అలోస్టెరికల్ కపుల్డ్ ప్రోబ్‌తో ఓపెన్ Hv1 ప్రోటాన్ ఛానల్ యొక్క ఇంటర్‌సబ్యూనిట్ ఇంటర్‌ఫేస్ యొక్క విచారణ

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్ CSSకి పరిమిత మద్దతును కలిగి ఉంది.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ని (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని ఆఫ్ చేయండి)ని ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోపు, నిర్ధారించుకోవడానికి నిరంతర మద్దతు, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని ప్రదర్శిస్తాము. Hv1 వోల్టేజ్-గేటెడ్ ప్రోటాన్ ఛానల్ అనేది రెండు వోల్టేజ్-సెన్సింగ్ డొమైన్‌లను (VSDలు) కలిగి ఉన్న డైమెరిక్ కాంప్లెక్స్, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి గేటెడ్ ప్రోటాన్ పారగమ్య పాత్‌వేని కలిగి ఉంటుంది. డైమెరైజేషన్ సైటోప్లాస్మిక్ కాయిల్డ్-కాయిల్ డొమైన్ ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది. క్లోజ్డ్ స్టేట్ నుండి మార్పు రెండు VSDలలోని ఓపెన్ స్టేట్ సహకారంతో సంభవిస్తుంది; అయినప్పటికీ, అంతర్లీన మెకానిజమ్స్ గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు. అలోస్టెరిక్ ప్రక్రియలలో ఇంటర్‌సబ్యూనిట్ ఇంటర్‌ఫేస్‌లు కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి; అయినప్పటికీ, ఓపెన్ Hv1 ఛానెల్‌లలో అటువంటి ఇంటర్‌ఫేస్‌లు గుర్తించబడలేదు. ఇక్కడ మేము 2-గ్వానిడినోథియాజోల్ డెరివేటివ్‌లు రెండు Hv1 VSDలను సహకార పద్ధతిలో నిరోధించడాన్ని మరియు ఓపెన్ సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య అలోస్టెరిక్ కలపడం కోసం ప్రోబ్‌గా ఈ సమ్మేళనాల్లో ఒకదాన్ని ఉపయోగిస్తాయని మేము ఇక్కడ నిరూపించాము. VSD యొక్క మొదటి ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ భాగం ముగింపు బైండింగ్ సైట్‌ల మధ్య కలపడం మధ్యవర్తిత్వం వహించే ఇంటర్‌సబ్యూనిట్ ఇంటర్‌ఫేస్‌ను ఏర్పరుస్తుంది, అయితే ఈ ప్రక్రియలో కాయిల్డ్-కాయిల్ డొమైన్ నేరుగా పాల్గొనదు. ఛానెల్ యొక్క ప్రోటాన్-సెలెక్టివ్ ఫిల్టర్ బ్లాకర్-బైండింగ్ సహకారాన్ని నియంత్రిస్తుందని మేము బలమైన సాక్ష్యాలను కనుగొన్నాము. . ఫైటోప్లాంక్టన్ నుండి మానవుల వరకు వివిధ రకాల జీవులలో వోల్టేజ్-గేటెడ్ ప్రోటాన్ ఛానెల్‌లు ముఖ్యమైన పాత్రలు పోషిస్తాయి అనేది Hv1, ఇది HVCN1 జన్యువు2,3.Hv1 (అకా VSOP) యొక్క ఉత్పత్తి B సెల్ విస్తరణ4, సహజమైన రోగనిరోధక వ్యవస్థ5,6,7,8, స్పెర్మ్ సెల్ ద్వారా రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతుల ఉత్పత్తిలో పాత్ర పోషిస్తుందని తేలింది. వాయుమార్గ ఉపరితల ద్రవం యొక్క చలనశీలత9 మరియు pH నియంత్రణ 10. ఈ ఛానెల్ B-కణ ప్రాణాంతకత 4,11 మరియు రొమ్ము మరియు కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్‌లు 12,13 వంటి అనేక అతిగా ఒత్తిడి చేయబడిన క్యాన్సర్ రకాల్లో పాల్గొంటుంది.అధిక Hv1 చర్య క్యాన్సర్ కణాల యొక్క మెటాస్టాటిక్ సంభావ్యతను పెంచుతుందని కనుగొనబడింది 11, 12 .మెదడులో, Hv1 వ్యక్తీకరించబడింది. మైక్రోగ్లియా ద్వారా, మరియు దాని కార్యకలాపాలు ఇస్కీమిక్ స్ట్రోక్ యొక్క నమూనాలలో మెదడు నష్టాన్ని తీవ్రతరం చేస్తాయి. Hv1 ప్రోటీన్ వోల్టేజ్-సెన్సింగ్ డొమైన్ (VSD)ని కలిగి ఉంటుంది, ఇందులో S1 నుండి S414 అని పిలువబడే నాలుగు ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ విభాగాలు ఉంటాయి. VSD వోల్టేజ్-గేటెడ్ Na+, K+ మరియు Ca2+ ఛానెల్‌ల సంబంధిత డొమైన్‌లను మరియు CiVSP వంటి వోల్టేజ్-సెన్సిటివ్ ఫాస్ఫేటేస్‌లను పోలి ఉంటుంది. Ciona gutis15.ఈ ఇతర ప్రొటీన్లలో, S4 యొక్క C-టెర్మినస్ ఒక ఎఫెక్టార్ మాడ్యూల్, పోర్ డొమైన్ లేదా ఎంజైమ్‌తో జతచేయబడుతుంది. Hv1లో, S4 పొర యొక్క సైటోప్లాస్మిక్ వైపు ఉన్న కాయిల్డ్-కాయిల్ డొమైన్ (CCD)తో అనుసంధానించబడి ఉంటుంది. .ఛానెల్ అనేది రెండు VSDలతో కూడిన డైమెరిక్ కాంప్లెక్స్, ప్రతి ఒక్కటి గేటెడ్ ప్రోటాన్ పెర్మియేషన్ పాత్‌వేని కలిగి ఉంటుంది16,17,18. ఈ రెండు Hv1 సబ్‌యూనిట్‌లు 19,20,21,22 సహకారంతో తెరవడం కనుగొనబడింది, అలోస్టెరిక్ కప్లింగ్ మరియు ఇంటర్-సబ్యూనిట్ ఇంటరాక్షన్‌లు ప్లే అవుతాయని సూచిస్తున్నాయి. గేటింగ్ ప్రక్రియలో ముఖ్యమైన పాత్ర.కాయిల్డ్ కాయిల్ డొమైన్‌లోని సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య ఇంటర్‌ఫేస్ బాగా నిర్వచించబడింది ఎందుకంటే రెండు వివిక్త డొమైన్‌ల క్రిస్టల్ నిర్మాణాలు అందుబాటులో ఉన్నాయి22,23. మరోవైపు, పొర లోపల VSDల మధ్య ఇంటర్‌ఫేస్ లేదు. Hv1-CiVSP చిమెరిక్ ప్రోటీన్ యొక్క క్రిస్టల్ నిర్మాణం ఈ ఇంటర్‌ఫేస్ గురించి సమాచారాన్ని అందించదు, ఎందుకంటే స్ఫటికీకరించిన ఛానల్ కాంప్లెక్స్ యొక్క ట్రైమెరిక్ ఆర్గనైజేషన్ స్థానిక Hv1 CCDని ఈస్ట్ లూసిన్ జిప్పర్ GCN424 ద్వారా భర్తీ చేయడం వలన సంభవించవచ్చు. Hv1 ఛానల్ యొక్క సబ్యూనిట్ ఆర్గనైజేషన్ యొక్క ఇటీవలి అధ్యయనంలో రెండు S4 హెలిక్స్ సెకండరీ స్ట్రక్చర్ యొక్క తీవ్రమైన అంతరాయం లేకుండా CCDలోకి మారుతుందని నిర్ధారించింది, దీని ఫలితంగా పొడవాటి హెలిక్స్ పొర నుండి ప్రారంభమై సైటోప్లాజంలోకి ప్రొజెక్ట్ అవుతాయి. సిస్టీన్ క్రాస్‌లింకింగ్ విశ్లేషణ ఆధారంగా, S4 విభాగంలో Hv1 VSDలు పరస్పరం సంప్రదిస్తాయని ఈ అధ్యయనం ప్రతిపాదించింది. అయితే, ఇతర అధ్యయనాలు VSDల మధ్య ప్రత్యామ్నాయ ఇంటర్‌ఫేస్‌లను ప్రతిపాదించాయి.ఈ ఇంటర్‌ఫేస్‌లలో S1 విభాగాలు 17, 21, 26 మరియు S2 సెగ్మెంట్ యొక్క బయటి చివరలు 21. వైరుధ్యానికి గల కారణం ఈ అధ్యయనాల ఫలితాలు ఏమిటంటే, VSDల మధ్య అలోస్టెరిక్ కప్లింగ్ గేటింగ్ ప్రక్రియకు సంబంధించి పరిశీలించబడింది, ఇది క్లోజ్డ్ మరియు ఓపెన్ స్టేట్‌లపై ఆధారపడి ఉంటుంది మరియు VSDల మధ్య ఇంటర్‌ఫేస్ కన్ఫర్మేషన్‌లో వివిధ స్థితి మార్పులలో మారవచ్చు. ఇక్కడ, 2-గ్వానిడినోథియాజోల్ రెండు ఓపెన్ VSDలకు సినర్జిస్టిక్‌గా బైండింగ్ చేయడం ద్వారా Hv1 ఛానెల్‌లను నిరోధిస్తుందని మేము కనుగొన్నాము మరియు ఓపెన్ స్టేట్‌లోని సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య పరస్పర చర్యను పరిశీలించడానికి 2-గ్వానిడినోబెంజోథియాజోల్ (GBTA) అనే సమ్మేళనాలలో ఒకదాన్ని ఉపయోగించాము. ఇంటర్‌ఫేస్.GBTA బైండింగ్ కర్వ్‌ను పరిమాణాత్మక నమూనా ద్వారా చక్కగా వివరించవచ్చని మేము కనుగొన్నాము, దీనిలో ఒక సబ్‌యూనిట్‌కు ఇన్హిబిటర్‌ని బైండింగ్ చేయడం వలన ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్ యొక్క బైండింగ్ అనుబంధం పెరుగుతుంది. అవశేషాలు D112, సెలెక్టివిటీ ఫిల్టర్‌లను కూడా మేము కనుగొన్నాము. ఛానెల్ 27, 28 మరియు గ్వానిడైన్ డెరివేటివ్ బైండింగ్ సైట్ 29లో కొంత భాగం GBTA బైండింగ్ సహకారాన్ని నియంత్రిస్తుంది. CCD S4 సెగ్మెంట్ నుండి వేరు చేయబడిన Hv1 డైమర్‌లో సహకార బైండింగ్ నిర్వహించబడుతుందని మేము చూపిస్తాము, CCDలోని ఇంటర్‌సబ్యూనిట్ ఇంటర్‌ఫేస్ నేరుగా ఉండదని సూచిస్తుంది. GBTA-బైండింగ్ సైట్‌ల మధ్య అలోస్టెరిక్ కప్లింగ్‌ను మధ్యవర్తిత్వం చేయండి. దీనికి విరుద్ధంగా, S1 ఫ్రాగ్‌మెంట్ సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య ఇంటర్‌ఫేస్‌లో భాగమని మేము కనుగొన్నాము మరియు డైమర్ మధ్యలో నుండి దూరంగా S4 హెలిక్స్ యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ ఎండ్‌తో ప్రక్కనే ఉన్న VSDల అమరికను ప్రతిపాదిస్తాము. S1 భాగం ఓపెన్ స్టేట్‌లో ఉండాలి. Hv1 యొక్క చిన్న మాలిక్యూల్ ఇన్హిబిటర్లు క్యాన్సర్ నిరోధక మందులు మరియు న్యూరోప్రొటెక్టివ్ ఏజెంట్లుగా ఉపయోగపడతాయి. అయితే, ఈ రోజు వరకు, కొన్ని సమ్మేళనాలు ఛానెల్‌ని నిరోధించగలిగాయి. వాటిలో 2-గ్వానిడినోబెంజిమిడాజోల్ (2GBI, సమ్మేళనం [1]) 1a) మరియు దాని ఉత్పన్నాలు ఛానెల్ ద్వారా ప్రోటాన్‌ల యొక్క VSD29,32 పారగమ్యతను నిరోధించడం కనుగొనబడింది.అటువంటి సమ్మేళనాల బైండింగ్ రెండు ఓపెన్ సబ్‌యూనిట్‌లలో స్వతంత్రంగా జరుగుతుందని భావిస్తారు.2-guanidinobenzothiazole (GBTA, సమ్మేళనం Figure 1a) 200 μM (Figure 1b) ఏకాగ్రతతో పరీక్షించినప్పుడు Hv1 దాదాపుగా 2GBI ని నిరోధించినట్లు చూపబడింది. మేము ఇతర థియాజోల్ ఉత్పన్నాలను పరిశీలించాము మరియు వాటిలో కొన్ని GBTA కంటే సారూప్యమైన లేదా ఎక్కువ శక్తితో ఛానెల్‌ని నిరోధించాయని కనుగొన్నాము (Fig. 1 మరియు అనుబంధం text).మేము నాలుగు థియాజోల్ డెరివేటివ్‌ల (GBTA మరియు సమ్మేళనాలు [3], [6] మరియు [11], Fig. 1c) యొక్క ఏకాగ్రత ప్రతిస్పందన వక్రతలను నిర్ణయించాము మరియు అవి 2GBI కంటే కోణీయంగా ఉన్నాయని కనుగొన్నాము.ది హిల్ కోఎఫీషియంట్స్ (h) థియాజోల్ ఉత్పన్నాలు 1.109 ± 0.040 నుండి 1.306 ± 0.033 వరకు ఉన్నాయి (Fig. 1c మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1).దీనికి విరుద్ధంగా, 2GBI కోసం హిల్ కోఎఫీషియంట్ 0.975 ± 0.024 29, ఫిగ్. 2a మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1). 1 పైన ఉన్న హిల్ కోఎఫీషియంట్ బైండింగ్ కోఆపరేటివిటీని సూచిస్తుంది. ఎందుకంటే ప్రతి దాని స్వంత Hv1 సబ్‌హిబిట్ లేదా సబ్‌యూనిట్‌ని కలిగి ఉంటుంది. బైండింగ్ సైట్, 29,32 థయాజోల్ ఉత్పన్నాన్ని ఒక సబ్‌యూనిట్‌కి బంధించడం వలన రెండవ ఇన్హిబిటర్ మాలిక్యూల్‌ను ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్‌కు బంధించడం మెరుగుపరుస్తుందని మేము వాదించాము.GBTA అనేది అత్యధిక హిల్ కోఎఫీషియంట్ ఉన్న టెస్ట్ సమ్మేళనం. కాబట్టి, మేము ఈ సమ్మేళనాన్ని ఎంచుకున్నాము బైండింగ్ సినర్జీ యొక్క యంత్రాంగాన్ని మరింత అధ్యయనం చేయండి మరియు 2GBIని సూచన ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగించింది. (a) పరీక్ష సమ్మేళనాలు: [1] సూచన Hv1 నిరోధకం 2-గ్వానిడినో-బెంజిమిడాజోల్ (2GBI).[2] 2-గ్వానిడినో-బెంజోథియాజోల్ (GBTA), [3] (5-ట్రిఫ్లోరోమీథైల్-1,3-బెంజోథియాజోల్-2-yl)గ్వానిడిన్, [4] నాఫ్తో[1,2-d][1, 3] థియాజోల్-2-yl -గ్వానిడిన్, [5](4-మిథైల్-1,3-థియాజోల్-2-యల్)గ్వానిడిన్, [6](5-బ్రోమో-4-మిథైల్-1,3-థియాజోల్- 2-ఐఎల్)గ్వానిడిన్, [7] ఫామోటిడిన్, [8] 2-గ్వానిడినో-5-మిథైల్-1,3-థియాజోల్-4-కార్బాక్సిలిక్ యాసిడ్ ఇథైల్ ఈస్టర్, [9] 2-గ్వానిడినో-4-మిథైల్ ఇథైల్-1,3-థియాజోల్-5-కార్బాక్సిలేట్, [10 ](2-గ్వానిడినో-4-మిథైల్-1,3-థియాజోల్-5-yl)ఇథైల్ అసిటేట్, [11]1-[4-(4 -క్లోరోఫెనిల్)-1,3-థియాజోల్-2-యల్]గ్వానిడిన్, [ 12]1-[4-(3,4-డైమెథాక్సిఫెనిల్)-1,3-థియాజోల్-2-యల్]గ్వానిడిన్ .(బి) సూచించిన గ్వానిడినోథియాజోల్స్ మరియు రిఫరెన్స్ కాంపౌండ్ 2GBI (బ్లూ-గ్రీన్ బార్‌లు) ద్వారా మానవ Hv1 కార్యాచరణను నిరోధించడం .Hv1 ప్రోటాన్ ప్రవాహాలు -80 mV నుండి +120 mV వరకు ఉన్న డిపోలరైజేషన్‌కు ప్రతిస్పందనగా Xenopus oocytes యొక్క ఇన్‌సైడ్-అవుట్ ప్లేక్‌లలో కొలుస్తారు. ప్రతి నిరోధకం 200 μM గాఢతతో స్నానానికి జోడించబడింది.pHi = pHo = 6.0 .డేటా సగటు ±SEM (n≥4).(c) సమ్మేళనాల ద్వారా మానవ Hv1 యొక్క ఏకాగ్రత-ఆధారిత నిరోధం [2], [3], [6] మరియు [11].ప్రతి పాయింట్ 3 యొక్క సగటు నిరోధం ± SDని సూచిస్తుంది. 15 కొలతలకు. సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1లో నివేదించబడిన స్పష్టమైన Kd విలువలను పొందేందుకు ఈ లైన్ హిల్ ఫిట్‌గా ఉంటుంది. సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1: h(1) = 0.975 ± 0.024 h(2) = 1.306 ±లో నివేదించబడిన ఫిట్‌ల నుండి హిల్ కోఎఫీషియంట్స్ నిర్ణయించబడ్డాయి. 0.033, h(3) = 1.25 ± 0.07, h(6) = 1.109 ± 0.040, h (11) = 1.179 ± 0.036 (పద్ధతులు చూడండి). (a,b) సమ్మేళనాలు 2GBI మరియు GBTA ఏకాగ్రత-ఆధారిత పద్ధతిలో డైమెరిక్ మరియు మోనోమెరిక్ Hv1ని నిరోధించాయి. ప్రతి పాయింట్ 3 నుండి 8 కొలతల సగటు నిరోధం ± SDని సూచిస్తుంది మరియు వక్రరేఖ హిల్ ఫిట్‌గా ఉంటుంది. హిల్ కోఎఫీషియంట్స్ (h)లో చూపబడింది సప్లిమెంటరీ ఫిగ్స్ 3 మరియు 4లో నివేదించబడిన ఫిట్‌ల నుండి ఇన్‌సెట్ హిస్టోగ్రామ్‌లు నిర్ణయించబడ్డాయి. (a)లో చూపబడిన GBTA యొక్క ఏకాగ్రత ప్రతిస్పందన అంజీర్ 1cలో అదే విధంగా ఉంటుంది. స్పష్టమైన Kd విలువల కోసం అనుబంధ పట్టిక 1 చూడండి.(c) మోడలింగ్ డైమెరిక్ Hv1కి GBTA యొక్క సహకార బైండింగ్. ఘనమైన నలుపు రేఖ సమీకరణం (6) ద్వారా ప్రయోగాత్మక డేటాకు సరిపోతుందని సూచిస్తుంది, ఇది (d)లో చూపిన బైండింగ్ మోడల్‌ను వివరిస్తుంది. సబ్ 1 మరియు సబ్ 2 లేబుల్ చేయబడిన డాష్ లైన్‌లు బైమోలిక్యులర్ అసోసియేషన్‌ను సూచిస్తాయి. -వరుసగా మొదటి మరియు రెండవ బైండింగ్ ఈవెంట్‌ల డిస్సోసియేషన్ సమతౌల్య వక్రతలు (ఉప 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; సబ్ 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29.3 ± 2.5 ).(d) Hv1 బ్లాక్ యొక్క ప్రతిపాదిత మెకానిజం యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. GBTA విషయంలో, ఒక ఓపెన్ సబ్‌యూనిట్‌కు బంధించడం ప్రక్కనే ఉన్న ఓపెన్ సబ్‌యూనిట్ (Kd2 ఛానెల్‌కు GBTA యొక్క సహకార బైండింగ్‌ను పరిమాణాత్మకంగా వివరించడానికి, మేము ఒక నమూనాను ఉపయోగించాము, దీనిలో ఉపవిభాగమైన Kd1 (Fig. 2c, Sub 1, OO+ B ⇆ BO* ) బైమోలిక్యులర్ రియాక్షన్‌ని అనుసరించి మొదటి ఇన్‌హిబిటర్ మాలిక్యూల్‌ను బంధించవచ్చు. బైండింగ్ అనేది ఛానెల్‌ని అవలంబించే స్థితిని కలిగిస్తుంది, దీనిలో మిగిలిన ఖాళీ సబ్‌యూనిట్‌లు డిస్సోసియేషన్ స్థిరాంకం Kd2తో ప్రత్యేకమైన బైమోలిక్యులర్ రియాక్షన్ తర్వాత ఇన్‌హిబిటర్‌తో బంధిస్తాయి, ఇక్కడ Kd2 రెండవ ఇన్హిబిటర్ మాలిక్యూల్ బంధించబడిన తర్వాత, రెండు సబ్‌యూనిట్‌లు డిస్సోసియేషన్ స్థిరాంకం Kd2 (Fig. 2d)ని కలిగి ఉంటాయి. ఛానల్ నిరోధం డిపోలరైజింగ్ పరిస్థితులలో (+120 mV) కొలుస్తారు. ఒక ఓపెన్ మరియు ఒక క్లోజ్డ్ సబ్‌యూనిట్‌తో ఛానెల్ జాతులు (పరివర్తన CC ⇄ OC ⇄ చూడండి Fig. 2dలోని OO) ఈ పరిస్థితులలో Hv1 కరెంట్‌కు అతితక్కువగా దోహదపడుతుందని గతంలో కనుగొనబడింది19,20 మరియు అందువల్ల అవి బైండింగ్ మోడల్‌లో చేర్చబడలేదు. Figure 2cలోని ఘన నలుపు రేఖ అనేది ప్రయోగాత్మక ఏకాగ్రత-ప్రతిస్పందన వక్రరేఖకు మోడల్ సమీకరణం యొక్క అమరిక, ఇది ~290 μM యొక్క Kd1 మరియు ~29 μM యొక్క Kd2 (మెథడ్స్ విభాగం, సమీకరణం (6))ను అందిస్తుంది. మోడల్ కూడా వివరిస్తుంది. 2GBI యొక్క బైండింగ్, ఇక్కడ Kd2 ≈ Kd1 = Kd (Fig. 2d). మోనోమెరిక్ Hv1లో, ఒక బైండింగ్ సైట్ మరియు ఒక Kdm (O° + B ⇆ B°) మాత్రమే ఉంటుంది. GBTA విషయంలో, Kdm దాదాపు 54 μM, ఇది Kd2 కంటే Kd1ని పోలి ఉంటుంది (Fig. 2d). మరో మాటలో చెప్పాలంటే, మోనోమర్ యొక్క బైండింగ్ సైట్ తక్కువ-అనుబంధ స్థితి (BO*) కంటే ఎక్కువ కాన్ఫిగరేషన్ (O°)లో ఉంటుంది. డైమర్ యొక్క అనుబంధ స్థితి (OO), చాలా మటుకు సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య ఇంటర్‌ఫేస్ తొలగింపు కారణంగా. మునుపు 2GBI32 కోసం చూపినట్లుగా, GBTA Hv1 కరెంట్‌లను తెరవడాన్ని కష్టతరం చేయడం ద్వారా కాకుండా ఛానెల్ తెరిచినప్పుడు దాన్ని నిరోధించడం ద్వారా అణచివేసినట్లు మేము కనుగొన్నాము (అనుబంధ Fig. 2a,b,d).2GBI కూడా నెమ్మదిగా క్షీణిస్తున్న టెయిల్ కరెంట్‌లను ప్రేరేపిస్తుంది. మెమ్బ్రేన్ రీపోలరైజేషన్‌కు ప్రతిస్పందనగా, కానీ ఈ దృగ్విషయం GBTA (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2c)లో గమనించబడలేదు. 2GBI సమక్షంలో Hv1 ఇన్‌యాక్టివేషన్ సమక్షంలో, బ్లాకర్ బైండింగ్ సైట్ నుండి నిష్క్రమించే వరకు ప్రతి సబ్‌యూనిట్‌లోని గేట్‌లు మూసివేయబడవు (ది " ఫుట్ గేట్" మెకానిజం), మరియు 2GBI గేట్లు మూసివేయడం కంటే నెమ్మదిగా అన్‌బైండ్ చేస్తుంది. ఒక Hv1 సబ్‌యూనిట్ అన్‌బ్లాక్ చేయబడి మరియు మూసివేయబడితే, ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్ బ్లాక్ చేయబడి ఉంటే, మిగిలిన 2GBI అణువుల అన్‌బైండింగ్ నెమ్మదిగా మారుతుంది (బ్లాకర్ క్యాప్చర్).దీర్ఘకాలిక ఛానెల్ జాతులు ఒక బ్లాక్ చేయబడిన సబ్‌యూనిట్ మాత్రమే క్లోజ్ చేసే ముందు ప్రోటాన్‌లను తాత్కాలికంగా నిర్వహిస్తుంది మరియు నెమ్మదిగా క్షీణిస్తున్న టెయిల్ కరెంట్‌కు గణనీయమైన సహకారం అందిస్తుంది. GBTA (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2c) సమక్షంలో Hv1 టెయిల్ కరెంట్‌ల క్షయం గణనీయంగా మందగించలేదని కనుగొన్నది ఈ బ్లాకర్ (Fig. 2d) కోసం ఒక సినర్జిస్టిక్ బైండింగ్ మెకానిజంకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. ఒకసారి GBTA అణువు Hv1 సబ్‌యూనిట్ నుండి అన్‌బౌండ్ చేయబడి ఉంటుంది. , ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్‌కు బ్లాకర్ యొక్క అనుబంధం దాదాపు 10 రెట్లు పడిపోతుంది, ఇది అన్‌బైండింగ్ ప్రక్రియకు అనుకూలంగా ఉంటుంది. దీనర్థం GBTA యొక్క రెండవ అణువు ఛానెల్‌లో చిక్కుకోకముందే విప్పే అవకాశం చాలా ఎక్కువ. దీర్ఘకాలం జీవించే ఛానెల్ జాతులు 2GBI సమక్షంలో కంటే GBTA సమక్షంలో ఒక బ్లాకింగ్ సబ్‌యూనిట్‌ను మాత్రమే ఉత్పత్తి చేయడం చాలా ఎక్కువగా ఉంటుందని అంచనా వేయబడింది, దీని ఫలితంగా టెయిల్ కరెంట్ వేగంగా క్షీణిస్తుంది. GBTA రెండు Hv1 సబ్‌యూనిట్‌లతో సహకరిస్తూ బైండ్ చేయడానికి, బైండింగ్ సైట్‌లు తప్పనిసరిగా అలోస్టెరికల్ కపుల్డ్ చేయబడాలి. ప్రతి బైండింగ్ సైట్ తప్పనిసరిగా వీటిని కలిగి ఉండాలి: 1) ఇన్‌హిబిటర్‌కు కట్టుబడి ఉన్న ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్‌లతో కమ్యూనికేట్ చేసే ఈవెంట్‌ల గొలుసును ప్రేరేపించడం మరియు 2) మధ్యవర్తిత్వం చేయడం తక్కువ అనుబంధం నుండి హై-అఫినిటీ బైండింగ్‌కి మార్పు. బైండింగ్ సైట్‌లోని నిర్దిష్ట అవశేషాలు సహకార ప్రక్రియకు దోహదం చేస్తే, వాటి మ్యుటేషన్ Hv1 యొక్క GBTA నిరోధం యొక్క ఏకాగ్రత-ప్రతిస్పందన వక్రరేఖ యొక్క హిల్ కోఎఫీషియంట్‌ను మార్చాలని మేము వాదించాము. అవశేషాలు D112, F150 , S181 మరియు R211 గతంలో 2GBI29 బైండింగ్ ఎన్విరాన్మెంట్‌లో భాగమని చూపబడ్డాయి మరియు అవి అదేవిధంగా GBTA బైండింగ్ (Fig. 3A)లో పాల్గొంటాయని మేము ఊహించాము. మేము ఉత్పరివర్తన ఛానెల్‌లు D112E, F1810A, S1810A, S1810A, GBTA యొక్క నిరోధక ఏకాగ్రత-ప్రతిస్పందన వక్రతలను కొలిచాము. , మరియు R211S (Figure 3) మరియు వాటి హిల్ కోఎఫీషియంట్‌లను Hv1 వైల్డ్-టైప్‌తో పోల్చారు, 2GBIని రిఫరెన్స్‌గా ఉపయోగిస్తున్నారు. అవశేషాలు V109 D112 వలె S1 సెగ్మెంట్‌లో అదే ముఖంగా ఉంది మరియు సెల్ లోపల ఒక అదనపు హెలికల్ మలుపును కలిగి ఉంది. V109 2GBI29 యొక్క బైండింగ్‌లో పాల్గొనలేదు, మేము V109A ఉత్పరివర్తనను నియంత్రణగా ఉపయోగించాము (Fig. 3b). (a) గ్వానిడిన్ డెరివేటివ్ బైండింగ్‌లో పాల్గొన్న సూచించబడిన Hv1 అవశేషాలు. 2GBI29 సమ్మేళనం యొక్క వివిధ భాగాలతో పరస్పర చర్య చేసే గతంలో ప్రతిపాదించిన సైడ్ చెయిన్‌లను డాష్ చేసిన నీలి రంగు వక్రతలు చుట్టుముట్టాయి.(bf) 2GBI (సియాన్) మరియు GBTA సమ్మేళనాల ద్వారా సూచించబడిన Hv1 ఉత్పరివర్తనాల యొక్క ఏకాగ్రత-ఆధారిత నిరోధం ( ముదురు ఎరుపు).ప్రతి పాయింట్ 3 నుండి 12 కొలతలు ± SD V109 యొక్క సగటు నిరోధాన్ని ప్రతికూల నియంత్రణగా సూచిస్తుంది. వక్రతలు స్పష్టమైన Kd విలువలను పొందేందుకు ఉపయోగించే హిల్ ఫిట్‌లు (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1 చూడండి) హిల్ కోఎఫీషియంట్స్ (h)లో చూపబడింది. సప్లిమెంటరీ ఫిగ్స్ 3 మరియు 4లో నివేదించబడిన ఫిట్‌ల నుండి ఇన్‌సెట్ హిస్టోగ్రామ్‌లు నిర్ణయించబడ్డాయి. Hv1 WT కోసం రిఫరెన్స్ h విలువలు డాష్ చేసిన పంక్తులుగా చూపబడ్డాయి. ఆస్టరిస్క్‌లు ఉత్పరివర్తన మరియు WT భాగాల మధ్య గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (p 0.05, Fig. 5d,i)తో పోలిస్తే నిరోధకం యొక్క హిల్ కోఎఫీషియంట్‌ను గణనీయంగా మార్చలేదని కనుగొన్నాము. ) మరోవైపు, మ్యుటేషన్ D123A GBTA యొక్క హిల్ కోఎఫీషియంట్‌ను గణనీయంగా తగ్గించింది (p 0.05/14). రెండు సబ్‌యూనిట్‌లలో 123వ స్థానంలో ఉన్న ఛార్జ్‌ని న్యూట్రలైజ్ చేయడం వల్ల GBTA బైండింగ్ కోఆపరేటివిటీలో బలమైన మార్పు వచ్చింది, అయితే రెండు సబ్‌యూనిట్‌లపై ఛార్జ్‌ని రివర్స్ చేయడం వల్ల కేవలం ఒక చిన్న ప్రభావం మాత్రమే ఉంది, మేము ఛార్జ్ యొక్క ఇన్‌వర్షన్ ఛానెల్‌తో ఒక సబ్‌యూనిట్‌ను మాత్రమే చేర్చడానికి విశ్లేషణను పొడిగించాము. C-టెర్మినల్ సబ్యూనిట్ (Fig. 5b)లో D123R ప్రత్యామ్నాయంతో Hv1-లింక్డ్ డైమర్‌లను రూపొందించింది మరియు GBTA మరియు 2GBI ద్వారా ఏకాగ్రత-ప్రతిస్పందన నిరోధాన్ని కొలుస్తుంది. WT-D123R ఛానెల్‌లకు GBTA బైండింగ్ యొక్క హిల్ కోఎఫీషియంట్ దాని కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉందని మేము కనుగొన్నాము. వైల్డ్-టైప్ Hv1 (p 0.05). βME లేనప్పుడు, D112E I127C Hv1 డైమర్‌కు GBTA బైండింగ్ యొక్క హిల్ కోఎఫీషియంట్ ఏజెంట్లను తగ్గించే (Fig. 6e మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4) సమక్షంలో కొలిచిన దాని కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉందని మేము కనుగొన్నాము, ఇది D112E మ్యుటేషన్‌ని సూచిస్తుంది. సిస్టీన్ 127 యొక్క క్రాస్-లింకింగ్ ఫలితంగా ఏర్పడే GBTA బైండింగ్ సహకార పెరుగుదలను రద్దు చేయలేదు. D112E, I127C Hv1 డైమర్‌లకు 2GBI బైండింగ్ యొక్క హిల్ కోఎఫీషియంట్ కూడా D112E మ్యుటేషన్ (మూర్తి 1) 6d మరియు సప్లిమెంటరీ ద్వారా గణనీయంగా ప్రభావితం కాలేదు. అత్తి 3). కలిసి చూస్తే, ఆకర్షణీయమైన ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఇంటరాక్షన్‌ల ద్వారా ప్రక్కనే ఉన్న Hv1 సబ్‌యూనిట్‌లలోని S1 శకలాలు బయటి చివరల మధ్య పరస్పర చర్య ద్వారా లేదా ప్రత్యామ్నాయ సిస్టీన్‌ల మధ్య సమయోజనీయ బంధాల ఏర్పాటు ద్వారా GBTA బైండింగ్ మెరుగుపడుతుందని ఈ పరిశోధనలు సూచిస్తున్నాయి. సహకారంపై ఆకర్షణీయమైన ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యల ప్రభావం మ్యుటేషన్ D112E ద్వారా రద్దు చేయబడవచ్చు, సమయోజనీయ బంధాల ప్రభావం సాధ్యం కాదు. Hv1 ఛానెల్‌లకు గ్వానిడిన్ ఉత్పన్నాలను బంధించడానికి అందుబాటులో ఉన్న రసాయన స్థలాన్ని మా అన్వేషణలో, GBTA వంటి 2-గ్వానిడినోథియాజోల్స్ 2-guanidinobenzimidazoles (Fig. 1c) కంటే ఎక్కువ గాఢత ఆధారపడటాన్ని కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము. మరియు మోనోమెరిక్ ఛానెల్‌లు (Fig. 2a,b) మరియు డైమెరిక్ ఛానెల్‌లో ఒక సబ్‌యూనిట్ ఇన్‌హిబిటర్‌కు ముందుగా కట్టుబడి ఉంటుంది (Fig. 4) GBTA ద్వారా Hv1 యొక్క నిరోధం చర్య ఒక సినర్జిస్టిక్ ప్రక్రియ అని నిర్ధారించడానికి మాకు దారితీసింది, మరియు రెండు సబ్‌యూనిట్‌లలోని సమ్మేళనాల బైండింగ్ సైట్‌లు అలోస్టెరికల్‌గా జతచేయబడతాయి. సంబంధిత సమ్మేళనం 2GBI32 కోసం గతంలో చూపిన విధంగా, GBTA ఓపెన్ ఛానెల్‌కి బంధిస్తుంది అనే ఆవిష్కరణ, అలోస్టెరిక్ కప్లింగ్‌ను ప్రత్యేకంగా ఓపెన్ స్టేట్‌లో అంచనా వేయవచ్చని సూచిస్తుంది.మా సహకార బైండింగ్ మోడల్ GBTA (Fig. 2c) ద్వారా Hv1 నిరోధాన్ని పరిమాణాత్మకంగా వివరించగలిగింది మరియు మెమ్బ్రేన్ రీపోలరైజేషన్ తర్వాత ఛానెల్ టెయిల్ కరెంట్‌ల క్షీణతపై 2GBI మరియు GBTA యొక్క విభిన్న ప్రభావాలను వివరించగలిగింది, ఇది బైండింగ్ ప్రక్రియ యొక్క మా వివరణకు మద్దతు ఇస్తుంది. రెండు బైండింగ్ సైట్‌లతో (హెచ్‌వి 1 వంటివి) అలోస్టెరిక్ ప్రోటీన్‌లో సాధించగల గరిష్ట కొండ గుణకం 2. మేము హెచ్‌వి 1 వైల్డ్-టైప్‌ను 1.31 గుణకంతో బంధించడానికి GBTA ను కొలిచాము, ఇది HV1 I127C.THE లో 1.88 కు పెరిగింది. సినర్జిస్టిక్ ఫ్రీ ఎనర్జీ, అత్యల్ప మరియు అత్యధిక అనుబంధ సైట్ల యొక్క బైండింగ్ ఉచిత శక్తుల మధ్య వ్యత్యాసం (పద్ధతులు చూడండి), HV1 వైల్డ్-టైప్ విషయంలో 1.3 కిలో కేలరీలు/మోల్ మరియు HV1 I127C విషయంలో 2.7 కిలో కేలరీలు/మోల్. హిమోగ్లోబిన్ నుండి ఆక్సిజన్ సహకార ప్రక్రియ యొక్క అత్యంత ప్రసిద్ధ మరియు బాగా అధ్యయనం చేయబడిన ఉదాహరణ 38. మానవ హిమోగ్లోబిన్ (నాలుగు అలోస్టర్‌గా కపుల్డ్ బైండింగ్ సైట్‌లతో కూడిన టెట్రామర్) కోసం, కొండ గుణకం 2.5-3.0 నుండి, విలువలు 1.26 నుండి 3.64 వరకు ఉంటాయి Kcal/mol, ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులను బట్టి, ప్రపంచ శక్తి పరంగా, రెండు వ్యవస్థలలోని వివిధ సంఖ్యలో ప్రోటీన్ సబ్‌యూనిట్‌లను పరిగణించినప్పుడు HV1 కి GBTA బైండింగ్ యొక్క సహకారం O2 బైండింగ్ నుండి హిమోగ్లోబిన్‌తో గణనీయంగా భిన్నంగా లేదు. మా సినర్జీ మోడల్‌లో, GBTA అణువులను ఒక సబ్యూనిట్‌కు బంధించడం వలన ప్రక్కనే ఉన్న సబ్యూనిట్ యొక్క బైండింగ్ అనుబంధం పెరుగుతుంది. మేము ఒక ప్రక్రియ ఈ మార్పులకు సబ్‌యూనిట్స్.ఇన్ ప్రతిస్పందన మధ్య పరస్పర చర్యలలో మార్పులు, ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్‌లు వాటి బైండింగ్ సైట్‌లను మారుస్తాయి, దీని ఫలితంగా కఠినమైన GBTA బైండింగ్ వస్తుంది. ఈ ప్రక్రియను తగ్గించడం, పెరిగిన బైండింగ్ అనుబంధంతో అనుబంధించబడిన బైండింగ్ సైట్ యొక్క పునర్వ్యవస్థీకరణకు S1 అస్పార్టేట్ D112 బాధ్యత వహిస్తుంది. D112 గతంలో HV1 ప్రోటాన్ పారగమ్య మార్గంలో భాగమని మరియు సెలెక్టివిటీ ఫిల్టర్ 27,28 గా వ్యవహరించడానికి చూపబడింది. మా ఫలితాలు రెండు హెచ్‌వి 1 సబ్‌యూనిట్‌లలోని సెలెక్టివిటీ ఫిల్టర్‌లు ఓపెన్ స్టేట్‌లో అలోస్టిక్‌గా జతచేయబడిందని చూపిస్తుంది. ఫిగర్ 7 ఎ GBTA బైండింగ్ సైట్ యొక్క సుమారు స్థానాన్ని మరియు HV1 VSD ఆధారిత స్కీమాటిక్ మీద D112, D123, K125 మరియు I127 అవశేషాల స్థానాన్ని చూపిస్తుంది. HV1-CIVSP చిమెరా యొక్క క్రిస్టల్ నిర్మాణంపై. S1 యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ ఎండ్‌తో కూడిన అలోస్టెరిక్ కలపడం కోసం సగెడ్ దిశలు నల్ల బాణాలతో చూపబడతాయి. . బౌండ్ GBTA యొక్క fors హించిన స్థానాలు బూడిద అండాకారంగా చూపబడ్డాయి. బ్లాక్ బాణాలు రెండు ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్లలో బైండింగ్ సైట్ల మధ్య అలోస్టెరిక్ కలపడంలో పాల్గొన్న మార్గాలను సూచిస్తాయి. పరిశోధించిన S1 అవశేషాల స్థానాలు రంగు గోళాలతో గుర్తించబడతాయి. మెమ్బ్రేన్ ప్లేన్ యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ వైపు నుండి కనిపించే రెండు వేర్వేరు డైమర్ కాన్ఫిగరేషన్లలో, ఎడమ ప్యానెల్‌లో, డైమర్ ఇంటర్‌ఫేస్ S4 హెలిక్స్ చేత ఏర్పడుతుంది. రెండు VSD ల యొక్క 20 డిగ్రీల యొక్క రోటేషన్ పొర విమానానికి లంబంగా ఉన్న అక్షం చుట్టూ 20 డిగ్రీల సవ్యదిశలో సవ్యదిశలో ఉంటుంది రెండు S4 హెలిక్‌ల (డాష్ చేసిన బాణాలు) యొక్క బయటి చివరలను వేరుచేయడం, కుడి వైపున చూపిన అమరికను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఈ కాన్ఫిగరేషన్‌లో, ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్ల నుండి అవశేషాలు D123 మరియు I127 దగ్గరగా రావడానికి అనుమతించబడతాయి. (సి) సివల్ VSD 4G80 క్రిస్టల్ స్ట్రక్చర్‌లో కనిపించే డైమర్ కాన్ఫిగరేషన్‌లో. CIVSP లో POPISION P140 HV1 లోని D123 స్థానానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది. మా ఫలితాలు అవశేష 123 (123 డి/123 డి లేదా 123 ఆర్/123 ఆర్) మధ్య వికర్షక ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్య బహిరంగ స్థితిలో "సాధారణ" GBTA- బైండింగ్ కోఆపరేటివిటీ యొక్క "సాధారణ" స్థాయితో సంబంధం కలిగి ఉందని మరియు వికర్షణ నుండి ఆకర్షితుడవుతుంది (123D/123R) . వివరణ ఏమిటంటే, హైడ్రోఫోబిక్ అవశేషాలను హైడ్రోఫిలిక్ వాతావరణంలో ఉంచడం యొక్క అస్థిర ప్రభావం D123 అవశేషాల మధ్య వికర్షక పరస్పర చర్యలను తొలగించడం వల్ల స్థిరీకరణ ప్రభావాన్ని అధిగమిస్తుంది, దీని ఫలితంగా సహకారం మరియు ఇతరులు మరియు ఇతరులు 39 ఇటీవల నివేదించిన ద్రావణి ప్రాప్యత. సియోనా గుటిస్ CI-HV1 యొక్క స్థానం D171 (మానవ HV1 లో D123 కు అనుగుణంగా) క్రియాశీలతపై పెరుగుతుంది, ఇది D123 బహిరంగ స్థితిలో హైడ్రోఫిలిక్ వాతావరణంలో ఉందనే భావనకు మద్దతు ఇస్తుంది. HV1 ఛానెళ్ల గేటింగ్ బహుళ పరివర్తనల ద్వారా సంభవిస్తుందని అంటారు. , రెండు సబ్‌యూనిట్ల మార్గంలో ప్రోటాన్‌లను తెరిచే ఒక ప్రత్యేకమైన పరివర్తన తరువాత. వోల్టేజ్ సెన్సార్ యొక్క కన్ఫర్మేషనల్ మార్పు వోల్టేజ్-క్లాంప్ ఫ్లోరోసెన్స్ ద్వారా పర్యవేక్షించబడింది మరియు రెండవ పరివర్తన D171 స్థానం వద్ద మ్యుటేషన్ ద్వారా ఎంపిక చేయబడిందని కనుగొనబడింది. ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ యొక్క కలత అనేది ఒక సమయంలో ప్రక్కనే ఉన్న సబ్‌యూనిట్‌ల యొక్క D171 అవశేషాల మధ్య ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యల ఉనికికి అనుగుణంగా ఉంటుంది. మరియు GBTA బైండింగ్ సైట్ల మధ్య అలోస్టెరిక్ కలపడానికి మధ్యవర్తిత్వం చేస్తుంది. సైటోప్లాస్మిక్ కాయిల్డ్-కాయిల్ డొమైన్ యొక్క డైమర్ ఇంటర్ఫేస్ రెండు S4 హెలిక్‌లను కలిగి ఉండటానికి పొరలో విస్తరించిందని ఫుజివారా మరియు ఇతరులు ప్రతిపాదించారు (Fig. 7B, ఎడమ పానెల్) .ఈ ఇంటర్‌సబ్యూనిట్ ఇంటరాక్షన్ యొక్క మోడల్ సిస్టీన్ క్రాస్-లింకింగ్ విశ్లేషణ కవరింగ్ మీద ఆధారపడి ఉంటుంది S4 హెలిక్స్ మరియు CCD ని అనుసంధానించే ప్రాంతం యొక్క మొత్తం VSD మరియు క్రియాత్మక విశ్లేషణ. అందువల్ల, కనుగొనబడిన S4-S4 ఇంటర్ఫేస్ ఆఫ్-స్టేట్ సబ్యూనిట్ కాన్ఫిగరేషన్‌ను ప్రతిబింబిస్తుంది. ఇతర అధ్యయనాలు గేటింగ్ 17,21,26 సమయంలో ఇంటర్‌సబూనిట్ పరస్పర చర్యలలో S1 మరియు S2 యొక్క ప్రమేయానికి ఆధారాలు కనుగొన్నాయి, ఛానెల్‌లు బహిరంగంగా వేర్వేరు సబ్‌యూనిట్ ఆకృతీకరణలను అవలంబించవచ్చని సూచిస్తున్నాయి మరియు క్లోజ్డ్ స్టేట్స్, మోనీ మరియు ఇతరుల ఫలితాలకు అనుగుణంగా ఒక ఆలోచన. గేటింగ్ సమయంలో ఎస్ 1 39 కదులుతుంది. ఇక్కడ, బహిరంగ స్థితిలో, S1 హెలిక్స్ యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ ఎండ్స్ సబ్‌యూనిట్ల మధ్య అలోస్టెరిక్ కలపడానికి మధ్యవర్తిత్వం చేసే ప్రత్యక్ష ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యలకు మద్దతు ఇవ్వడానికి తగినంత దగ్గరగా ఉన్నాయని మేము చూపిస్తాము. డైమర్ కాన్ఫిగరేషన్‌లో విస్తరించిన S4-S4 పరస్పర చర్యలతో, S1 హెలిక్‌లు చాలా దూరం ఉన్నాయి నేరుగా సంకర్షణ చెందడానికి ఒకదానికొకటి కాకుండా. అయితే, పొర విమానానికి లంబంగా ఉన్న అక్షం చుట్టూ రెండు VSD సబ్‌యూనిట్ల యొక్క 20 ° సవ్యదిశలో భ్రమణం, రెండు S4 హెలిక్‌ల యొక్క బయటి చివరలను వేరుతో కలిపి, S1-S1 కాన్ఫిగరేషన్ స్థిరమైనది. మా పరిశోధనలతో (Fig. 7B, కుడి పానెల్). మేము ఓపెన్ స్టేట్‌లో ఛానెల్ కోసం ఈ కాన్ఫిగరేషన్‌ను సిఫార్సు చేస్తున్నాము. సివిఎస్పీ ఎంజైమ్ మోనోమర్‌గా పనిచేస్తుందని భావించినప్పటికీ, దాని వివిక్త VSD యొక్క క్రిస్టల్ నిర్మాణం డైమర్ స్థితిలో సంగ్రహించబడుతుంది. ఈ డైమ్‌లోని S1 హెలిక్‌ల యొక్క బయటి చివరలు ప్రాదేశికంగా దగ్గరగా ఉంటాయి మరియు మొత్తం కాన్ఫిగరేషన్ ప్రతిపాదిత మాదిరిగానే ఉంటుంది HV1 (Fig. 7C) కొరకు. CIVSP డైమర్‌లో, ప్రక్కనే ఉన్న సబ్యూనిట్ నుండి దగ్గరి అవశేషాలు 140 (Fig. 7C) వద్ద ప్రోలిన్. మరియు ఈ ప్రోటీన్ల యొక్క VSD లు S1 యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ చివరలు సంకర్షణ చెందుతున్న ఇంటర్‌ఫేస్‌ను ఏర్పరుచుకునే అంతర్గత ధోరణిని కలిగి ఉన్నాయని సివిఎస్పి డైమర్స్ సూచిస్తున్నాయి. స్పెర్మ్ సెల్ యాక్టివేషన్‌లో హెచ్‌వి 1 యొక్క ముఖ్యమైన పాత్ర ఈ ఛానెల్‌ను పురుష సంతానోత్పత్తి నియంత్రణకు ఆకర్షణీయమైన drug షధ లక్ష్యంగా చేస్తుంది. ఫారమ్, మైక్రోగ్లియాలో హెచ్‌వి 1 యొక్క క్రియాశీలత ఇస్కీమిక్ స్ట్రోక్ నుండి కోలుకోవడాన్ని మరింత దిగజార్చినట్లు తేలింది. మెరుగుపరచబడిన హెచ్‌వి 1 కార్యాచరణ తక్కువతో సంబంధం కలిగి ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది. రొమ్ము 12 లేదా కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్ ఉన్న రోగులలో మనుగడ 13 మరియు బి-సెల్ ప్రాణాంతకతకు దోహదం చేస్తుందని భావిస్తున్నారు 11 .అయితే, HV1 ను లక్ష్యంగా చేసుకుని చిన్న అణువుల drugs షధాలను న్యూరోప్రొటెక్టివ్ ఏజెంట్లు లేదా యాంటీకాన్సర్ థెరప్యూటిక్స్గా ఉపయోగించవచ్చు. ఓపెన్ హెచ్‌వి 1 సబ్యూనిట్, పెరిగిన అనుబంధానికి దారితీస్తుంది, హెచ్‌వి 1 ఛానెల్‌లను లక్ష్యంగా చేసుకుని మరింత శక్తివంతమైన drugs షధాల అభివృద్ధికి దారితీస్తుంది. మానవ HV1 యొక్క సైట్-దర్శకత్వ ఉత్పరివర్తన ప్రామాణిక PCR పద్ధతులను ఉపయోగించి జరిగింది. HV1NCCIVSP నిర్మాణంలో, HV1 యొక్క 1-96 మరియు 228-273 అవశేషాలు 1-113 మరియు 240-576 యొక్క అవశేషాల ద్వారా భర్తీ చేయబడ్డాయి. ఒక సబ్యూనిట్ యొక్క సి-టెర్మినస్ GGSGSGSGSGSGSGG లింకర్ ద్వారా రెండవ సబ్యూనిట్ యొక్క N- టెర్మినస్‌తో అనుసంధానించబడి ఉంది. వివిధ నిర్మాణాలను కలిగి ఉన్న PGEMHE ప్లాస్మిడ్‌లు NHE1 లేదా SPH1 పరిమితి ఎంజైమ్‌లతో సరళీకృతం చేయబడ్డాయి మరియు RNA సింథసిస్ T7 mmessage mmachine ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కిట్ (అంబియన్) .1-3 రోజుల ముందు ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ కొలతలకు, CRNA ను జెనోపస్ ఓసైట్స్‌లోకి ప్రవేశపెట్టారు (సెల్ ప్రకారం 50 nl, 0.3-1.5 ఎకోసైట్ బయోసైన్స్ నుండి. . 2-గువానిడినో-బెంజిమిడాజోల్ [1], 2-గువానిడినో-బెంజోథియాజోల్ [2], (4-మిథైల్ -1,3-థియాజోల్ -2-ఎల్) గ్వానిడిన్ [5], (5-బ్రోమో -4 -మెథైల్ -1,3 -థియాజోల్ -2-ఆల్ 5-కార్బాక్సిలేట్ [9] మరియు (2-గువానిడినో -4-మిథైల్ -1,3-థియాజోల్ -5-ఎల్) ఇథైల్ అసిటేట్ [10] సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ నుండి వచ్చాయి. ఫామోటిడిన్ [7] ఎంపి బయోమెడికల్స్ నుండి .1- [4 -(4-క్లోరోఫెనిల్) -1,3-థియాజోల్ -2-ఆల్ మ్యాట్రిక్స్ సైంటిఫిక్ నుండి. ఈ సమ్మేళనాలు వాణిజ్యపరంగా లభించే అత్యధిక స్వచ్ఛత కలిగి ఉన్నాయి. అవి 100 మిమీ స్టాక్ ద్రావణాన్ని ఉత్పత్తి చేయడానికి పొడి DMSO లో కరిగించబడ్డాయి, తరువాత రికార్డింగ్ ద్రావణంలో కావలసిన తుది ఏకాగ్రత వద్ద కరిగించబడింది. 3 మరియు 4 క్రింద సంశ్లేషణ చేయబడింది. కనీసం 99% స్వచ్ఛత. 25 మి.లీ సజల హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లం (2.5 ఎన్) లో 2-అమైనో -4- (ట్రిఫ్లోరోమీథైల్) బెంజెనెథియోల్ హైడ్రోక్లోరైడ్ (1.02 గ్రా, 4.5 మిమోల్) యొక్క సస్పెన్షన్‌కు ఘన డైసియాండిమైడ్ (380 మి.గ్రా, 4.5 మిమోల్) జోడించబడింది మరియు ఫలితంగా వైవిధ్య మిశ్రమం 4 గంటలు తీవ్రమైన గందరగోళంతో రిఫ్లక్స్ చేయబడింది. ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని గది ఉష్ణోగ్రతకు చల్లబరుస్తుంది మరియు క్రమంగా 10N పొటాషియం హైడ్రాక్సైడ్‌ను చేర్చడం ద్వారా తటస్థీకరించబడింది. ఏర్పడిన తెల్లని అవక్షేపణను ఫిల్టర్ చేసి, చల్లటి నీటితో (3 × 50 మి.లీ) కడిగి, ఓవెన్‌లో ఎండబెట్టింది (( 65 ° C) చాలా గంటలు, ఆపై తెల్లని ఘన (500 మి.గ్రా, 48 %) ఇవ్వడానికి ఇథైల్ అసిటేట్/పెట్రోలియం ఈథర్ నుండి పున ry స్థాపించబడింది; MP 221–222 ° C (కాంతి 225–226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7.25 (చాలా విస్తృత S, 4 h), 7.40 (D, 1 h, J = 8.1 Hz), 7.73 (లు, 1 h), 7.92 (D . . : 261.0419. నాఫ్తో [1,2-డి] థియాజోల్ -2-అమైన్ (300 మి.గ్రా, 1.5 మిమోల్), గతంలో వివరించిన విధంగా సంశ్లేషణ చేయబడినది, ఒక చిన్న టెస్ట్ ట్యూబ్‌లో చమురు స్నానంలో 200 ° C కు వేడి చేయబడింది .300 మి.గ్రా (పెద్ద మితిమీరిన) సైనమైడ్ మరియు 1.0 ml conc.to హాట్ కాంపౌండ్‌కు హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లం వేగంగా జోడించబడింది మరియు మిశ్రమాన్ని చమురు స్నానంలో సుమారు 2 నిమిషాలు ఉంచారు, ఈ సమయంలో నీరు చాలా ఆవిరైపోయింది. ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని గది ఉష్ణోగ్రత మరియు ఫలితంగా సాలిడ్ మెటీరియల్ కు చల్లబడి లేత పసుపు పసుపు నిరాకార ఘనతను అందించడానికి చిన్న ముక్కలుగా విభజించి నీటితో కడిగివేయబడింది. (38 మి.గ్రా, 10%) ఎంపి 246-250; C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (T, 1 h, j = 8.3 Hz), 7.77 (D, 1 hz) . MHZ, DMSO-D6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): m/z లెక్కించిన విలువ. , కనుగొనబడింది: 243.0704. ప్రోటాన్ ప్రవాహాలను ఓసైట్స్ యొక్క అంతర్గత మరియు బాహ్య పాచెస్‌లో కొలుస్తారు, ఆక్సోపాచ్ 200 బి యాంప్లిఫైయర్ ఉపయోగించి ఆక్సాన్ డిజిడాటా 1440 ఎ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) చేత నియంత్రించబడుతుంది. . టీ హైడ్రాక్సైడ్‌తో పిహెచ్ 6.0. 22 ± 2 ° C. వద్ద అన్ని కొలతలు జరిగాయి. పైపెట్ 1.5–4 MΩ యొక్క ప్రాప్యత నిరోధకతను కలిగి ఉంది. 1 kHz వద్ద కారెంట్ జాడలు ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి, 5 kHz వద్ద నమూనా చేయబడ్డాయి మరియు క్లాంప్‌ఫిట్ 10.2 తో విశ్లేషించబడ్డాయి (పరమాణు పరికరాలు (పరమాణు పరికరాలు ) మరియు మూలం 8.1 (ఆరిజిన్లేబ్). HV1 ఇన్హిబిటర్ యొక్క వివిధ సాంద్రతలను కలిగి ఉన్న పరిష్కారాలు మరియు కొన్ని సందర్భాల్లో 10 mm βme ను GATM లో గురుత్వాకర్షణ ద్వారా VC-6 పెర్ఫ్యూజన్ వాల్వ్ సిస్టమ్ (వార్నర్ ఇన్స్టా.) కు అనుసంధానించబడిన మానిఫోల్డ్ ద్వారా ప్రవేశపెట్టారు, ఇది PCLAMP సాఫ్ట్‌వేర్ TTL (ట్రాన్సిస్టర్- ట్రాన్సిస్టర్ లాజిక్) సిగ్నల్స్.రాపిడ్ పెర్ఫ్యూజన్ ప్రయోగాలు మల్టీ-ట్యూబ్ పెర్ఫ్యూజన్ పెన్సిల్ (ఆటోమేట్ సైన్స్) ఉపయోగించి 360 μm వ్యాసం కలిగిన డెలివరీ చిట్కాతో ప్యాచ్ పైపెట్ ముందు అమర్చబడి ఉన్నాయి. ఛానెల్ ఇన్హిబిషన్ ఐసోక్రోనల్ ఆంపిరోమెట్రిక్ కొలతల ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది. +120 MV డిపోలరైజింగ్ పల్స్ ప్రస్తుత క్షయం 18 కోసం సరిదిద్దడానికి ఉపయోగిస్తారు. కొండ సమీకరణంతో: ఇక్కడ [i] అనేది ఇన్హిబిటర్ I మరియు H యొక్క గా ration త కొండ గుణకం. కొండ గుణకాన్ని లెక్కించడానికి, సమీకరణం (2) ఇలా క్రమాన్ని మార్చారు: