Kuhojiwa kwa kiolesura cha kati cha chaneli ya wazi ya protoni ya Hv1 na uchunguzi uliounganishwa kwa njia ya aloster.

Asante kwa kutembelea Nature.com.Toleo la kivinjari unachotumia lina uwezo mdogo wa kutumia CSS.Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au kuzima hali ya uoanifu katika Internet Explorer). Kwa sasa, ili kuhakikisha kuendelea kutumia, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript. Chaneli ya protoni iliyo na umeme wa Hv1 ni tata ya dimeric inayojumuisha vikoa viwili vya kuhisi voltage (VSDs), ambayo kila moja ina njia ya upenyezaji wa protoni iliyo na lango. Upunguzaji wa maji unadhibitiwa na kikoa cha cytoplasmic coiled-coil. Mpito kutoka hali iliyofungwa hadi hali iliyofungwa. hali ya wazi katika VSD zote mbili inajulikana kutokea kwa ushirikiano; hata hivyo, kidogo inajulikana kuhusu taratibu za msingi.Miingiliano ya Intersubunit ina jukumu muhimu katika michakato ya allosteric; hata hivyo, miingiliano kama hiyo haijatambuliwa katika chaneli zilizo wazi za Hv1.Hapa tunaonyesha kwamba derivatives za 2-guanidinothiazole huzuia VSD mbili za Hv1 kwa njia ya ushirikiano na kutumia mojawapo ya misombo hii kama uchunguzi wa kuunganisha allosteric kati ya subunits zilizo wazi. Tuligundua kwamba extracellular mwisho wa kipande cha kwanza cha transmembrane cha VSD huunda kiolesura cha baina ya sehemu ndogo ambazo hupatanisha muunganisho kati ya tovuti zinazofunga, ilhali kikoa-ilichojiviringishwa hakihusiki moja kwa moja katika mchakato huu. Pia tulipata ushahidi dhabiti kwamba kichujio cha kuchagua cha protoni cha kituo kinadhibiti ushirikiano wa kufunga vizuizi. . Njia za protoni zilizo na mlango wa voltage zina jukumu muhimu katika viumbe mbalimbali, kutoka kwa phytoplankton hadi kwa wanadamu1.Katika seli nyingi, njia hizi hupatanisha maji ya protoni kutoka kwa membrane ya protoni na kudhibiti shughuli za oxidase ya NADPH. Njia pekee inayojulikana ya protoni ya kupitisha umeme kwa wanadamu. ni Hv1, ambayo ni zao la HVCN1 gene2,3.Hv1 (aka VSOP) imeonyeshwa kuwa na jukumu katika uenezaji wa seli B4, uzalishaji wa spishi tendaji za oksijeni na mfumo wa kinga wa ndani5,6,7,8, seli ya manii. motility9 na udhibiti wa pH wa maji ya uso wa njia ya hewa10. Chaneli hii inahusika na aina nyingi za saratani zilizoonyeshwa kupita kiasi kama vile saratani ya seli B4,11 na saratani ya matiti na utumbo mpana12,13.Shughuli nyingi za Hv1 zilipatikana ili kuongeza uwezo wa metastatic wa seli za saratani 11, 12.Katika ubongo, Hv1 inaonyeshwa. na microglia, na shughuli zake zimeonyeshwa kuzidisha uharibifu wa ubongo katika mifano ya kiharusi cha ischemic. Protini ya Hv1 ina kikoa cha kuhisi voltage (VSD), ambacho kinajumuisha sehemu nne za transmembrane zinazoitwa S1 hadi S414. VSD inafanana na vikoa vinavyolingana vya chaneli za Na+, K+ na Ca2+ zilizo na volteji na phosphatase nyeti volteji, kama vile CiVSP kutoka. Ciona gutis15.Katika protini hizi nyingine, C-terminus ya S4 imeambatishwa kwa moduli ya athari, kikoa cha pore au kimeng'enya.Katika Hv1, S4 inaunganishwa na kikoa cha coil-coiled (CCD) kilicho kwenye upande wa cytoplasmic wa membrane. .Chaneli ni changamano ya dimeric inayojumuisha VSD mbili, kila moja ikiwa na njia ya upenyezaji wa protoni16,17,18. Vitengo hivi viwili vya Hv1 vilipatikana kufunguliwa kwa ushirikiano19,20,21,22, na kupendekeza kwamba upatanishi wa alosteric na mwingiliano baina ya subunit hucheza. jukumu muhimu katika mchakato wa lango.Uunganisho kati ya subunits ndani ya kikoa cha coil iliyofunikwa inafafanuliwa vizuri kwa sababu miundo ya fuwele ya vikoa viwili vilivyotengwa inapatikana22,23. Kwa upande mwingine, kiolesura kati ya VSDs ndani ya membrane si. inaeleweka vyema.Muundo wa fuwele wa proteni ya chimeri ya Hv1-CiVSP haitoi maelezo kuhusu kiolesura hiki, kwa vile shirika la trimeric la chaneli iliyoangaziwa linaweza kutokana na uingizwaji wa CCD ya asili ya Hv1 na zipu ya leusini ya chachu GCN424. Utafiti wa hivi majuzi wa shirika la kitengo kidogo cha chaneli ya Hv1 ulihitimisha kuwa helikopta mbili za S4 hupita kwenye CCD bila usumbufu mkubwa wa muundo wa sekondari, na kusababisha helikopta ndefu ambazo huanza kutoka kwa membrane na kuingia kwenye saitoplazimu. Kulingana na uchambuzi wa cysteine utafiti huu unapendekeza kwamba Hv1 VSDs ziwasiliane kwenye sehemu ya S4. Hata hivyo, tafiti nyingine zimependekeza miingiliano mbadala kati ya VSD. Miingiliano hii ni pamoja na sehemu za S1 17, 21, 26 na ncha za nje za sehemu ya 21 ya S2. Sababu inayowezekana ya kutatanisha matokeo ya tafiti hizi ni kwamba uunganisho wa allosteric kati ya VSD ulichunguzwa kuhusiana na mchakato wa mageuzi, ambayo inategemea hali iliyofungwa na wazi, na kiolesura kati ya VSD kinaweza kutofautiana katika mabadiliko tofauti ya hali katika conformation. Hapa, tuligundua kuwa 2-guanidinothiazole huzuia chaneli za Hv1 kwa kuunganisha kwa VSD mbili zilizo wazi, na kutumia moja ya misombo, 2-guanidinobenzothiazole (GBTA), kuchunguza mwingiliano kati ya subunits katika hali ya wazi. interface.Tuligundua kuwa mkondo wa kuunganisha wa GBTA unaweza kuelezewa vyema na modeli ya kiasi ambapo kufunga kizuizi kwa kitengo kidogo husababisha kuongezeka kwa mshikamano wa kitengo kidogo kilicho karibu. Pia tuligundua kuwa mabaki ya D112, vichujio vya kuchagua kwa ajili ya channel 27, 28 na sehemu ya guanidine derivative kisheria tovuti 29 kudhibiti GBTA binding cooperativity.Tunaonyesha kwamba ushirikiano wa kisheria unadumishwa katika dimer ya Hv1, ambapo CCD inajitenga na sehemu ya S4, na kupendekeza kuwa interface ya intersubunit katika CCD haifanyi moja kwa moja. kupatanisha muunganisho wa allosteric kati ya tovuti zinazofunga GBTA. Kinyume chake, tunapata kwamba kipande cha S1 ni sehemu ya kiolesura kati ya vitengo vidogo na kupendekeza mpangilio wa VSDs zilizo karibu na mwisho wa ziada wa helix ya S4 mbali na katikati ya dimer ili kuruhusu. kipande cha S1 kuwa katika hali ya wazi. Vizuizi vidogo vya molekuli ya Hv1 ni muhimu kama dawa za kuzuia saratani na mawakala wa kinga ya neva.Hata hivyo, hadi sasa, misombo michache imeweza kuzuia chaneli30,31,32,33.Kati yake, 2-guanidinobenzimidazole (2GBI, kiwanja [1] kwenye Mtini. . 1a) na viambajengo vyake vilipatikana kuzuia upenyezaji wa VSD29,32 wa protoni kupitia chaneli.Kufunga kwa misombo hiyo kunafikiriwa kutokea kwa kujitegemea katika vitengo viwili vilivyo wazi.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, kiwanja [2] kwenye Kielelezo 1a) kilikuwa hapo awali ilionyeshwa kuzuia Hv1 karibu kwa ufanisi kama 2GBI inapojaribiwa kwa mkusanyiko wa 200 μM (Mchoro 1b). Tulichunguza derivatives nyingine za thiazole na tukagundua kwamba baadhi yao zilizuia chaneli kwa nguvu sawa au kubwa kuliko GBTA (Mchoro 1 na Nyongeza ya GBTA (Mchoro 1 na Nyongeza). maandishi).Tulibaini mikondo ya mwitikio wa mkusanyiko wa viini vinne vya thiazole (GBTA na viambajengo [3], [6] na [11], Kielelezo 1c) na tukagundua kuwa vilikuwa vikali zaidi kuliko vile vya 2GBI. Vigawo vya Hill (h) ya derivatives ya thiazole kati ya 1.109 ± 0.040 hadi 1.306 ± 0.033 (Mtini. 1c na Kielelezo cha Nyongeza. 1). Kinyume chake, mgawo wa Kilima wa 2GBI ulikuwa 0.975 ± 0.024 29, Mchoro 2a na Mchoro wa Nyongeza. 1). Mgawo wa kilima juu ya 1 unaonyesha ushirikiano unaofungamana. Kwa sababu kila kitengo kidogo cha Hv1 kina kizuizi chake- tovuti ya kufunga,29,32 tulisababu kwamba kufungana kwa derivati ​​ya thiazole kwa kitengo kidogo kunaweza kuimarisha ufungaji wa molekuli ya kizuizi cha pili kwa kitengo cha karibu.GBTA ilikuwa kiwanja cha majaribio chenye mgawo wa juu zaidi wa Hill. Kwa hivyo, tulichagua kiwanja hiki ili soma zaidi utaratibu wa kuunganisha ushirikiano na kutumia 2GBI kama udhibiti hasi wa marejeleo. (a) Michanganyiko ya majaribio: [1] Kizuizi cha Marejeleo cha Hv1 2-guanidino-benzimidazole (2GBI).[2] 2-guanidino-benzothiazole (GBTA), [3] (5-trifluoromethyl-1,3-benzothiazol-2-yl)guanidine, [4] naphtho[1,2-d][1, 3] Thiazol-2-yl -guanidine, [5](4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)guanidine, [6](5-bromo-4-methyl-1,3-thiazol- 2-yl)guanidine, [7] famotidine, [8] 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylic acid ethyl ester, [9] 2-guanidino-4-methyl Ethyl-1,3-thiazole-5-carboxylate, [10 ](2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)ethyl acetate, [11]1-[4-(4 -Chlorophenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine, [ 12]1-[4-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]guanidine .(b) Kuzuiwa kwa shughuli ya Hv1 ya binadamu na guanidinothiazole iliyoonyeshwa na kiwanja cha marejeleo 2GBI (paa za bluu-kijani) .Mikondo ya protoni ya Hv1 ilipimwa katika plagi za ndani za oocyte za Xenopus ili kukabiliana na utengano kutoka kwa uwezo wa kushikilia wa -80 mV hadi +120 mV.Kila kizuizi kiliongezwa kwenye bafu kwa mkusanyiko wa 200 μM.pHi = pHo = 6.0 .Data ni wastani ±SEM (n≥4).(c) Uzuiaji unaotegemea ukolezi wa Hv1 ya binadamu kwa misombo [2], [3], [6] na [11].Kila nukta inawakilisha wastani wa kizuizi ± SD ya 3. kwa vipimo 15. Laini hiyo ni ya Kilima inayotumika kupata thamani dhahiri za Kd zilizoripotiwa katika Jedwali la Ziada 1. Viegemeo vya mlima vilibainishwa kutokana na kufaa vilivyoripotiwa katika Kielelezo cha 1 cha Nyongeza: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ± 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (angalia Mbinu). (a,b) Mchanganyiko wa 2GBI na GBTA iliyozuiwa dimeric na monomeri Hv1 kwa namna inayotegemea mkusanyiko. Kila nukta inawakilisha kizuizi cha wastani cha ± SD cha vipimo 3 hadi 8 na mkunjo ni uwiano wa Kilima. Vigawo vya Hill (h) vinavyoonyeshwa katika histogramu zilizowekwa zilibainishwa kutokana na uwiano ulioripotiwa katika Tini za Ziada 3 na 4. Mwitikio wa mkusanyiko wa GBTA unaoonyeshwa katika (a) ni sawa na ule ulio kwenye Kielelezo 1c.Angalia Jedwali la Ziada 1 kwa thamani zinazoonekana za Kd.(c) Uundaji wa ufungaji wa vyama vya ushirika wa GBTA hadi dimeric Hv1. Mstari dhabiti mweusi unawakilisha ulinganifu wa data ya majaribio kwa mlinganyo (6), ambao unafafanua muundo wa kuunganisha unaoonyeshwa katika (d). Mistari iliyopigwa iliyoitwa Sub 1 na Sub 2 inawakilisha muungano wa molekuli mbili. -mikono ya usawazishaji wa matukio ya kwanza na ya pili ya kuunganisha, mtawalia (Nchi 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Ndogo ya 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 μM ).(d) Mchoro wa mpangilio wa utaratibu unaopendekezwa wa kizuizi cha Hv1. Katika kesi ya GBTA, kumfunga kwa kitengo kidogo kilicho wazi huongeza mshikamano wa kitengo kilicho karibu kilicho wazi (Kd2 0.05) katika mgawo wa Kilima wa kuunganisha GBTA kwa chaneli za GGG ikilinganishwa na aina ya pori (Kielelezo 5c), ikipendekeza kuwa licha ya jukumu lake katika kutunza vitengo viwili kwa pamoja muhimu, lakini CCD haipatanishi moja kwa moja uunganishaji wa viunganishi vya alosteri kati ya tovuti zinazofunga GBTA. (a) Mchoro wa kiratibu wa dimer ya Hv1 yenye mabadiliko ya triglycine kwenye ncha ya ndani ya S4 iliyoundwa ili kutatiza muunganisho wa sehemu ndogo zinazopatanishwa na kikoa cha saitoplazimu (mishale ya samawati).(b) Uwakilishi wa kimkakati wa vipimo vya Hv1 na vipimo vya kuunganisha vilivyo na mabadiliko yaliyoonyeshwa, yaliyoundwa ili kujaribu vipande vya S1 vinavyohusika katika kuunganisha kati ya vitengo vidogo (mishale ya bluu).(c–h) 2GBI (cyan) na GBTA (nyekundu iliyokolea) huzuia miundo iliyoonyeshwa kwa namna inayotegemea mkusanyiko.Kila nukta inawakilisha kizuizi cha wastani. ± SD ya vipimo 3 hadi 10. Mviringo ulikuwa wa Kilima uliotumika kupata thamani dhahiri za Kd (angalia Jedwali la Ziada 1). Vigawo vya mlima katika histogramu zilizoingiliwa vilibainishwa kama ilivyofafanuliwa katika sehemu ya Mbinu (angalia Tini za Ziada 3 na 4). Thamani za marejeleo za h Hv1 WT huonyeshwa kama mistari iliyokatika. Nyota zinaonyesha tofauti kubwa za kitakwimu kati ya vifungu vya mutant na WT (p 0.05, Mtini. 5d, i ) ) Kwa upande mwingine, mabadiliko ya D123A yalipunguza kwa kiasi kikubwa mgawo wa Kilima wa GBTA (p 0.05/14). Kwa kuwa kugeuza malipo katika nafasi ya 123 kwa vitengo vyote viwili kulisababisha mabadiliko makubwa katika ushirikiano unaofungamana na GBTA, huku kurejesha malipo kwa vitengo vyote viwili kulikuwa na athari ndogo tu, tulipanua uchanganuzi kujumuisha kitengo kidogo tu na chaneli ya ubadilishaji ya malipo. ilizalisha dimers zilizounganishwa na Hv1 na uingizwaji wa D123R katika kitengo kidogo cha C-terminal (Mchoro 5b) na kupima kizuizi cha kukabiliana na mkusanyiko na GBTA na 2GBI. ya aina-mwitu ya Hv1 (p 0.05). Pia tuligundua kuwa kwa kukosekana kwa βME, mgawo wa Hill wa GBTA unaofungamana na dimer ya D112E I127C Hv1 ulikuwa wa juu zaidi kuliko ule uliopimwa mbele ya mawakala wa kupunguza (Mchoro 6e na Kielelezo cha 4 cha Nyongeza), ikimaanisha kuwa mabadiliko ya D112E haikukomesha ongezeko la ushirikiano wa kisheria wa GBTA unaotokana na kuunganishwa kwa cysteine ​​​​127. Mgawo wa Hill wa 2GBI unaofunga kwa D112E, I127C Hv1 dimers pia haukuathiriwa kwa kiasi kikubwa na mabadiliko ya D112E (Kielelezo 1).6d na Nyongeza. Kielelezo 3). Yakijumlishwa, matokeo haya yanadokeza kuwa ufungaji wa GBTA huimarishwa na mwingiliano kati ya ncha za nje za vipande vya S1 katika vitengo vidogo vya Hv1 vilivyo karibu kupitia mwingiliano wa kuvutia wa kielektroniki au kupitia uundaji wa vifungo shirikishi kati ya cysteine ​​zilizobadilishwa Uunganisho wa Allosteric kati ya tovuti huongezeka na kusababisha ushirikiano wa kisheria. Ingawa athari ya mwingiliano wa kuvutia wa kielektroniki kwenye utengamano inaweza kukomeshwa na mabadiliko ya D112E, athari za vifungo shirikishi haziwezi. Katika uchunguzi wetu wa nafasi ya kemikali inayopatikana ya kufunga viambata vya guanidine kwenye chaneli za Hv1, tuligundua kuwa guanidinothiazoli 2 kama vile GBTA zina utegemezi mkubwa wa ukolezi kuliko 2-guanidinobenzimidazole (Mchoro 1c) na njia za monomeriki (Mchoro 2a, b) na kwa chaneli ya dimeric ambayo kitengo kidogo kilikuwa kimefungwa kwa kizuizi (Kielelezo 4) kilituongoza kuhitimisha kuwa uzuiaji wa Hv1 na GBTA Hatua ni mchakato wa synergistic, na maeneo ya kuunganisha ya misombo katika vitengo vidogo viwili yameunganishwa kwa njia ya alosteri. Ugunduzi kwamba GBTA inafunga kwenye chaneli iliyo wazi, kama ilivyoonyeshwa hapo awali kwa kiwanja husika 2GBI32, unapendekeza kwamba uunganisho wa alosteri unaweza kutathminiwa mahususi katika hali ya wazi.Mfano wetu wa kuunganisha vyama vya ushirika. aliweza kuelezea kwa kiasi kikubwa kizuizi cha HV1 na GBTA (Mtini. 2C) na kuelezea athari tofauti za 2GBI na GBTA juu ya kuoza kwa mikondo ya mkia wa kituo baada ya utando wa membrane, ambayo inasaidia tafsiri yetu ya mchakato wa kumfunga. Mgawo wa juu wa kilima ambao unaweza kupatikana katika protini ya allosteric na tovuti mbili za kumfunga (kama vile HV1) ni 2. Tunapima GBTA kumfunga Hv1 aina ya mwitu na mgawo wa 1.31, ambao uliongezeka hadi 1.88 katika HV1 I127C.The Nishati ya bure ya Synergistic, tofauti kati ya nguvu za bure za kufungwa za tovuti za chini na za juu zaidi (tazama njia), ilikuwa 1.3 kcal/mole katika kesi ya Hv1 aina ya mwitu na 2.7 kcal/mole katika kesi ya HV1 I127C.The Kufunga ya oksijeni kwa hemoglobin ni mfano maarufu na uliosomeshwa vizuri wa mchakato wa kushirikiana38. Kwa hemoglobin ya binadamu (tetramer iliyo na tovuti nne zilizojumuishwa), mgawo wa mlima unaanzia 2.5-3.0, na maadili yanaanzia 1.26 hadi 3.64 KCAL/mol, kulingana na hali ya majaribio38.Hus, kwa suala la nguvu za ulimwengu, ushirikiano wa GBTA kumfunga kwa HV1 sio tofauti sana na ile ya O2 inayofunga hemoglobin wakati idadi tofauti ya protini katika mifumo hiyo miwili inazingatiwa. Katika mfano wetu wa umoja, kufungwa kwa molekuli za GBTA kwa subunit moja husababisha kuongezeka kwa ushirika wa karibu wa subunit.Tuona mchakato ambao urekebishaji wa mazingira ya kumfunga yanayotokana na tukio la kwanza (lililowekwa sawa) husababisha Mabadiliko katika maingiliano kati ya subunits.in majibu ya mabadiliko haya, karibu subunits hubadilisha tovuti zao za kumfunga, na kusababisha nguvu ya GBTA. Kuweka mchakato huu, S1 aspartate D112 inawajibika kwa kupanga upya kwa tovuti inayohusiana na kuongezeka kwa ushirika.D112 Ilionyeshwa hapo awali kuwa sehemu ya njia ya upenyezaji wa proton ya HV1 na kufanya kama kichungi cha kuchagua27,28. Matokeo yetu yanaonyesha kuwa vichungi vya kuchagua katika subunits mbili za HV1 vimejumuishwa katika hali ya wazi.Figure 7A inaonyesha eneo linalokadiriwa la tovuti ya kumfunga GBTA na eneo la mabaki D112, D123, K125 na I127 kwenye mpango wa HV1 VSD msingi msingi Kwenye muundo wa glasi ya mwelekeo wa HV1-CIVSP. . Sehemu zilizotabiriwa za GBTA zilizofungwa zinaonyeshwa kama ovals za kijivu.Black mishale zinaonyesha njia zinazohusika katika kuunganishwa kwa allosteric kati ya maeneo ya kumfunga katika subunits mbili za karibu. Nafasi za mabaki ya S1 yaliyochunguzwa yamewekwa alama na nyanja za rangi. Katika usanidi mbili tofauti kama inavyoonekana kutoka upande wa nje wa ndege ya membrane.Katika paneli ya kushoto, kigeuzio cha dimer huundwa na S4 helix.Rotation ya digrii mbili za VSDS 20 saa karibu na mhimili wa ndege ya membrane, ikifuatana na. Mgawanyo wa ncha za nje za helikopta mbili za S4 (mishale iliyokatwa), hutoa mpangilio ulioonyeshwa upande wa kulia. Usanidi huu, mabaki D123 na I127 kutoka kwa subunits za karibu zinaruhusiwa kuja pamoja. (C) Uwakilishi wa Schematic wa CivSP VSD Katika usanidi wa dimer unaopatikana katika muundo wa fuwele wa 4G80.Position P140 katika CIVSP inalingana na msimamo D123 katika HV1. Matokeo yetu yanaonyesha kuwa mwingiliano wa umeme unaorudisha kati ya mabaki 123 (123d/123d au 123r/123R) unahusishwa na kiwango cha "kawaida" cha ushirika wa GBTA katika hali ya wazi na hubadilisha mwingiliano kutoka kwa kuchukizwa hadi kuvutia (123d/123r) , kuongezeka kwa ushirikiano (Mtini. 5G) .Inatarajiwa kwamba kuondolewa kwa mwingiliano unaorudisha nyuma na uingizwaji wa alanine pia kunasababisha kuongezeka kwa ushirika. Kwa hivyo, kupungua kwa ushirikiano wa dimer ya 123A/123A kulizingatiwa (Mtini. 5E) .Maweza uwezekano wa Ufafanuaji ni kwamba athari ya kuwekewa mabaki ya hydrophobic katika mazingira ya hydrophilic inaweza kuzidi athari ya utulivu kwa sababu ya kuondoa mwingiliano kati ya mabaki ya D123, na kusababisha kupunguzwa kwa jumla kwa ushirika.Mony et al.39 hivi karibuni iliripoti kuwa ufikiaji wa kutengenezea AT katika AT AT AT katika Nafasi D171 ya Ciona Gutis CI-HV1 (sambamba na D123 katika HV1 ya binadamu) imeongezeka juu ya uanzishaji, ikiunga mkono wazo kwamba D123 iko katika mazingira ya hydrophilic katika hali ya wazi. Uwezo wa vituo vya HV1 unajulikana kutokea kupitia mabadiliko kadhaa19,20,26,39,40,41.qiu et al26 iligundua kuwa juu ya utando wa membrane, sensor ya voltage ya CI-HV1 inabadilika , ikifuatiwa na mpito tofauti ambayo husababisha protoni kufungua uzalishaji katika njia zote mbili. Mabadiliko ya kiufundi ya sensor ya voltage yalizingatiwa na fluorescence ya voltage-clamp, na iligundulika kuwa mpito wa pili ulichaguliwa kwa hiari na mabadiliko katika nafasi ya D171. Utaftaji wa ishara ya fluorescent ni sawa na uwepo wa mwingiliano wa umeme kati ya mabaki ya D171 ya subunits karibu wakati fulani kando ya athari za kuratibu za mabadiliko ya kiufundi. Utafsiri huu ni sawa na ugunduzi wetu kwamba mabaki ya D123 yanaingiliana kwa nguvu katika hali ya wazi katika hali ya wazi na kupatikana kwetu kwamba mabaki ya D123 yanaingiliana katika hali ya wazi ni sawa na kupatikana kwetu kwamba mabaki ya D123 inaingiliana kwa hali katika hali wazi na na upatanishi wa kuunganishwa kati ya tovuti za kumfunga GBTA. Fujiwara et al25 alipendekeza kwamba kigeuzio cha kikoa cha cytoplasmic coiled-coil kinaenea kwenye membrane kuwa na helikopta mbili za S4 (Mtini. 7B, jopo la kushoto). Mfano wa mwingiliano huu wa intersubinit ni msingi wa uchambuzi wa kiunga cha cysteine ​​kinachojumuisha. Uchambuzi mzima wa VSD na kazi ya mkoa unaounganisha helix ya S4 na CCD.Katika kukosekana kwa gradient ya transmembrane pH, njia za HV1 zinahitaji kupunguka kwa membrane kufungua, na kuvuka kwa cysteine ​​hufanyika chini ya hali ambapo kituo kimefungwa. Kwa hivyo, interface iliyogunduliwa ya S4-S4 inaweza kuonyesha usanidi wa subunit ya hali ya juu. Masomo mengine yamepata ushahidi wa kuhusika kwa S1 na S2 katika mwingiliano wa intersubinit wakati wa GATating17,21,26 ikionyesha kuwa vituo vinaweza kupitisha usanidi tofauti wa subunit katika Open na Mataifa yaliyofungwa, wazo linaloambatana na matokeo ya Mony et al. S1 hutembea 39 wakati wa gating. Hapa, tunaonyesha kuwa, katika hali ya wazi, ncha za nje za helix ya S1 ziko karibu vya kutosha kusaidia mwingiliano wa moja kwa moja wa umeme ambao unaingiliana upatanishi kati ya subunits.Katika usanidi wa dimer na mwingiliano uliopanuliwa wa S4-S4, helikopta za S1 ziko mbali sana Mbali na kila mmoja kuingiliana moja kwa moja. Kwa hivyo, mzunguko wa 20 ° saa ya VSD mbili zinazozunguka karibu na mhimili kwa ndege ya membrane, pamoja na mgawanyo wa ncha za nje za helikopta mbili za S4, zilitoa usanidi wa S1-S1 Na matokeo yetu (Mtini. 7B, jopo la kulia). Tunapendekeza usanidi huu kwa kituo katika hali ya wazi. Ingawa enzyme ya CIVSP inadhaniwa kufanya kazi kama monomer, muundo wa glasi ya VSD yake ya pekee umekamatwa katika hali ya hali ya juu. Mwisho wa helikopta ya S1 kwenye dimer hii ni karibu sana, na usanidi wa jumla ni sawa na ile iliyopendekezwa Kwa HV1 (Mtini. 7C) .Katika dimer ya CIVSP, mabaki ya karibu kutoka kwa subunit ya karibu yalikuwa katika nafasi ya 140 (Mtini. 7C) .Kuingiliana, p140 katika CIVSP inalingana na msimamo D123 katika HV1.The kufanana katika usanidi wa subunit kati ya HV1 Na vipimo vya CIVSP vinaonyesha kuwa VSD za protini hizi zina tabia ya ndani ya kuunda interface ambapo ncha za nje za S1 zinaingiliana. Jukumu muhimu la HV1 katika uanzishaji wa seli ya manii hufanya kituo hiki kuwa lengo la kuvutia la dawa kwa udhibiti wa uzazi wa kiume.Furthermore, uanzishaji wa HV1 katika microglia umeonyeshwa kupona zaidi kutoka kwa ischemic stroke.enhanced shughuli ya HV1 ilipatikana kuhusishwa na chini Kupona kwa wagonjwa walio na matiti 12 au saratani ya colorectal 13 na inadhaniwa kuchangia malignancies ya B-seli 11. Kwa hivyo, dawa ndogo za molekuli zinazolenga HV1 zinaweza kutumika kama mawakala wa neuroprotective au matibabu ya anticancer.Ugunduzi wa Guanidinothiazole Fungua subunit ya HV1, na kusababisha kuongezeka kwa ushirika, inaweza kusababisha maendeleo ya dawa zenye nguvu zinazolenga njia za HV1. Mutagenesis iliyoelekezwa na tovuti ya HV1 ya binadamu ilifanywa kwa kutumia mbinu za kawaida za PCR.Katika ujenzi wa HV1NCCIVSP, mabaki 1-96 na 228-273 ya HV1 yalibadilishwa na mabaki 1-113 na 240-576 ya Civsp18.in ya HV1 iliyounganishwa, C-terminus ya subunit moja imeunganishwa na N-terminus ya subunit ya pili kupitia ggsggsggsgsggggggggg. T7 Mmessage Mmachine Transcriptcript Kit (Ambion) .1-3 Siku kabla ya vipimo vya elektroni, CRNA iliingizwa ndani ya xenopus oocytes (50 nl kwa seli, 0.3-1.5 μg/μl) .Stage V na vi oocytes kutoka Xenopus laevis (Nasco) walipatikana Kutoka kwa ecocyte bioscience.Following RNA sindano, seli zilitunzwa katika ND96 kati iliyo na 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM MgCl, 10 mM Hepes, 5 mM pyruvate, 100 μg/ml gentamicin, ph 7.2 18 ° C . 2-guanidino-benzimidazole [1], 2-Guanidino-benzothiazole [2], (4-methyl-1,3-thiazol-2-yl) guanidine [5], (5-bromo-4 -methyl-1,3 -thiazol-2-yl) guanidine) [6], ethyl 2-guanidino-5-methyl-1,3-thiazole-4-carboxylate [8], ethyl 2-guanidino-4- methyl-1,3-thiazole- 5-carboxylate [9] na (2-guanidino-4-methyl-1,3-thiazol-5-yl) ethyl acetate [10] walikuwa kutoka Sigma-Aldrich.Famotidine [7] alikuwa kutoka kwa mbunge biomedicals.1- [4 -. Kutoka kwa matrix kisayansi. Mchanganyiko huu ni wa usafi wa hali ya juu zaidi. angalau usafi wa 99%. Kwa kusimamishwa kwa 2-amino-4- (trifluoromethyl) benzenethiol hydrochloride (1.02 g, 4.5 mmol) katika 25 ml ya asidi ya maji ya hydrochloric (2.5 N) iliongezwa dicyandiamide thabiti (380 mg, 4.5 mmol), na mchanganyiko wa heterogeneus uliosababishwa. ilibadilishwa tena na kuchochea kwa nguvu kwa masaa 4. Mchanganyiko wa athari ulipozwa kwa joto la kawaida na kutengwa kwa kuongezewa polepole kwa 10n potasiamu hydroxide.Mereting nyeupe ilichujwa, ikanawa na maji baridi (3 × 50 ml), iliyokaushwa katika oveni ( 65 ° C) kwa masaa kadhaa, na kisha kuchapishwa tena kutoka ethyl acetate/petroli ether kutoa nyeupe nyeupe (500 mg, 48 %); mbunge 221-222 ° C (mwanga 225-226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): δ [ppm] = 7.25 (pana sana S, 4 h), 7.40 (d, 1 h, j = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 h), 7.92 (d . = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5.hrms (ESI): m/z thamani iliyohesabiwa.kwa C9H8F3N4S (M + H) +: 261.0416, ilipatikana : 261.0419. Naphtho [1,2-D] thiazol-2-amine (300 mg, 1.5 mmol), iliyoundwa kama ilivyoelezewa hapo awali, ilikuwa moto hadi 200 ° C katika umwagaji wa mafuta kwenye bomba ndogo ya mtihani.300 mg (kubwa) cyanamide na 1.0 ml conc.kwa kiwanja cha moto kiliongezwa asidi ya hydrochloric haraka na mchanganyiko uliwekwa kwenye umwagaji wa mafuta kwa dakika 2, wakati ambao maji mengi yalibadilishwa. Mchanganyiko wa athari ulipozwa kwa joto la kawaida na nyenzo zilizosababishwa ilivunjwa vipande vidogo na kuoshwa na maji ili kutoa rangi ya manjano ya manjano. (38 mg, 10%) mbunge 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): δ [ppm] = 7.59 (t, 1 h, j = 8.2 Hz), 7.66 (t, 1 h, j = 8.3 hz), 7.77 (d, 1 h . MHz, DMSO-D6): δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): m/z mahesabu ya thamani.for c12h11n4s (m + h) , kupatikana: 243.0704. Mikondo ya protoni ilipimwa katika viraka vya ndani na nje vya oocytes zinazoelezea tofauti tofauti kwa kutumia amplifier ya axopatch 200b iliyodhibitiwa na axon digidata 1440a (vifaa vya Masi) na programu ya pclamp10.Intracellular na extracellular ina muundo sawa: 100 mm 2- (n-morpholino ) asidi ya ethanesulfonic (MES), 30 mM tetraethylammonium (chai) mesylate, 5 mM chai kloridi, 5 mM ethylene glycol-bis (2-aminoethyl) -n, n, n ', asidi ya n'-tetraacetic (EGTA), iliyorekebishwa hadi pH 6.0 na hydroxide ya chai. Vipimo vyote vilifanywa kwa 22 ± 2 ° C.The bomba lina upinzani wa 1.5-4 MΩ.Taces za kawaida zilichujwa kwa 1 kHz, sampuli kwa 5 kHz na kuchambuliwa na clampfit10.2 (vifaa vya Masi ) na asili8.1 (asiliLab). Suluhisho zilizo na viwango tofauti vya inhibitor ya HV1 na katika hali zingine 10 mM βME zilianzishwa ndani ya umwagaji na mvuto kupitia njia nyingi zilizounganishwa na mfumo wa valve ya VC-6 (Warner Instr.), Ambayo ilipitishwa kupitia programu ya PCLAMP TTL (transistor- Mantiki ya transistor) ishara.Rapid Majaribio ya manukato yalifanywa kwa kutumia penseli ya manukato ya tube (otomatiki SCI.) Na ncha ya utoaji wa kipenyo cha 360 iliyowekwa mbele ya bomba la kiraka.Channel imedhamiriwa na vipimo vya amperometri ya isochronal mwishoni mwa kiraka. +120 mV Vipimo vya kusukuma.GV vilifanywa kama ilivyoelezewa hapo awali18,20.Tail zilirekodiwa kwa -40 mV baada ya hatua za kupunguka kwa voltages tofauti kutoka -20 mV hadi +120 mV isipokuwa vinginevyo ilivyoainishwa. Inatumika kusahihisha kwa kuoza kwa sasa 18. Grafu ya GV inafaa equation ya Boltzmann: Vifunguo vya dhahiri vya kujitenga (KD) kwa mchanganyiko tofauti wa njia na vizuizi (Jedwali la 1) liliamuliwa kwa kufaa utegemezi wa mkusanyiko (maana %ya inhib) Na equation ya kilima: ambapo [i] ni mkusanyiko wa inhibitor I na H ni mgawo wa kilima.Ilihesabu mgawo wa kilima, equation (2) imepangwa upya kama: