Förfrågning av intersubunit-gränssnittet för den öppna Hv1-protonkanalen med en allosteriskt kopplad sond

Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat stöd för CSS. För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller stänger av kompatibilitetsläget i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt support kommer vi att visa webbplatsen utan stilar och JavaScript. Den spänningsstyrda protonkanalen Hv1 är ett dimeriskt komplex som består av två spänningsavkännande domäner (VSDs), som var och en innehåller en gated protonpermeationsväg.Dimerisering styrs av den cytoplasmatiska coiled-coil-domänen. Övergången från slutet tillstånd till det öppna tillståndet i båda VSD:erna är känt för att inträffa kooperativt; men lite är känt om de underliggande mekanismerna. Intersubunit-gränssnitt spelar en nyckelroll i allosteriska processer; sådana gränssnitt har dock inte identifierats i öppna Hv1-kanaler. Här visar vi att 2-guanidinotiazolderivat blockerar två Hv1 VSDs på ett samarbetssätt och använder en av dessa föreningar som en sond för allosterisk koppling mellan öppna subenheter. Vi fann att den extracellulära änden av det första transmembranfragmentet av VSD bildar ett intersubunit-gränssnitt som förmedlar koppling mellan bindningsställen, medan coiled-coil-domänen inte är direkt involverad i denna process. Vi hittade också starka bevis för att kanalens protonselektiva filter kontrollerar blockerarebindande kooperativitet . Spänningsstyrda protonkanaler spelar viktiga roller i en mängd olika organismer, från växtplankton till människor1. I de flesta celler medierar dessa kanaler protonutflöde från protonmembranet och reglerar aktiviteten av NADPH-oxidas. Den enda kända spänningsstyrda protonkanalen hos människor är Hv1, som är produkten av HVCN1-genen2,3.Hv1 (aka VSOP) har visat sig spela en roll i B-cellsproliferation4, produktion av reaktiva syrearter av det medfödda immunsystemet5,6,7,8, spermieceller motilitet9 och pH-reglering av luftvägsytvätska10. Denna kanal är involverad i flera Överuttryckta i cancertyper såsom B-cellsmaligniteter4,11 och bröst- och kolorektalcancer12,13. Överdriven Hv1-aktivitet visade sig öka den metastaserande potentialen hos cancerceller 11, 12. I hjärnan uttrycks Hv1 av mikroglia, och dess aktivitet har visat sig förvärra hjärnskador i modeller av ischemisk stroke. Hv1-proteinet innehåller en spänningsavkännande domän (VSD), som består av fyra transmembransegment som kallas S1 till S414. VSD:n liknar motsvarande domäner av spänningsstyrda Na+, K+ och Ca2+ kanaler och spänningskänsliga fosfataser, såsom CiVSP från Ciona gutis15. I dessa andra proteiner är C-terminalen av S4 fäst till en effektormodul, pordomänen eller enzymet. I Hv1 är S4 kopplad till coiled-coil-domänen (CCD) belägen på den cytoplasmatiska sidan av membranet .Kanalen är ett dimeriskt komplex bestående av två VSD, som var och en innehåller en gated protonpermeationsväg16,17,18. Dessa två Hv1-subenheter visade sig öppnas kooperativt19,20,21,22, vilket tyder på att allosterisk koppling och inter-subenhetsinteraktioner spelar en viktig roll i grindprocessen. Gränssnittet mellan underenheterna inom den lindade spoldomänen är väldefinierad eftersom kristallstrukturerna för de två isolerade domänerna är tillgängliga22,23. Å andra sidan är gränssnittet mellan VSD:er i membranet inte väl förstått. Kristallstrukturen hos det chimära Hv1-CiVSP-proteinet ger inte information om detta gränssnitt, eftersom den trimera organisationen av det kristalliserade kanalkomplexet kan vara resultatet av ersättningen av den nativa Hv1 CCD med jästleucinblixtlåset GCN424. En nyligen genomförd studie av Hv1-kanalens underenhetsorganisation drog slutsatsen att två S4-helixar övergår till CCD utan allvarliga störningar av sekundärstrukturen, vilket resulterar i långa helixar som startar från membranet och skjuter ut i cytoplasman. Baserat på cysteintvärbindningsanalys, denna studie föreslår att Hv1 VSD:er kontaktar varandra längs S4-segmentet. Andra studier har dock föreslagit alternativa gränssnitt mellan VSD:er. Dessa gränssnitt inkluderar S1-segment 17, 21, 26 och de yttre ändarna av S2-segment 21. En möjlig orsak till konflikten Resultaten av dessa studier är att allosterisk koppling mellan VSD:er undersöktes i relation till gatingprocessen, som beror på de stängda och öppna tillstånden, och gränssnittet mellan VSD:er kan variera i olika tillståndsförändringar i konformation. Här fann vi att 2-guanidinotiazol hämmar Hv1-kanaler genom att synergistiskt binda till två öppna VSD, och använde en av föreningarna, 2-guanidinobensotiazol (GBTA), för att undersöka interaktionen mellan subenheter i öppet tillstånd. Vi fann att GBTA-bindningskurvan kan beskrivas väl av en kvantitativ modell där bindning av en inhibitor till en subenhet resulterar i en ökning av bindningsaffiniteten för den intilliggande subenheten. Vi fann också att resterna D112, selektivitetsfiltrerar för kanal 27, 28 och en del av guanidinderivatets bindningsställe 29 kontrollerar GBTA-bindningskooperativitet. Vi visar att kooperativ bindning upprätthålls i Hv1-dimeren, där CCD separerar från S4-segmentet, vilket tyder på att intersubunit-gränssnittet i CCD inte direkt förmedla allosterisk koppling mellan GBTA-bindningsställen. Däremot finner vi att S1-fragmentet är en del av gränssnittet mellan subenheterna och föreslår ett arrangemang av intilliggande VSD:er med den extracellulära änden av S4-helixen bort från dimerens mitt för att möjliggöra S1-fragmentet ska vara i öppet tillstånd. Småmolekylära hämmare av Hv1 är användbara som anticancerläkemedel och neuroprotektiva medel. Men hittills har få föreningar kunnat hämma kanalen30,31,32,33. Bland dem är 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, förening [1] i fig. 1a) och dess derivat visade sig blockera VSD29,32-permeation av protoner genom kanalen. Bindning av sådana föreningar tros ske oberoende av de två öppna underenheterna.2-guanidinobensotiazol (GBTA, förening [2] i figur 1a) var tidigare visat sig hämma Hv1 nästan lika effektivt som 2GBI när den testades i en koncentration av 200 μM (Figur 1b). Vi undersökte andra tiazolderivat och fann att några av dem hämmade kanalen med liknande eller större styrka än GBTA (Fig. 1 och kompletterande text). Vi bestämde koncentrationssvarskurvorna för fyra tiazolderivat (GBTA och föreningar [3], [6] och [11], Fig. 1c) och fann att de var brantare än de för 2GBI. Hill-koefficienterna (h) av tiazolderivat varierade från 1,109 ± 0,040 till 1,306 ± 0,033 (Fig. 1c och kompletterande Fig. 1). Däremot var Hill-koefficienten för 2GBI 0,975 ± 0,024 29, Fig. 2a och Kompletterande Fig. 1). En Hill-koefficient över 1 indikerar bindande kooperativitet. Eftersom varje Hv1-subenhet har sin egen inhibitor- bindningsställe,29,32 resonerade vi att bindningen av ett tiazolderivat till en subenhet kunde förstärka bindningen av en andra inhibitormolekyl till den intilliggande subenheten. GBTA var testföreningen med den högsta Hill-koefficienten. Därför valde vi denna förening för att studera mekanismen för bindningssynergi ytterligare och använde 2GBI som en negativ referenskontroll. (a) Testföreningar: [1] Referens Hv1-hämmare 2-guanidino-bensimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-bensotiazol (GBTA), [3] (5-trifluormetyl-1,3-bensotiazol-2-yl)guanidin, [4] nafto[1,2-d][1, 3] tiazol-2-yl -guanidin, [5](4-metyl-1,3-tiazol-2-yl)guanidin, [6](5-brom-4-metyl-1,3-tiazol-2-yl)guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metyl-1,3-tiazol-4-karboxylsyraetylester, [9] 2-guanidino-4-metyl Etyl-1,3-tiazol-5-karboxylat, [10 ](2-guanidino-4-metyl-1,3-tiazol-5-yl)etylacetat, [11]1-[4-(4-klorfenyl)-1,3-tiazol-2-yl]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoxifenyl)-1,3-tiazol-2-yl]guanidin.(b) Inhibering av human Hv1-aktivitet av de angivna guanidinotiazolerna och referensföreningen 2GBI (blågröna staplar) .Hv1-protonströmmar mättes i plack av Xenopus oocyter inifrån och ut som svar på depolarisering från en hållpotential på -80 mV till +120 mV. Varje inhibitor sattes till badet i en koncentration av 200 μM.pHi = pHo = 6,0 .Data är medelvärde±SEM (n≥4).(c) Koncentrationsberoende hämning av humant Hv1 av föreningarna [2], [3], [6] och [11]. Varje punkt representerar medelinhiberingen ± SD av 3 till 15 mätningar. Linjen är en Hill-passning som används för att erhålla de skenbara Kd-värdena som rapporteras i tilläggstabell 1. Hill-koefficienter bestämdes från passningarna som rapporterats i tilläggsbild 1: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (se Metoder). (a,b) Föreningarna 2GBI och GBTA hämmade dimer och monomer Hv1 på ett koncentrationsberoende sätt. Varje punkt representerar medelinhiberingen ± SD av 3 till 8 mätningar och kurvan är en Hill-passning. Hill-koefficienterna (h) visas i de infällda histogrammen bestämdes från de passningar som rapporterats i de kompletterande figurerna 3 och 4. Koncentrationssvaret för GBTA som visas i (a) är detsamma som det i figur 1c. Se tilläggstabell 1 för uppenbara Kd-värden. (c) Modellering av den kooperativa bindningen av GBTA till dimer Hv1. Den heldragna svarta linjen representerar anpassningen till experimentdata genom ekvation (6), som beskriver bindningsmodellen som visas i (d). De streckade linjerna märkta Sub 1 och Sub 2 representerar den bimolekylära associationen -dissociationsjämviktskurvor för de första respektive andra bindningshändelserna (Sub 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Schematiskt diagram av den föreslagna mekanismen för Hv1-blocket. När det gäller GBTA ökar bindning till en öppen subenhet affiniteten för den intilliggande öppna subenheten (Kd2 0,05) minskning av Hill-koefficienten för GBTA-bindning till GGG-kanaler jämfört med vildtyp (Fig. 5c), vilket tyder på att trots dess roll i att behålla två underenheter tillsammans viktiga, men CCD förmedlar inte direkt allosterisk koppling mellan underenheter mellan GBTA-bindningsställen. (a) Schematiskt diagram av Hv1-dimeren med en triglycinmutation vid den inre änden av S4 utformad för att störa kopplingen mellan subenheter som förmedlas av den cytoplasmatiska lindade spoldomänen (blå pilar).(b) Schematisk representation av Hv1-dimerer och ligationsdimerer med indikerade mutationer, utformade för att testa S1-fragment involverade i koppling mellan subenheter (blå pilar).(c–h) 2GBI (cyan) och GBTA (mörkrött) hämmar de indikerade konstruktionerna på ett koncentrationsberoende sätt. Varje punkt representerar den genomsnittliga hämningen ± SD av 3 till 10 mätningar. Kurvan var en Hill fit som användes för att erhålla skenbara Kd-värden (se tilläggstabell 1). Hill-koefficienter i de interpolerade histogrammen bestämdes enligt beskrivningen i avsnittet Metoder (se tilläggsfigurerna 3 och 4). Referens h-värden för Hv1 WT visas som streckade linjer. Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan mutant- och WT-passager (p 0,05, Fig. 5d,i) ). Å andra sidan reducerade mutation D123A signifikant Hill-koefficienten för GBTA (p 0,05/14). Eftersom neutralisering av laddningen vid position 123 på båda underenheterna resulterade i en kraftig förändring i GBTA-bindande kooperativitet, medan omkastning av laddningen på båda underenheterna endast hade en liten effekt, utökade vi analysen till att omfatta endast en underenhet med inversionskanalen för laddning. genererade Hv1-kopplade dimerer med D123R-substitution i den C-terminala subenheten (fig. 5b) och mätte koncentration-respons-hämningen av GBTA och 2GBI. Vi fann att Hill-koefficienten för GBTA-bindning till WT-D123R-kanaler var signifikant högre än så av vildtyp Hv1 (p 0,05). Vi fann också att i frånvaro av βME var Hill-koefficienten för GBTA-bindning till D112E I127C Hv1-dimeren signifikant högre än den som uppmättes i närvaro av reduktionsmedel (fig. 6e och kompletterande fig. 4), vilket antyder att D112E-mutationen avskaffade inte ökningen av GBTA-bindande kooperativitet till följd av tvärbindningen av cystein 127. Hill-koefficienten för 2GBI-bindning till D112E, I127C Hv1-dimerer påverkades inte heller signifikant av D112E-mutationen (Figur 1).6d och kompletterande Fig. 3). Sammantaget tyder dessa fynd på att GBTA-bindning förstärks av interaktionen mellan de yttre ändarna av S1-fragment i intilliggande Hv1-subenheter genom attraktiva elektrostatiska interaktioner eller genom bildandet av kovalenta bindningar mellan substituerade cysteiner Allosterisk koppling mellan platser ökar och resulterar i bindningskooperativitet. Medan effekten av attraktiva elektrostatiska interaktioner på kooperativitet kan avskaffas genom mutation D112E, kan effekten av kovalenta bindningar inte. I vår utforskning av det kemiska utrymmet som är tillgängligt för att binda guanidinderivat till Hv1-kanaler, fann vi att 2-guanidinotiazoler som GBTA har ett brantare koncentrationsberoende än 2-guanidinobenzimidazoler (Fig. 1c). Hill-koefficientanalysen av GBTA-bindning till båda de dimera och monomera kanaler (Fig. 2a,b) och till den dimera kanalen i vilken en subenhet var förbunden till inhibitorn (Fig. 4) ledde oss till slutsatsen att hämningen av Hv1 av GBTA. Verkan är en synergistisk process, och bindningsställena för föreningarna i de två subenheterna är allosteriskt kopplade. Upptäckten att GBTA binder till den öppna kanalen, som tidigare visats för den relaterade föreningen 2GBI32, tyder på att allosterisk koppling kan bedömas specifikt i öppet tillstånd. Vår samarbetsmodell för bindning kunde kvantitativt beskriva hämningen av HV1 av GBTA (fig. 2C) och förklara de olika effekterna av 2GBI och GBTA på förfallet av kanalens svansströmmar efter membranutveckling, som stöder vår tolkning av bindningsprocessen. Den maximala kullkoefficienten som kan uppnås i ett allosteriskt protein med två bindningsställen (såsom HV1) är 2. Vi mätte GBTA för att binda HV1-vildtyp med en koefficient på 1,31, som ökade till 1,88 i HV1 I127C.The Synergistisk fri energi, skillnaden mellan de bindande fria energierna hos de lägsta och högsta affinitetsplatserna (se metoder) var 1,3 kcal/mol i fallet med hv1 vildtyp och 2,7 kcal/mol i fallet med HV1 I127C.Bindningen av syre till hemoglobin är det mest kända och väl studerade exemplet på samarbetsprocessen38. För humant hemoglobin (en tetramer med fyra allosteriskt kopplade bindningsställen), varierar kullkoefficienten från 2,5-3,0, med värden som sträcker sig från 1,26 till 3,64 kcal/mol, beroende på experimentella förhållanden38.Det, i termer av global energik, är kooperativiteten för GBTA -bindning till HV1 inte väsentligt annorlunda än O2 -bindningen till hemoglobin när de olika proteinsubenheterna i de två systemen beaktas. I vår synergimodell resulterar bindningen av GBTA -molekyler till en underenhet i en ökning av bindningsaffiniteten hos den intilliggande underenheten. Förändringar i interaktioner mellan underenheter. Som svar på dessa förändringar ändrar angränsande underenheter sina bindningsställen, vilket resulterar i stramare GBTA -bindning. visades tidigare vara en del av HV1 -protongenomträngningsvägen och att fungera som selektivitetsfilter27,28. Våra resultat visar att selektivitetsfilter i de två HV1 -underenheterna är allosteriskt kopplade i öppet tillstånd. Figur 7A visar den ungefärliga platsen för GBTA -bindningsstället och platsen för rester D112, D123, K125 och I127 på en schematisk av HV1 VSD -baserad På kristallstrukturen hos HV1-CIVSP-chimera.suggested riktningar för allosterisk koppling som involverar den extracellulära änden av S1 visas med svarta pilar. (A) Schematisk av HV1 VSD.Baserad på kristallstrukturen i HV1-CIVSP-chimera, visar de spiralformade segmenten vara cylindrisk. I denna konfiguration smälter den inre änden av S4-segmentet med CCD (ej visat). De förutsagda platserna för bunden GBTA visas som grå ovaler. I två olika dimer -konfigurationer sett från den extracellulära sidan av membranplanet. På den vänstra panelen bildas dimer -gränssnittet av S4 -spiralen. Rotation av de två VSD: erna 20 grader medurs runt en axel vinkelrätt mot membranplanet, tillsammans med av Separation av de yttre ändarna av de två S4 -helikterna (streckade pilar), producerar arrangemanget som visas till höger. I denna konfiguration får resterna D123 och I127 från angränsande underenheter komma nära varandra. (C) Schematisk representation av CIVSP VSD I dimerkonfigurationen som finns i 4G80 -kristallstrukturen. Position P140 i CIVSP motsvarar position D123 i HV1. Våra resultat visar att den avvisande elektrostatiska interaktionen mellan rest 123 (123D/123D eller 123R/123R) är associerad med en "normal" nivå av GBTA-bindande kooperativitet i öppet tillstånd och förskjuter interaktionen från avvisande till attraktas (123d/123R) , ökat samarbete (fig. 5G). Det förväntas att avlägsnande av den avvisande interaktionen med alaninsubstitution också skulle leda till ökad kooperativitet. En minskning av kooperativiteten för 123A/123A -dimeren observerades (Fig. 5E). En möjlig möjlig Förklaringen är att den destabiliserande effekten av att placera hydrofoba rester i en hydrofil miljö kan uppväga den stabiliserande effekten på grund av eliminering av avvisande interaktioner mellan D123 -rester, vilket resulterar i en övergripande minskning av bindande kooperativitet. Mony et al.39 rapporterade nyligen att lösningsmedelstillgänglighet vid Position D171 av Ciona gutis CI-HV1 (motsvarande D123 i humant HV1) ökas vid aktivering, vilket stödjer uppfattningen att D123 är belägen i en hydrofil miljö i öppet tillstånd. Grindning av HV1-kanaler är kända för att inträffa genom flera övergångar19,20,26,39,40,41.qiu et al26 fann att vid membran depolarisering, spänningssensorn för CI-HV1 genomgår en konformationell förändring som lämnar kanalen aktiverad men fortfarande stängd följt av en distinkt övergång som får protoner att öppna ledningen i båda underenheterna. Konformationella förändringen av spänningssensorn övervakades genom fluorescens för spänningsklämma, och det konstaterades att den andra övergången selektivt stördes av mutationen vid position D171. Störningen av den fluorescerande signalen överensstämmer med närvaron av elektrostatiska interaktioner mellan D171 -resterna av angränsande underenheter vid någon tidpunkt längs reaktionskoordinaterna för den konformationella förändringen. Denna tolkning är förenlig med vår upptäckt att D123 -resterna elektrostatiskt interagerar i öppet tillstånd och förmedlar allosterisk koppling mellan GBTA -bindningsställen. Fujiwara et al25 föreslog att dimergränssnittet för den cytoplasmiska spiralspolningsdomänen sträcker sig in i membranet för att innehålla två S4-helices (Fig. 7B, vänster panel). En modell av denna intersubunitinteraktion är baserad på cystein tvärbindande analys som täcker täckning Hela VSD och funktionell analys av regionen som förbinder S4 -spiralen och CCD. I frånvaron av en transmembran -pH -gradient kräver HV1 -kanaler betydande membrandepolarisering för att öppna, och cystein tvärbindning sker under förhållanden där kanalen är övervägande stängd. Därför återspeglar det detekterade S4-S4-gränssnittet sannolikt off-state-underenhetskonfigurationen. Andra studier har funnit bevis för involvering av S1 och S2 i intersubunitinteraktioner under Gating17,21,26 som tyder på att kanaler kan anta olika underenhetskonfigurationer i det öppna och det öppna och stängda stater, en idé som överensstämmer med resultaten från Mony et al. S1 rör sig 39 under grindning. Här visar vi att de extracellulära ändarna i S1-spiralen i öppet tillstånd är tillräckligt nära för att stödja direkta elektrostatiska interaktioner som förmedlar allosterisk koppling mellan underenheter. I dimer-konfigurationen med utökade S4-S4-interaktioner är S1-helikarna för långt långt Bortsett från varandra för att interagera direkt. Men en 20 ° medurs rotation av de två VSD-underenheterna runt en axel vinkelrätt mot membranplanet, i kombination med separationen av de yttre ändarna av de två S4-helikarna, gav en S1-S1-konfiguration konsekvent konsekvent med våra resultat (Fig. 7B, höger panel). Vi rekommenderar denna konfiguration för kanalen i öppet tillstånd. Även om CIVSP -enzymet tros fungera som en monomer, fångas kristallstrukturen för dess isolerade VSD i ett dimertillstånd. De yttre ändarna av S1 -helikerna i denna dimer är rumsligt nära varandra, och den övergripande konfigurationen liknar den som föreslagits den föreslagna ändarna För HV1 (fig. 7C). I CIVSP -dimeren motsvarade den närmaste återstoden från den intilliggande underenheten vid position 140 (Fig. 7C). Interestande motsvarar p140 i CIVSP POSITION D123 i HV1. Likheten i underenhetskonfiguration mellan HV1 Och CIVSP -dimerer antyder att VSD: erna för dessa proteiner har en inre tendens att bilda ett gränssnitt där de extracellulära ändarna av S1 interagerar. Den väsentliga rollen för HV1 i spermacellaktivering gör denna kanal till ett attraktivt läkemedelsmål för kontroll av manlig fertilitet. Furthermore, aktivering av HV1 i mikroglia har visat sig förvärra återhämtningen från ischemisk stroke. Förbättrad HV1 -aktivitet visade sig vara associerad med lägre lägre Överlevnad hos patienter med bröst 12 eller kolorektal cancer 13 och tros bidra till B-cellens malignitet 11. Därför kan små molekylläkemedel som riktar sig till HV1 användas som neurobeskyddande medel eller anticancerterapi. Upptäckten att guanidinotiazolderivat kan inducera överensstämmande omrankningar i de i de Öppna HV1 -underenheter, vilket leder till ökad bindningsaffinitet, kan leda till utveckling av mer potenta läkemedel som riktar sig till HV1 -kanaler. Platsstyrd mutagenes av human HV1 utfördes med användning av standard PCR-tekniker. I HV1NCCIVSP-konstruktionen ersattes resterna 1-96 och 228-273 av HV1 av rester 1-113 och 240-576 av CIVSP18. I den HV1-länkade dimeren, Dimer, C-terminalen för en underenhet är kopplad till n-terminalen för den andra underenheten genom GGSGGSGSGSGSGG-länkaren. T7 mmessage mmachine transkriptionssats (Ambion) .1-3 dagar före elektrofysiologiska mätningar injicerades CRNA i xenopus oocyter (50 nl per cell, 0,3-1,5 μg/μl). Stage V och Vi-oocyter från xenopus laevis (NASCO) erhölls (NASCO) Från ekocytbioscience. Efter RNA -injektion hölls celler i ND96 -medium innehållande 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 1 mM mgCl, 10 mM HEPE, 5 mM pyruvat, 100 μg/ml gentamik, pH 7,2 18 m C -C . 2-guanidino-bensimidazol [1], 2-guanidino-bensotiazol [2], (4-metyl-1,3-tiazol-2-yl) guanidin [5], (5-brom-4-metyl-1,3 -Thiazol-2-yl) guanidin) [6], etyl 2-guanidino-5-metyl-1,3-tiazol-4-karboxylat [8], etyl 2-guanidino-4-metyl-1,3-tiazol- 5-karboxylat [9] och (2-guanidino-4-metyl-1,3-tiazol-5-yl) etylacetat [10] var från Sigma-Aldrich.famotidin [7] var från MP Biomedics.1- [4 [4 -(4-klorofenyl) -1,3-tiazol-2-yl] guanidin [11] och 1- [4- (3,4-dimetoxifenyl) -1,3-tiazol-2-yl] guanidin [12] var från Matrix Scientific. Dessa föreningar är av den högsta renheten kommersiellt tillgängliga. De upplöstes i torr DMSO för att generera en 100 mM stamlösning, som sedan utspäddes i inspelningslösningen vid önskad slutkoncentration. Minst 99% renhet. Till en suspension av 2-amino-4- (trifluormetyl) bensenetiolhydroklorid (1,02 g, 4,5 mmol) i 25 ml vattenhaltig saltsyra (2,5 N) tillsattes fast dicyandiamid (380 mg, 4,5 mmol), och den resulterande heterogena blandningen återflödades med kraftig omrörning i 4 timmar. Reaktionsblandningen kyldes till rumstemperatur och neutraliserades genom gradvis tillsats av 10n kaliumhydroxid. Den bildade vita fällningen filtrerades, tvättades med kallt vatten (3 × 50 ml), torkades i en ugn ( 65 ° C) under flera timmar och omkristalliseras sedan från etylacetat/petroleumeter för att ge ett vitt fast ämne (500 mg, 48 %); MP 221–222 ° C (ljus 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): 5 [ppm] = 7,25 (mycket bred S, 4 timmar), 7,40 (D, 1 H, J = 8,1 Hz), 7,73 (S, 1 H), 7,92 (D) , 1 timme, J = 8,1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): 5 = 114,2 (D, J = 3,5 Hz), 117,5 (D, J = 3,5 Hz), 121,7, 124,6 (Q, J, J = 272 Hz), 126,1 (Q, J = 272 Hz) = 31,6 Hz), 134,8, 152,1, 158,4, 175,5 : 261.0419. Nafto [1,2-D] tiazol-2-amin (300 mg, 1,5 mmol), syntetiserad som tidigare beskrivits, upphettades till 200 ° C i ett oljebad i ett litet provrör.300 mg (stort överskott) cyanamid och 1,0 ml conc. till den heta föreningen tillsattes saltsyra snabbt och blandningen hölls i oljebadet i cirka 2 minuter, under vilken tid det mesta av vattnet indunstades. Reaktionsblandningen kyldes sedan till rumstemperatur och det resulterande stelnade materialet bröts i små bitar och tvättades med vatten för att ge ett ljusgult amorft fast ämne. (38 mg, 10%) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): 5 [ppm] = 7,59 (t, 1 h, J = 8,2 Hz), 7,66 (t, 1 h, j = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1 h , J = 8,6 Hz), 7,89 (D, 1 H, J = 8,6 Hz), 8,02 (D, 1 H, J = 8,2 Hz), 8,35 (D, 1 H, J = 8,3 Hz) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119,9, 122,7, 123,4, 123,6, 126,5, 127,1, 128,7, 132,1, 140,7, 169,1.HRMS (ESI): M/Z beräknat värde. För C12H11N4S (M + H) +: 243.0699 , hittade: 243.0704. Protonströmmar mättes i inre och externa plåster av oocyter som uttryckte olika konstruktioner med användning av en Axopatch 200B-förstärkare som styrs av en axon digidata 1440A (molekylära enheter) med PCLAMP10-programvara. Inintracellulära och extrakellulära lösningar har samma sammansättning: 100 mm 2- (N-morpholino ) Etansulfonsyra (MES), 30 mM tetraetylammonium (TEA) mesylat, 5 mM TEA-klorid, 5 mM etylenglykol-Bis (2-aminoetyl) -n, N, N ', N'-tetraättiksyra (EGTA), justerad till till till pH 6,0 med tehydroxid. Alla mätningar utfördes vid 22 ± 2 ° C. Pipetten har en åtkomstmotstånd på 1,5–4 MΩ.Current -spår filtrerades vid 1 kHz, samplades vid 5 kHz och analyserades med Clampfit10.2 (molekylära anordningar ) och Origin8.1 (OriginLab). Lösningar innehållande olika koncentrationer av HV1-hämmare och i vissa fall infördes 10 mM ßME i badet genom tyngdkraften genom en grenrör ansluten till ett VC-6-perfusionsventilsystem (Warner Instr.), Som passerade genom PCLAMP-programvaran TTL (transistor-- Transistor logik) signaler. Rapid-perfusionsexperiment utfördes med användning av en perfusionspennor med flera rör. +120 mV depolariserande puls.GV -mätningar utfördes som tidigare beskrivits18,20.tailströmmar registrerades vid -40 mV efter depolariseringssteg vid olika spänningar från -20 mV till +120 mV om inte annat anges. Referenspulsen föregående testpuls är Används för att korrigera för aktuellt förfall 18. GV -grafen passar Boltzmann -ekvationen: de uppenbara dissociationskonstanterna (KD) för olika kombinationer av kanaler och hämmare (kompletterande tabell 1) bestämdes genom att montera koncentrationsberoende av hämning (medelvärde %hämningsvärden) Med kullekvationen: där [i] är koncentrationen av hämmare I och H är kullkoefficienten. För att beräkna kullkoefficienten, omorganiseras ekvation (2) som: