Preiskava medpodenotnega vmesnika odprtega protonskega kanala Hv1 z alosterično sklopljeno sondo

Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem zagotovite nadaljnjo podporo, bomo stran prikazali brez slogov in JavaScripta. Napetostno odvisni protonski kanal Hv1 je dimerni kompleks, sestavljen iz dveh domen za zaznavanje napetosti (VSD), od katerih vsaka vsebuje prepustno pot odvisnega protona. Dimerizacijo nadzira citoplazemska zvita domena. Prehod iz zaprtega stanja v znano je, da se odprto stanje v obeh VSD pojavi kooperativno; vendar je malo znanega o osnovnih mehanizmih. Vmesniki med podenotami igrajo ključno vlogo v alosteričnih procesih; vendar pa takšni vmesniki niso bili identificirani v odprtih kanalih Hv1. Tukaj prikazujemo, da derivati ​​2-gvanidinotiazola blokirajo dva Hv1 VSD na kooperativen način in uporabljajo eno od teh spojin kot sondo za alosterično spajanje med odprtimi podenotami. Ugotovili smo, da zunajcelični konec prvega transmembranskega fragmenta VSD tvori vmesnik med podenotami, ki posreduje spajanje med veznimi mesti, medtem ko domena spiralne tuljave ni neposredno vključena v ta proces. Našli smo tudi trdne dokaze, da protonsko selektivni filter kanala nadzoruje kooperativnost vezave blokatorjev . Napetostno odvisni protonski kanali igrajo pomembno vlogo v različnih organizmih, od fitoplanktona do ljudi1. V večini celic ti kanali posredujejo pri izlivu protonov iz protonske membrane in uravnavajo aktivnost NADPH oksidaze. Edini znani napetostno odvisni protonski kanal pri ljudeh je Hv1, ki je produkt gena HVCN1 2,3. Dokazano je, da ima Hv1 (aka VSOP) vlogo pri proliferaciji celic B4, proizvodnji reaktivnih kisikovih vrst s prirojenim imunskim sistemom5,6,7,8, spermijev gibljivost9 in uravnavanje pH površinske tekočine dihalnih poti10. Ta kanal je vključen v več čezmerno izraženih vrst raka, kot so maligne bolezni B-celic 4,11 ter rak dojke in debelega črevesa in danke 12,13. Ugotovljeno je bilo, da čezmerna aktivnost Hv1 povečuje metastatski potencial rakavih celic 11, 12. V možganih se Hv1 izraža z mikroglijo, njegova aktivnost pa je pokazala, da poslabša poškodbe možganov v modelih ishemične kapi. Protein Hv1 vsebuje napetostno zaznavno domeno (VSD), ki je sestavljena iz štirih transmembranskih segmentov, imenovanih S1 do S414. VSD je podobna ustreznim domenam napetostno odvisnih kanalov Na+, K+ in Ca2+ ter napetostno občutljivih fosfataz, kot je CiVSP iz Ciona gutis15. V teh drugih proteinih je C-konec S4 pritrjen na efektorski modul, domeno por ali encim. V Hv1 je S4 povezan z domeno navitja (CCD), ki se nahaja na citoplazmatski strani membrane. Kanal je dimerni kompleks, sestavljen iz dveh VSD-jev, od katerih vsak vsebuje zaprto protonsko permeacijsko pot16,17,18. Ugotovljeno je bilo, da se ti dve podenoti Hv1 odpirata kooperativno19,20,21,22, kar nakazuje, da igrajo alosterična sklopitev in interakcije med podenotami. pomembno vlogo v procesu prehoda. Vmesnik med podenotami znotraj domene navite tuljave je dobro definiran, ker sta na voljo kristalni strukturi dveh izoliranih domen 22, 23. Po drugi strani pa vmesnik med VSD znotraj membrane ni dobro razumljen. Kristalna struktura himernega proteina Hv1-CiVSP ne daje informacij o tem vmesniku, saj je lahko trimerna organizacija kompleksa kristaliziranega kanala posledica zamenjave naravnega Hv1 CCD z levcinsko zadrgo GCN424 iz kvasa. Nedavna študija organizacije podenote kanala Hv1 je pokazala, da dve vijačnici S4 prehajata v CCD brez resnih motenj v sekundarni strukturi, kar ima za posledico dolge vijačnice, ki se začnejo iz membrane in štrlijo v citoplazmo. Na podlagi analize zamreženja cisteina ta študija predlaga, da se Hv1 VSD stikajo med seboj vzdolž segmenta S4. Vendar pa so druge študije predlagale alternativne vmesnike med VSD. Ti vmesniki vključujejo segmente S1 17, 21, 26 in zunanje konce segmenta S2 21. Možen razlog za konflikt rezultati teh študij so, da je bila alosterična sklopitev med VSD-ji preučena v povezavi s procesom prehoda, ki je odvisen od zaprtega in odprtega stanja, vmesnik med VSD-ji pa se lahko razlikuje glede na različne spremembe stanja v konformaciji. Tu smo ugotovili, da 2-gvanidinotiazol zavira kanale Hv1 s sinergistično vezavo na dva odprta VSD, in uporabili eno od spojin, 2-gvanidinobenzotiazol (GBTA), da preizkusimo interakcijo med podenotami v odprtem stanju. Ugotovili smo, da je vezavno krivuljo GBTA mogoče dobro opisati s kvantitativnim modelom, v katerem ima vezava inhibitorja na eno podenoto za posledico povečanje vezavne afinitete sosednje podenote. Ugotovili smo tudi, da ostanki D112, selektivni filtri za kanal 27, 28 in del vezavnega mesta 29 derivata gvanidina nadzirata kooperativnost vezave GBTA. Pokazali smo, da se kooperativna vezava ohranja v dimerju Hv1, kjer se CCD loči od segmenta S4, kar nakazuje, da vmesnik med podenotami v CCD ne vpliva neposredno na posredujejo pri alosteričnem spajanju med mesti za vezavo GBTA. V nasprotju s tem ugotavljamo, da je fragment S1 del vmesnika med podenotami in predlagamo razporeditev sosednjih VSD z zunajceličnim koncem vijačnice S4 stran od središča dimerja, kar omogoča da je fragment S1 v odprtem stanju. Zaviralci Hv1 z majhnimi molekulami so uporabni kot zdravila proti raku in nevroprotektivna sredstva. Vendar pa je do danes le malo spojin uspelo inhibirati kanal30,31,32,33. Med njimi je 2-gvanidinobenzimidazol (2GBI, spojina [1] na sliki Ugotovljeno je bilo, da 2-gvanidinobenzotiazol (GBTA, spojina [2] na sliki 1a) blokira prepustnost protonov skozi kanal VSD29,32. prej dokazano, da zavira Hv1 skoraj tako učinkovito kot 2GBI, ko je bil testiran pri koncentraciji 200 μM (slika 1b). Pregledali smo druge derivate tiazola in ugotovili, da nekateri od njih zavirajo kanal s podobno ali večjo močjo kot GBTA (slika 1 in dopolnilo besedilo). Določili smo krivulje koncentracijskega odziva štirih derivatov tiazola (GBTA in spojin [3], [6] in [11], slika 1c) in ugotovili, da so bolj strme od krivulj 2GBI. Hillovi koeficienti (h) derivatov tiazola v razponu od 1,109 ± 0,040 do 1,306 ± 0,033 (sl. 1c in dopolnilna slika 1). V nasprotju s tem je bil Hillov koeficient za 2GBI 0,975 ± 0,024 29, slika 2a in dopolnilna slika 1). Hillov koeficient nad 1 kaže kooperativnost vezave. Ker ima vsaka Hv1 podenota svoj inhibitor- vezavno mesto,29,32 smo sklepali, da bi lahko vezava tiazolnega derivata na eno podenoto okrepila vezavo druge inhibitorske molekule na sosednjo podenoto. GBTA je bila testna spojina z najvišjim Hillovim koeficientom. Zato smo to spojino izbrali za nadalje proučevali mehanizem sinergije vezave in uporabili 2GBI kot referenčno negativno kontrolo. (a) Testne spojine: [1] Referenčni inhibitor Hv1 2-gvanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-gvanidino-benzotiazol (GBTA), [3] (5-trifluorometil-1,3-benzotiazol-2-il)gvanidin, [4] nafto[1,2-d][1,3] tiazol-2-il -gvanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)gvanidin, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol-2-il)gvanidin, [7] famotidin, [8] etil ester 2-gvanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilne kisline, [9] 2-gvanidino-4-metil etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10 ](2-gvanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil acetat, [11]1-[4-(4-klorofenil)-1,3-tiazol-2-il]gvanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]gvanidin. (b) Inhibicija aktivnosti človeškega Hv1 z navedenimi gvanidinotiazoli in referenčno spojino 2GBI (modro-zelene črte) Protonski tokovi .Hv1 so bili izmerjeni v obrnjenih plakih oocitov Xenopus kot odziv na depolarizacijo od zadrževalnega potenciala od -80 mV do +120 mV. Vsak inhibitor je bil dodan kopeli v koncentraciji 200 μM. pHi = pHo = 6,0 Podatki so povprečje ± SEM (n≥4). (c) Od koncentracije odvisno zaviranje človeškega Hv1 s spojinami [2], [3], [6] in [11]. Vsaka točka predstavlja povprečno inhibicijo ± SD od 3 do 15 meritev. Črta je prileganje po Hillu, ki se uporablja za pridobitev navideznih vrednosti Kd, navedenih v Dodatni tabeli 1. Hillovi koeficienti so bili določeni iz prileganja, navedenih v Dodatni sliki 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (glej metode). (a,b) Spojini 2GBI in GBTA sta inhibirali dimerni in monomerni Hv1 na način, ki je odvisen od koncentracije. Vsaka točka predstavlja povprečno inhibicijo ± SD 3 do 8 meritev, krivulja pa je Hill fit. Hillovi koeficienti (h), prikazani v vstavljeni histogrami so bili določeni iz prileganja, navedenih na dodatnih slikah 3 in 4. Koncentracijski odziv GBTA, prikazan na (a), je enak tistemu na sliki 1c. Za navidezne vrednosti Kd glejte dodatno tabelo 1. (c) Modeliranje kooperativna vezava GBTA na dimerni Hv1. Polna črna črta predstavlja prileganje eksperimentalnim podatkom z enačbo (6), ki opisuje model vezave, prikazan v (d). Črtkani črti, označeni s Sub 1 in Sub 2, predstavljata bimolekularno povezavo -disociacijske ravnotežne krivulje prvega oziroma drugega vezavnega dogodka (Pod1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Pod2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Shematski diagram predlaganega mehanizma bloka Hv1. V primeru GBTA vezava na eno odprto podenoto poveča afiniteto sosednje odprte podenote (Kd2 0,05) zmanjšanje Hillovega koeficienta vezave GBTA na kanale GGG v primerjavi z divjim tipom (slika 5c), kar nakazuje, da kljub njegovi vlogi pri ohranjanju Dve podenoti skupaj sta pomembni, vendar CCD ne posreduje neposredno medpodenotnega alosteričnega spajanja med veznimi mesti GBTA. (a) Shematski diagram dimera Hv1 z mutacijo triglicina na notranjem koncu S4, ki je zasnovana tako, da prekine spajanje med podenotami, posredovano s citoplazmatsko zvito zvito domeno (modre puščice). (b) Shematski prikaz dimerjev Hv1 in ligacijskih dimerjev z označene mutacije, namenjene testiranju fragmentov S1, ki sodelujejo pri spajanju med podenotami (modre puščice). (c–h) 2GBI (cian) in GBTA (temno rdeča) zavirata navedene konstrukte na način, odvisen od koncentracije. Vsaka točka predstavlja povprečno inhibicijo ± SD od 3 do 10 meritev. Krivulja je bila Hill fit, ki je bila uporabljena za pridobitev navideznih vrednosti Kd ​​(glejte dodatno tabelo 1). Hillovi koeficienti v interpoliranih histogramih so bili določeni, kot je opisano v razdelku Metode (glejte dodatni sliki 3 in 4). Referenčne vrednosti h za Hv1 WT so prikazane kot črtkane črte. Zvezdice označujejo statistično značilne razlike med prehodi mutantov in WT (p 0,05, slika 5d,i ) ). Po drugi strani pa je mutacija D123A znatno zmanjšala Hillov koeficient GBTA (p 0,05/14). Ker je nevtralizacija naboja na položaju 123 na obeh podenotah povzročila močno spremembo kooperativnosti vezave GBTA, medtem ko je imelo obračanje naboja na obeh podenotah le majhen učinek, smo analizo razširili tako, da je vključevala samo eno podenoto z inverzijskim kanalom naboja. generirali Hv1-povezane dimere s substitucijo D123R v C-terminalni podenoti (slika 5b) in izmerili inhibicijo odziva koncentracije z GBTA in 2GBI. Ugotovili smo, da je bil Hillov koeficient vezave GBTA na kanale WT-D123R znatno višji od tistega divjega tipa Hv1 (p 0,05). Ugotovili smo tudi, da je bil v odsotnosti βME Hillov koeficient vezave GBTA na dimer D112E I127C Hv1 bistveno višji od tistega, izmerjenega v prisotnosti redukcijskih sredstev (slika 6e in dopolnilna slika 4), kar pomeni, da mutacija D112E ni odpravilo povečanja kooperativnosti vezave GBTA, ki je posledica navzkrižnega povezovanja cisteina 127. Na Hillov koeficient vezave 2GBI na dimerja D112E, I127C Hv1 prav tako ni pomembno vplivala mutacija D112E (slika 1). 6d in dopolnitev Slika 3). Te ugotovitve skupaj kažejo, da je vezava GBTA okrepljena z interakcijo med zunanjimi konci fragmentov S1 v sosednjih podenotah Hv1 prek privlačnih elektrostatičnih interakcij ali prek tvorbe kovalentnih vezi med substituiranimi cisteini. Alosterična sklopitev med mesti se poveča in povzroči kooperativnost vezave. Medtem ko je učinek privlačnih elektrostatičnih interakcij na kooperativnost mogoče odpraviti z mutacijo D112E, učinek kovalentnih vezi ne more. Pri našem raziskovanju kemijskega prostora, ki je na voljo za vezavo gvanidinskih derivatov na kanale Hv1, smo ugotovili, da imajo 2-gvanidinotiazoli, kot je GBTA, bolj strmo odvisnost od koncentracije kot 2-gvanidinobenzimidazoli (slika 1c). Analiza Hillovega koeficienta vezave GBTA na oba dimerna in monomernih kanalov (sl. 2a, b) ter na dimerni kanal, v katerem je bila ena podenota predhodno vezana na zaviralec (sl. 4), nas je vodilo do zaključka, da je inhibicija Hv1 z GBTA Delovanje sinergističen proces in vezavna mesta spojin v obeh podenotah so alosterično sklopljena. Odkritje, da se GBTA veže na odprti kanal, kot je bilo prej prikazano za sorodno spojino 2GBI32, nakazuje, da je mogoče alosterično spajanje posebej oceniti v odprtem stanju. Naš model kooperativne vezave je lahko kvantitativno opisal inhibicijo HV1 z GBTA (slika 2C) in razložil različne učinke 2GBI in GBTA na razpadanje kanalnih repnih tokov po membranski repolarizaciji, ki podpira našo razlago procesa vezave. Največji koeficient hriba, ki ga je mogoče doseči v alosteričnem proteinu z dvema vezavnima mestoma (kot je HV1) Sinergistična prosta energija, razlika med vezanimi prostimi energijami najnižjih in najvišjih afinitetnih mest (glej metode), je bila 1,3 kcal/mol v primeru divjega tipa HV1 in 2,7 kcal/mol v primeru HV1 I127C.Ti vezava kisika do hemoglobina je najbolj znan in dobro raziskan primer sodelovalnega procesa38. Za človeški hemoglobin (tetramer s štirimi alosterično povezanimi vezivnimi mesti) se koeficient hriba giblje od 2,5-3,0, z vrednostmi od 1,26 do 3,64 KCAL/MOL, odvisno od eksperimentalnih pogojev38.To, glede na globalno energijo, kooperativnost vezave GBTA na HV1 ni bistveno drugačna kot pri vezavi O2 na hemoglobin, kadar se upošteva različno število beljakovinskih podenot v obeh sistemih. V našem sinergijskem modelu vezava molekul GBTA na eno podenoto povzroči povečanje vezavne afinitete sosednje podenote. Predvidevamo postopek, v katerem preureditev vezavnega okolja, ki izhaja iz prvega vezivnega dogodka (inducirano prileganje), vodi do Spremembe interakcij med podenotami. V odzivu na te spremembe sosednje podenote spreminjajo svoja vezavna mesta, kar ima za posledico tesnejšo vezavo GBTA. Glede na ta postopek je S1 Aspartate D112 odgovoren za preureditev mesta vezave, povezano s povečano vezavo afiniteto.D112 je bilo prej prikazano, da je del poti permeacije HV1 protona in deluje kot filter selektivnosti27,28. Naši rezultati kažejo, da so filtri za selektivnost v obeh podenotah HV1 alosterično povezani v odprtem stanju. Slika 7A prikazuje približno lokacijo mesta vezave GBTA in lokacijo ostankov D112, D123, K125 in I127 na shemi HV1 VSD, ki temeljijo na HV1 VSD Na kristalni strukturi himere HV1-CIVSP. Smerne smeri za alosterično spajanje, ki vključuje zunajcelični konec S1, so prikazane s črnimi puščicami. (a) Shema HV1 VSD. temelji na kristalni strukturi himere HV1-CIVSP, vijačni segmenti so prikazani kot valjasti. V tej konfiguraciji se notranji konec segmenta S4 združi s CCD (ni prikazano). Predvidene lokacije vezane GBTA so prikazane kot sivi ovali. Black puščice označujejo poti, ki sodelujejo pri alosterični spajanju med veznimi mesti v dveh sosednjih podenotah. Položaji preiskovanih ostankov S1 so označeni z obarvanimi kroglicami. V dveh različnih konfiguracijah dimera, kot je razvidno iz zunajcelične strani membranske ravnine. Na levi plošči je dimer vmesnik tvori S4 helix Ločitev zunanjih koncev obeh vijačnic S4 (črtkane puščice), ustvari razporeditev, prikazano na desni strani. V tej konfiguraciji se lahko ostanki D123 in I127 iz sosednjih podenot zbližata. (C) Shematski prikaz civije VSD V konfiguraciji dimerja, ki jo najdemo v kristalni strukturi 4G80. Pozicija P140 v civsp ustreza položaju D123 v HV1. Naši rezultati kažejo, da je odbojna elektrostatična interakcija med ostankom 123 (123D/123D ali 123R/123R) povezana z "normalno" stopnjo kooperativnosti, ki veže GBTA v odprtem stanju in preusmeri interakcijo iz odbojnosti v privlačnost (123D/123r) , povečano sodelovanje (slika 5G). Pričakuje se, da bo odstranitev odbojne interakcije z substitucijo alanina tudi privedla do povečane zadruge. Kljub explanation is that the destabilizing effect of placing hydrophobic residues in a hydrophilic environment may outweigh the stabilizing effect due to the elimination of repulsive interactions between D123 residues, resulting in an overall reduction in binding cooperativity.Mony et al.39 recently reported that solvent accessibility at Položaj D171 Ciona Gutis Ci-HV1 (ki ustreza D123 v človeškem HV1) se po aktivaciji poveča, kar podpira idejo, da se D123 nahaja v hidrofilnem okolju v odprtem stanju. Znano je, da se z več prehodi pojavljajo z več prehodi19,20,26,39,40,41.qiu et al26 , ki mu je sledil izrazit prehod, ki povzroči, da protoni odpirajo prevodnost na obeh podenotah. Konformacijska sprememba senzorja napetosti smo spremljali s fluorescenco napetosti in ugotovili so, da je bil drugi prehod selektivno moten z mutacijo v položaju D171. Modele fluorescentnega signala je skladno s prisotnostjo elektrostatičnih interakcij med ostanki D171 sosednjih podenot v nekem trenutku vzdolž reakcijskih koordinat konformacijske spremembe. Ta razlaga je skladna in posreduje alosterično spajanje med mesta vezave GBTA. Fujiwara in sod. Celotna VSD in funkcionalna analiza regije, ki povezuje vijačnico S4 in CCD. V odsotnosti transmembranskega pH gradienta HV1 potrebuje veliko membranske depolarizacije, da se odpre, in cisteinsko prekrivanje se pojavi pod pogoji, kjer je kanal pretežno zaprt. Zato odkrit vmesnik S4-S4 verjetno odraža konfiguracijo podenote zunaj države. Druge študije so našle dokaze o vključevanju S1 in S2 v interakciji medsebojne različice med gangiranjem17,21,26, kar kaže na to, da lahko kanali sprejmejo različne konfiguracije podenote na odprtem in odprtem in Zaprta država, ideja, ki je skladna z ugotovitvami Mony in sod. S1 se premika 39 med gantiranjem. Tukaj pokažemo, da so v odprtem stanju zunajcelični konci vijačnice S1 dovolj blizu, da podpirajo neposredne elektrostatične interakcije, ki posredujejo alosterično spajanje med podenotami. V konfiguraciji dimera s podaljšanimi interakcijami S4-S4 so vijake S1 preveč daleč Poleg neposredne interakcije. Kljub temu je 20 ° v smeri urinega kazalca rotacija obeh podenot VSD okoli osi, pravokotne na membransko ravnino, v kombinaciji z ločitvijo zunanjih koncev obeh vijačnic S4, je dal konfiguracijo S1-S1 dosledno Z našimi ugotovitvami (slika 7B, desna plošča). Priporočamo to konfiguracijo za kanal v odprtem stanju. Čeprav se domneva, da encim civsp deluje kot monomer, je kristalna struktura njegovega izoliranega VSD zajeta v dimerjevem stanju. Zunanji konci S1 vijačnic v tem dimerju so prostorsko blizu, celotna konfiguracija pa je podobna predlaganim Za HV1 (slika 7C). V civilnem dimerju je bil najbližji ostanek iz sosednje podenote prolin na položaju 140 (slika 7C). Zanimivo, p140 v civsp ustreza položaju D123 v HV1.The podobnosti v konfiguraciji podenote med HV1 in civsp dimerji kažejo, da imajo VSD teh beljakovin notranjo težnjo po tvorbi vmesnika, kjer medsebojno medsebojno delujejo zunajcelični konci S1. Bistvena vloga HV1 pri aktivaciji semenčic naredi ta kanal privlačna tarča zdravila za nadzor moške plodnosti. Furthermore, aktiviranje HV1 v mikrogliji se je pokazalo, da poslabša okrevanje iz ishemične kapi. Preživetje pri bolnikih z dojko 12 ali kolorektalnim rakom 13 in naj bi prispevalo k malignostim B-celic 11. Zato se lahko majhna molekularna zdravila, ki ciljajo na HV1 Odprta podenota HV1, ki vodi do povečane vezavne afinitete, lahko privede do razvoja močnejših zdravil, ki ciljajo na kanale HV1. Mutageneza človeškega HV1, usmerjena na mesto, je bila izvedena s standardnimi tehnikami PCR. V konstruktu HV1NCCIVSP so ostanke 1-96 in 228-273 HV1 nadomestili z ostanki 1-113 in 240-576 civisp18. v dimeru, vezanem na HV1, HV1, vezani na HV1, ki je povezan s HV1, ki je povezan s HV1, ki je vezan na HV1, ki je vezan na HV1, in 240-576. C-konec ene podenote je povezan z N-koncu druge podenote prek GGSGGSGSGSGGGSGG Linkerja. PGEMHE plazmidi, ki vsebujejo različne konstrukte T7 MMessage MMachine Transcription Kit (Ambion) .1-3 dni pred elektrofiziološkimi meritvami je bila CRNA vbrizgana v oocite ksenopusa (50 NL na celico, 0,3-1,5 μg/μl). Stost V in VI Oocite iz Xenopus laevis (NASCO) Iz bioznanosti z ekociti. Naravni injiciranje RNA smo celice vzdrževali v mediju ND96, ki vsebuje 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM Cacl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM Pyruvate, 100 μg/ml genticin, ph 7, 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-gvanidino-benzotiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) gvanidin [5], (5-bromo-4 -metil-1,3 -Thiazol-2-il) gvanidin) [6], etil 2-gvanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilat [8], etil 2-gvanidino-4-metil-1,3-tiazol- 5-karboksilat [9] in (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) etil acetata [10] sta bila iz Sigma-Aldrich.Famotidin [7] iz biomedical MP.1- [4 -(4-klorofenil) -1,3-tiazol-2-il] gvanidin [11] in 1- [4- (3,4-dimetoksifenil) -1,3- tiazol-2-il] gvanidin [12] iz Matrix Scientific. Te spojine so najvišje čistosti, ki so na voljo v komercialno. Vsaj 99% čistosti. Do suspenzije 2-amino-4- (trifluorometil) benzenetiol hidroklorida (1,02 g, 4,5 mmol) v 25 ml vodne klorovodikove kisline (2,5 N) dodamo trdno diciadiamid (380 Mg, 4,5 mmol) in rezultat heterogenosnega mmol) in posledično heterogenos 4 ure smo refluksirali z živahnim mešanjem. Reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo in nevtraliziramo s postopnim dodajanjem 10n kalijevega hidroksida. Belo oborino tvorjeno je bilo filtrirano, oprano s hladno vodo (3 × 50 ml), posušeno v pečici (3 × 50 ml) 65 ° C) več ur in nato prekristalizirano iz etil acetata/naftnega etra, da se da bela trdna snov (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (svetloba 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7,25 (zelo široka s, 4 h), 7,40 (d, 1 h, j = 8,1 Hz), 7,73 (s, 1 h), 7,92 (d , 1 h, j = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): δ = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (q, j, j, j, j, j. = 272 Hz), 126,1 (q, j = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): M/z izračunana vrednost : 261.0419. Naphtho [1,2-D] tiazol-2-amina (300 mg, 1,5 mmol), sintetiziranega, kot je bilo opisano prej, segrevamo na 200 ° C v oljni kopeli v majhni epruveti.300 mg (velik presežek) cianamid in cianamid in 1,0 ml Conc. Za vročo spojino smo hitro dodali klorovodikovo kislino in mešanico hranili v oljni kopeli približno 2 minuti, v tem času pa je večina vode izhlapela. Reakcijsko zmes smo nato ohladili na sobno temperaturo in posledično utrjeni material smo razdelili na majhne koščke in oprali z vodo, da bi zagotovili bledo rumeno amorfno trdno snov. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7,59 (T, 1 h, J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (d, 1 h, j = 8,6 Hz), 8,02 (d, 1 h, j = 8,2 Hz), 8,35 (d, 1 h, j = 8,3 Hz) .13c NMR (150 MHZ, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/z izračunano vrednost C12H11N4 (M + H) +: 243.069999999 , Najdeno: 243.0704. Protonski tokovi so bili izmerjeni v notranjih in zunanjih obližih oocitov, ki izražajo različne konstrukte z uporabo ojačevalnika AxoPatch 200B, ki ga nadzira Axon Digidata 1440A (molekularne naprave) s programsko opremo PCLAMP10.intracelularna in ekstracelična rešitev ima enaka sestava: 100 mm 2- (N-Morpholino ) etanesulfonska kislina (MES), 30 mM tetraetilamonijev (čaj) mesilat, 5 mM čajnega klorida, 5 mM etilen glikol-bis (2-aminoetil) -N, N, N, N'-tetraacetska kislina (EGTA) pH 6,0 s čajnim hidroksidom. Vse meritve so bile izvedene pri 22 ± 2 ° C. Pipeta ima dostopno odpornost 1,5–4 mΩ. Sledi so filtrirali pri 1 kHz, vzorčene pri 5 kHz in analizirali z ClampFit10.2 (molekularne naprave ) in izvor8.1 (OriginLab). Raztopine, ki vsebujejo različne koncentracije zaviralca HV1 in v nekaterih primerih 10 mM βME v kopel z gravitacijo vnesemo s pomočjo razdelilnika, povezanega s sistemom perfuzijskega ventila VC-6 (Warner instru.) Tranzistor logika) signali.rapidni perfuzijski poskusi so bili izvedeni z uporabo več cevi perfuzijskega svinčnika (avtomatizacijo Sci.) Z konico za dostavo premera 360 μm, nameščeno pred pipeto. +120 mV depolarizacijske impulze.GV meritve so bile izvedene, kot je bilo predhodno opisano18,20.Tail tokovi so bili zabeleženi pri -40 mV po korakih depolarizacije pri različnih napetostih od -20 mV do +120 mV, razen če ni drugače navedeno. Referenčni impulz pred preskusnim impulzom je Uporablja se za popravljanje trenutnega razpada 18. Graf GV ustreza Boltzmannovi enačbi: navidezne disociacijske konstante (KD) za različne kombinacije kanalov in inhibitorjev (dodatna tabela 1) smo določili z namestitvijo odvisnosti koncentracije inhibicije (povprečne vrednosti inhib) Z enačbo hriba: kjer je [i] koncentracija zaviralca I in H koeficient hriba. Če želite izračunati koeficient hriba, je enačba (2) preurejena kot: