Examinamos outros derivados de tiazol e descobrimos que alguns deles inibiram o canal com potência semelhante ou maior que GBTA (Fig. 1 e Suplemento texto).Determinamos as curvas de resposta à concentração de quatro derivados de tiazol (GBTA e compostos [3], [6] e [11], Fig. 1c) e descobrimos que elas eram mais íngremes do que aquelas de 2GBI. de derivados tiazólicos variou de 1,109 ± 0,040 a 1,306 ± 0,033 (fig. 1c e Figura Complementar 1). Em contraste, o coeficiente de Hill para 2GBI foi 0,975 ± 0,024 29, Figura 2a e Figura Complementar 1). Um coeficiente de Hill acima de 1 indica cooperatividade de ligação. Porque cada subunidade Hv1 tem seu próprio inibidor- local de ligação,29,32 raciocinamos que a ligação de um derivado de tiazol a uma subunidade poderia aumentar a ligação de uma segunda molécula inibidora à subunidade adjacente. GBTA foi o composto de teste com o coeficiente de Hill mais alto. estudar ainda mais o mecanismo de sinergia de ligação e usar 2GBI como controle negativo de referência. (a) Compostos de teste: [1] Inibidor de referência Hv1 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)guanidina, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidina, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidina, [7] famotidina, [8] éster etílico do ácido 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxílico, [9] 2-guanidino-4-metil etil-1,3-tiazol-5-carboxilato, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)acetato de etila, [11]1-[4-(4-Clorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidina. (b) Inibição da atividade Hv1 humana pelos guanidinotiazóis indicados e pelo composto de referência 2GBI (barras azul-esverdeadas) .As correntes de prótons Hv1 foram medidas em placas de dentro para fora de oócitos de Xenopus em resposta à despolarização de um potencial de retenção de -80 mV a +120 mV. Cada inibidor foi adicionado ao banho a uma concentração de 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Os dados são média ± SEM (n≥4). (c) Inibição dependente da concentração de Hv1 humano pelos compostos [2], [3], [6] e [11]. Cada ponto representa a inibição média ± DP de 3 para 15 medições. A linha é um ajuste de Hill usado para obter os valores aparentes de Kd relatados na Tabela Suplementar 1. Os coeficientes de Hill foram determinados a partir dos ajustes relatados na Figura Suplementar 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (ver Métodos). (a,b) Os compostos 2GBI e GBTA inibiram Hv1 dimérico e monomérico de maneira dependente da concentração. Cada ponto representa a inibição média ± DP de 3 a 8 medições e a curva é um ajuste de Hill. os histogramas inseridos foram determinados a partir dos ajustes relatados nas Figuras Suplementares 3 e 4. A resposta de concentração do GBTA mostrada em (a) é a mesma da Fig. 1c. Consulte a Tabela Suplementar 1 para valores aparentes de Kd. (c) Modelagem de a ligação cooperativa de GBTA ao dimérico Hv1. A linha preta sólida representa o ajuste aos dados experimentais pela equação (6), que descreve o modelo de ligação mostrado em (d). As linhas tracejadas rotuladas Sub 1 e Sub 2 representam a associação bimolecular -curvas de equilíbrio de dissociação do primeiro e segundo eventos de ligação, respectivamente (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Diagrama esquemático do mecanismo proposto do bloco Hv1.No caso do GBTA, a ligação a uma subunidade aberta aumenta a afinidade da subunidade aberta adjacente (Kd2 Os canais Hv1 podem ser monomerizados substituindo seus domínios citoplasmáticos N e C-terminais por porções correspondentes da fosfatase sensível à voltagem Ciona Intestinalis CiVSP (Hv1NCCiVSP) . Medimos a dependência da concentração da inibição do Hv1 monomérico por GBTA e 2GBI e comparou-os com a inibição do canal dimérico (tipo selvagem) (Fig. 2a, b). Descobrimos que a diferença na cooperatividade de ligação entre os dois compostos foi eliminada no Hv1 monomérico, apoiando a explicação de que a ligação do GBTA a uma subunidade aumenta o afinidade da outra subunidade pelo inibidor. Raciocinamos que a ligação do GBTA a uma subunidade Hv1 pode levar ao rearranjo do sítio de ligação (induzindo ajuste35), o que desencadearia o rearranjo do sítio de ligação vago da subunidade adjacente, levando ao aumento da ligação afinidade. Para descrever quantitativamente a ligação cooperativa do GBTA ao canal, utilizamos um modelo no qual qualquer subunidade pode se ligar à primeira molécula inibidora após uma reação bimolecular com uma constante de dissociação Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO + B ⇆ BO *). A ligação faz com que o canal adote um estado no qual as subunidades vazias restantes se ligam ao inibidor seguindo uma reação bimolecular única com uma constante de dissociação Kd2, onde Kd2 Uma vez ligada a segunda molécula inibidora, ambas as subunidades têm uma constante de dissociação Kd2 (Fig. 2d). A inibição do canal foi medida sob condições de despolarização (+120 mV). OO na Fig. 2d) foram anteriormente encontrados contribuindo de forma insignificante para a corrente Hv1 sob estas condições e, portanto, não foram incluídos no modelo de ligação . A linha preta sólida na Figura 2c é o ajuste da equação do modelo à curva experimental de concentração-resposta, produzindo um Kd1 de ~ 290 μM e um Kd2 de ~ 29 μM (seção de métodos, equação (6)). a ligação de 2GBI, onde Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). No Hv1 monomérico, há apenas um sítio de ligação e um Kdm (O° + B ⇆ B°). No caso do GBTA, Kdm é em torno de 54 μM, que é mais semelhante a Kd1 do que Kd2 (Fig. 2d). Em outras palavras, o sítio de ligação do monômero está em uma configuração (O°) mais semelhante ao estado de alta afinidade (BO*) do que ao estado de baixa afinidade. estado de afinidade (OO) do dímero, provavelmente devido à eliminação da interface entre as subunidades. Como mostrado anteriormente para 2GBI32, descobrimos que o GBTA suprimiu as correntes Hv1 bloqueando o canal quando ele estava aberto, em vez de torná-lo mais difícil de abrir (Fig. Complementar 2a, b, d). 2GBI também é conhecido por induzir correntes de cauda que decaem lentamente em resposta à repolarização da membrana, mas este fenômeno não foi observado no GBTA (Fig. Complementar 2c). Na presença de inativação de Hv1 na presença de 2GBI, as portas em cada subunidade não podem fechar até que o bloqueador deixe o sítio de ligação (o " foot gate "mecanismo), e 2GBI se desvincula mais lentamente do que os portões se fecham. Se uma subunidade Hv1 for desbloqueada e fechada, enquanto a subunidade adjacente permanece bloqueada, a desvinculação das moléculas 2GBI restantes torna-se mais lenta (captura do bloqueador). Espécies de canal de vida longa com apenas uma subunidade bloqueada conduz prótons transitoriamente antes de fechar e dá uma contribuição significativa para a corrente de cauda que decai lentamente. A descoberta de que o decaimento das correntes de cauda Hv1 não foi significativamente retardado na presença de GBTA (Fig. Complementar 2c) é consistente com um mecanismo de ligação sinérgico para este bloqueador (Fig. 2d). Uma vez que uma molécula de GBTA é desvinculada da subunidade Hv1 , a afinidade do bloqueador com a subunidade adjacente cai cerca de 10 vezes, favorecendo o processo de desvinculação. Isso significa que a segunda molécula de GBTA tem uma chance muito maior de se desfazer antes de ficar presa no canal. espera-se que produzam apenas uma subunidade de bloqueio seja muito mais abundante na presença de GBTA do que na presença de 2GBI, resultando em um decaimento mais rápido da corrente de cauda. Para que o GBTA se ligue cooperativamente a ambas as subunidades Hv1, os locais de ligação devem ser acoplados alostericamente. Cada local de ligação deve ser capaz de: 1) desencadear uma cadeia de eventos que se comunique com subunidades adjacentes ligadas ao inibidor, e 2) mediar o transição de ligação de baixa afinidade para ligação de alta afinidade. Raciocinamos que se resíduos específicos dentro do sítio de ligação contribuíssem para o processo cooperativo, sua mutação deveria alterar o coeficiente de Hill da curva concentração-resposta da inibição de Hv1 por GBTA. , S181 e R211 mostraram anteriormente fazer parte do ambiente de ligação 2GBI29 e levantamos a hipótese de que eles estariam envolvidos de forma semelhante na ligação de GBTA (Fig. 3A). Medimos curvas de concentração-resposta inibitórias de GBTA para canais mutantes D112E, F150A, S181A , e R211S (Figura 3) e comparou seus coeficientes de Hill com aqueles do tipo selvagem Hv1, usando 2GBI como referência. O resíduo V109 está na mesma face do segmento S1 que D112 e tem uma volta helicoidal extra dentro da célula. V109 não estava envolvido na ligação de 2GBI29, usamos o mutante V109A como controle (Fig. 3b). (a) Resíduos Hv1 sugeridos envolvidos na ligação do derivado de guanidina. Curvas azuis tracejadas circundam as cadeias laterais propostas anteriormente que interagem com diferentes partes do composto 2GBI29. (bf) Inibição dependente da concentração dos mutantes Hv1 indicados pelos compostos 2GBI (ciano) e GBTA ( vermelho escuro).Cada ponto representa a inibição média de 3 a 12 medições ± SD V109 como um controle negativo.As curvas são ajustes de Hill usados ​​para obter valores aparentes de Kd (ver Tabela Suplementar 1).Os coeficientes de Hill (h) mostrados em os histogramas inseridos foram determinados a partir dos ajustes relatados nas Figuras Suplementares 3 e 4. Os valores de referência h para Hv1 WT são mostrados como linhas tracejadas. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre as passagens mutantes e WT (p 0,05) no coeficiente de Hill da ligação do GBTA aos canais GGG em comparação com o tipo selvagem (Fig. 5c), sugerindo que, apesar de seu papel na manutenção do duas subunidades juntas são importantes, mas o CCD não medeia diretamente o acoplamento alostérico intersubunidades entre os locais de ligação do GBTA. (a) Diagrama esquemático do dímero Hv1 com uma mutação de triglicina na extremidade interna de S4 projetada para interromper o acoplamento intersubunidade mediado pelo domínio citoplasmático de espiral enrolada (setas azuis). (b) Representação esquemática de dímeros Hv1 e dímeros de ligação com mutações indicadas, projetadas para testar fragmentos S1 envolvidos no acoplamento entre subunidades (setas azuis). (c – h) 2GBI (ciano) e GBTA (vermelho escuro) inibem as construções indicadas de maneira dependente da concentração. ± DP de 3 a 10 medições. A curva foi um ajuste de Hill usado para obter valores aparentes de Kd (ver Tabela Suplementar 1). Os coeficientes de Hill nos histogramas interpolados foram determinados conforme descrito na seção Métodos (ver Figuras Complementares 3 e 4). Hv1 WT são mostrados como linhas tracejadas. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre as passagens mutantes e WT (p 0,05, Fig. 5d, i) ). Por outro lado, a mutação D123A reduziu significativamente o coeficiente de Hill do GBTA (p 0,05/14). Como a neutralização da carga na posição 123 em ambas as subunidades resultou em uma forte mudança na cooperatividade de ligação do GBTA, enquanto a reversão da carga em ambas as subunidades teve apenas um pequeno efeito, estendemos a análise para incluir apenas uma subunidade com o canal de inversão de carga. gerou dímeros ligados a Hv1 com substituição D123R na subunidade C-terminal (Fig. 5b) e mediu a inibição concentração-resposta por GBTA e 2GBI. Descobrimos que o coeficiente de Hill de ligação de GBTA aos canais WT-D123R foi significativamente maior do que isso de Hv1 de tipo selvagem (p 0,05). Descobrimos também que na ausência de βME, o coeficiente de Hill de ligação do GBTA ao dímero D112E I127C Hv1 foi significativamente maior do que aquele medido na presença de agentes redutores (Fig. 6e e Fig. Complementar 4), implicando que a mutação D112E não aboliu o aumento na cooperatividade de ligação de GBTA resultante da reticulação da cisteína 127. O coeficiente de Hill de ligação de 2GBI aos dímeros D112E, I127C Hv1 também não foi significativamente afetado pela mutação D112E (Figura 1).6d e Suplementar Figura 3). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a ligação do GBTA é aumentada pela interação entre as extremidades externas dos fragmentos S1 em subunidades Hv1 adjacentes através de interações eletrostáticas atraentes ou através da formação de ligações covalentes entre cisteínas substituídas. O acoplamento alostérico entre locais aumenta e resulta em cooperatividade de ligação. Embora o efeito das interações eletrostáticas atrativas na cooperatividade possa ser abolido pela mutação D112E, o efeito das ligações covalentes não pode. Em nossa exploração do espaço químico disponível para a ligação de derivados de guanidina aos canais Hv1, descobrimos que 2-guanidinotiazóis como GBTA têm uma dependência de concentração mais acentuada do que 2-guanidinobenzimidazóis (Fig. 1c). e canais monoméricos (Fig. 2a, b) e ao canal dimérico no qual uma subunidade foi pré-ligada ao inibidor (Fig. 4) nos levou a concluir que a inibição de Hv1 pelo GBTA A ação é um processo sinérgico, e os locais de ligação dos compostos nas duas subunidades são acoplados alostericamente. A descoberta de que o GBTA se liga ao canal aberto, como mostrado anteriormente para o composto relacionado 2GBI32, sugere que o acoplamento alostérico pode ser avaliado especificamente no estado aberto. foi capaz de descrever quantitativamente a inibição de Hv1 pelo GBTA (Fig. 2c) e explicar os diferentes efeitos de 2GBI e GBTA no decaimento das correntes de cauda do canal após a repolarização da membrana, o que apoia a nossa interpretação do processo de ligação. O coeficiente máximo de montanhas que pode ser alcançado em uma proteína alostérica com dois locais de ligação (como o HV1) é 2.Es medimos o GBTA para ligar o tipo selvagem HV1 com um coeficiente de 1,31, que aumentou para 1,88 em HV1 i127c.The Energia livre sinérgica, a diferença entre as energias livres de ligação dos locais de afinidade mais baixa e alta (consulte Métodos), foi de 1,3 kcal/toupeira no caso de HV1 do tipo selvagem e 2,7 kcal/mole no caso de HV1 i127c.A ligação de oxigênio para hemoglobina é o exemplo mais famoso e bem estudado do processo colaborativo38.Para a hemoglobina humana (um tetrâmero com quatro locais de ligação alostericamente acoplados), o coeficiente de montanha varia de 2,5-3.0, com valores variando de 1,26 a 3,64 KCAL/mol, dependendo das condições experimentais38.Mus, em termos de energia global, a cooperatividade da ligação de GBTA ao HV1 não é substancialmente diferente da ligação de O2 à hemoglobina quando os diferentes números de subunidades de proteínas nos dois sistemas são considerados. Em nosso modelo de sinergia, a ligação das moléculas de GBTA a uma subunidade resulta em um aumento na afinidade de ligação da subunidade adjacente. Nós imaginamos um processo no qual um rearranjo do ambiente de ligação resultante do primeiro evento de ligação (ajuste induzido) leva a para Alterações nas interações entre as subunidades. Foi mostrado anteriormente como parte da via de permeação de prótons HV1 e atuar como filtro de seletividade27,28. Nossos resultados mostram que os filtros de seletividade nas duas subunidades HV1 são alostericamente acoplados no estado aberto. A figura 7A mostra a localização aproximada do local de ligação GBTA e a localização dos resíduos D112, D123, K125 e I127 em um esquema do HV1 VSD baseado em VSD Na estrutura cristalina da chimera HV1-CIVSP. As direções sugestas para o acoplamento alostérico envolvendo a extremidade extracelular de S1 são mostradas com setas pretas. (a) Esquema do HV1 vsd. baseado na estrutura cristalina da quimera HV1-CIVSP, os segmentos helicoidais mostram-se cilíndricos. Nesta configuração, a extremidade interna do segmento S4 se funde com o CCD (não mostrado). Os locais previstos do GBTA ligado são mostrados como ovais cinzentos. As setas negras indicam vias envolvidas no acoplamento alostérico entre os locais de ligação em duas subunidades adjacentes. As posições dos resíduos S1 investigados são marcados com esferas coloridas. (B) Ilustração esquemática das subunidades HV1 organizadas organizadas. Em duas configurações diferentes de dímero, como visto do lado extracelular do plano da membrana. No painel esquerdo, a interface dímero é formada pela hélice S4. A separação das extremidades externas das duas hélices S4 (flechas tracejadas) produz o arranjo mostrado à direita. Nesta configuração, os resíduos D123 e I127 de subunidades adjacentes podem se unir. Na configuração do dímero encontrada na estrutura do cristal 4G80. Nossos resultados mostram que a interação eletrostática repulsiva entre o resíduo 123 (123d/123d ou 123r/123r) está associada a um nível "normal" de cooperatividade de ligação ao GBTA no estado aberto e muda a interação da repulsão para atraída (123D/123R) , aumento da cooperação (Fig. 5G). Espera -se que a remoção da interação repulsiva com a substituição da alanina também leve ao aumento da cooperatividade. A explicação é que o efeito desestabilizador de colocar resíduos hidrofóbicos em um ambiente hidrofílico pode superar o efeito estabilizador devido à eliminação de interações repulsivas entre os resíduos D123, resultando em uma redução geral na cooperatividade de ligação. A posição D171 de Ciona Gutis CI-HV1 (correspondente a D123 no HV1 humano) é aumentada após a ativação, apoiando a noção de que D123 está localizado em um ambiente hidrofílico no estado aberto. Sabe-se que o gatagem dos canais de HV1 ocorre através de várias transições19,20,26,39,40,41.Qiu et al26 descobriram que, após a despolarização da membrana, o sensor de tensão de Ci-hv1 passa por uma mudança conformacional que deixa o canal ativado, mas ainda fechado , seguido de uma transição distinta que faz com que os prótons abrem a condução no caminho das duas subunidades. A mudança conformacional do sensor de tensão foi monitorada por fluorescência de tensão-grampo e verificou-se que a segunda transição foi seletivamente perturbada pela mutação na posição D171. A perturbação do sinal fluorescente é consistente com a presença de interações eletrostáticas entre os resíduos D171 de subunidades adjacentes em algum momento ao longo das coordenadas da reação da mudança conformacional. Essa interpretação é consistente com a nossa descoberta de que o resíduo D123 interage eletrostaticamente no estado aberto e medeia o acoplamento alostérico entre os locais de ligação ao GBTA. Fujiwara et al25 propuseram que a interface do dímero do domínio de bobina enrolada citoplasmática se estenda para a membrana para conter duas hélices S4 (Fig. 7b, painel esquerdo). Um modelo dessa interação intersubunidade é baseado na análise de análise de cruzamento da cisteína Toda a análise VSD e funcional da região que conecta a hélice S4 e o CCD. Portanto, a interface S4-S4 detectada provavelmente reflete a configuração da subunidade fora do estado. Outros estudos encontraram evidências para o envolvimento de S1 e S2 em interações intersubunitárias durante o Gating17,21,26, sugerindo que os canais possam adotar diferentes subunidades em configurações abertas e abertas e abertas e Estados fechados, uma idéia consistente com os achados de Mony et al. S1 se move 39 durante o bloqueio. Aqui, mostramos que, no estado aberto, as extremidades extracelulares da hélice S1 estão próximas o suficiente para suportar interações eletrostáticas diretas que mediam o acoplamento alostérico entre as subunidades. Na configuração do dímero com interações S4-S4 estendidas, as hélices S1 estão muito longe Além do outro para interagir diretamente. No entanto, uma rotação de 20 ° no sentido horário das duas subunidades VSD em torno de um eixo perpendicular ao plano da membrana, combinado com a separação das extremidades externas das duas hélices S4, produziu uma configuração S1-S1 consistente Com nossas descobertas (Fig. 7b, painel direito). Recomendamos esta configuração para o canal no estado aberto. Embora se pense que a enzima civsp funcione como monômero, a estrutura cristalina de seu VSD isolada é capturada em um estado de dímero. As extremidades externas das hélices S1 nesse dímero estão espacialmente próximas, e a configuração geral é semelhante à proposta Para o HV1 (Fig. 7c). No dímero Civsp, o resíduo mais próximo da subunidade adjacente foi prolina na posição 140 (Fig. 7c). Interinceramente, o P140 no CIVSP corresponde à posição D123 no HV1. E os dímeros do CIVSP sugerem que os VSDs dessas proteínas têm uma tendência intrínseca de formar uma interface onde as extremidades extracelulares de S1 interagem. O papel essencial do HV1 na ativação de células espermáticas torna esse canal um alvo atraente de medicamentos para o controle da fertilidade masculina. A sobrevivência em pacientes com mama 12 ou câncer colorretal 13 e acredita-se que contribua para as neoplasias de células B 11. A subunidade aberta HV1, levando ao aumento da afinidade de ligação, pode levar ao desenvolvimento de medicamentos mais potentes direcionados aos canais HV1. A mutagênese direcionada ao local do HV1 humano foi realizada usando técnicas de PCR padrão. Na construção HV1NCCIVSP, os resíduos 1-96 e 228-273 de HV1 foram substituídos pelos resíduos 1-113 e 240-576 do civsp18.in o dimer hv1-link,, O terminal C de uma subunidade está ligado ao terminal N da segunda subunidade através do ligante ggsggsgsggsgg. Os plasmídeos pgemhe que contêm as várias construções foram lineares com a restrição de NHE1 ou SPH1 com as enzimas da RNA) e a síntese de RNA foi a realização de RNA. Kit de transcrição de mmachina de mmessage (Ambion) .1-3 dias antes das medições eletrofisiológicas, o CRNA foi injetado em oócitos de Xenopus (50 nl por célula, 0,3-1,5 μg/μl). De biociência ecocitária. . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzotiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidina [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -thiazol-2-il) guanidina) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-carboxilato [8], etil 2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol- 5-carboxilato [9] e (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) acetato de etila [10] eram de Sigma-Aldrich.famotidina [7] era de MP Biomedicals.1- [4 -(4-clorofenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidina [11] e 1- [4- (3,4-dietoxifenil) -1,3- tiazol-2-il] guanidina [12] foi De Matrix Scientific. Esses compostos são da mais alta pureza disponível comercialmente. Eles foram dissolvidos em DMSO seco para gerar uma solução estoque de 100 mm, que foi diluída na solução de gravação na concentração final desejada. Pelo menos 99% de pureza. Para uma suspensão de 2-amino-4- (cloridrato de benzenetiol (trifluorometil) benzenetiol (1,02 g, 4,5 mmol) em 25 ml de ácido clorídrico aquoso (2,5 N) foi adicionado dicamiamida sólida (380 mg, 4,5 mmol) e a heterogenes resultante de resulta foi refluxado com agitação vigorosa por 4 horas. A mistura de reação foi resfriada à temperatura ambiente e neutralizada pela adição gradual de hidróxido de potássio de 10N.O precipitado branco formado foi filtrado, lavado com água fria (3 × 50 ml), seca em um forno ( 65 ° C) por várias horas e depois recristalizado a partir de acetato de etila/éter de petróleo para dar um sólido branco (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (luz 225–226 ° C) 45; 1H RMN (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7,25 (S, S, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d (d , 1 h, j = 8,1 Hz) .13C RMN (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz), 121,7, 124.6 (Q, J (J = 3,5 Hz), 121,7, 124.6 (Q, J, = 272 Hz), 126.1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175.5.hrms (ESI): M/z Valor calculado. : 261.0419. Nafto [1,2-D] tiazol-2-amina (300 mg, 1,5 mmol), sintetizado como descrito anteriormente, foi aquecido a 200 ° C em um banho de óleo em um pequeno tubo de ensaio.300 mg (grande excesso) cianamida e cianamida e 1,0 ml Conc. para o composto quente foi adicionado rapidamente o ácido clorídrico e a mistura foi mantida no banho de óleo por cerca de 2 minutos, durante o qual a maior parte da água evaporou. A mistura de reação foi então resfriada à temperatura ambiente e o material solidificado resultante resultante foi quebrado em pedaços pequenos e lavado com água para fornecer um sólido amorfo amarelo pálido. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H RMN (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7,59 (t, 1 h, j = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 Hz) .13C RMN (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z Valor calculado.PE C12H11N4S (M + H) +: 243.069999999999999999999999999999999999. , encontrado: 243.0704. As correntes de prótons foram medidas em manchas internas e externas de oócitos que expressam diferentes construções usando um amplificador de 200b de Axopatch controlado por um axônio digidata 1440a (dispositivos moleculares) com software PCLAMP10.Intracelular e soluções extracelulares têm a mesma composição: 100 mm 2- (N-Morpholino ) ácido etanesulfônico (MES), 30 mM de tetraetilamônio (chá) mesilato, cloreto de chá 5 mm, 5 mm de etileno glicol-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraacético (egta), ajustado para pH 6,0 com hidróxido de chá. Todas as medidas foram realizadas a 22 ± 2 ° C. A pipeta possui uma resistência ao acesso de 1,5-4 MΩ. Os traços de corrente foram filtrados a 1 kHz, amostrados a 5 kHz e analisados ​​com Clampfit10.2 (Molecular Dispositivos (Molecular, dispositivos moleculares ) e Origin8.1 (OriginLab). Soluções contendo várias concentrações de inibidor de HV1 e, em alguns casos, foram introduzidas βME de 10 mM foram introduzidas no banho por gravidade através de um coletor conectado a um sistema de válvula de perfusão VC-6 (Warner Instr.), Passado pelo software PCLAMP TTL (transistor- Lógica do transistor) sinais. Experiências de perfusão ráptica foram realizadas usando um lápis de perfusão de vários tubos (Sci automática.) Com uma ponta de entrega de 360 ​​μm de diâmetro montada na frente de uma pipeta de remendo. +120 mV despolarizador de pulso.GV As medidas foram realizadas como descrito anteriormente18,20.Correntes de rabilho foram registradas a -40 mV após etapas de despolarização em diferentes tensões de -20 mV a +120 mV, a menos que indicado de outra forma. Usado para corrigir a decaimento da corrente 18. O gráfico GV se encaixa na equação de Boltzmann: as constantes aparentes de dissociação (kD) para diferentes combinações de canais e inibidores (Tabela 1 suplementar) foram determinados ajustando a dependência da concentração da inibição (valores médios de %de inibição) Com a equação da colina: onde [i] é a concentração do inibidor I e H é o coeficiente da colina. Para calcular o coeficiente da colina, a equação (2) é reorganizada como: