Allosterik olarak bağlanmış bir prob ile açık Hv1 proton kanalının alt birimler arası arayüzünün sorgulanması

Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, desteğin devamı için siteyi stiller ve JavaScript olmadan göstereceğiz. Hv1 voltaj kapılı proton kanalı, her biri bir kapılı proton geçirgenlik yolu içeren iki voltaj algılama alanından (VSD) oluşan dimerik bir komplekstir. Dimerizasyon, sitoplazmik sarmal-sarmal alanı tarafından kontrol edilir. Kapalı durumdan geçiş her iki VSD'deki açık durumun işbirliği içinde meydana geldiği bilinmektedir; ancak altta yatan mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Alt birimler arası arayüzler allosterik süreçlerde anahtar rol oynar; ancak bu tür arayüzler açık Hv1 kanallarında tanımlanmamıştır. Burada 2-guanidinotiyazol türevlerinin iki Hv1 VSD'yi işbirlikçi bir şekilde bloke ettiğini ve bu bileşiklerden birini açık alt birimler arasındaki allosterik bağlanma için bir prob olarak kullandığını gösterdik. VSD'nin ilk transmembran fragmanının ucu, bağlanma bölgeleri arasındaki bağlanmaya aracılık eden bir alt birimler arası arayüz oluştururken sarmal-sarmal alanı bu sürece doğrudan dahil değildir. Ayrıca kanalın proton seçici filtresinin bloker bağlama işbirliğini kontrol ettiğine dair güçlü kanıtlar bulduk. . Voltaj kapılı proton kanalları, fitoplanktondan insanlara kadar çeşitli organizmalarda önemli roller oynar.1. Çoğu hücrede, bu kanallar, proton zarından proton akışına aracılık eder ve NADPH oksidazın aktivitesini düzenler. İnsanlarda bilinen tek voltaj kapılı proton kanalı HVCN1 geninin ürünü olan Hv1'dir2,3. Hv1'in (diğer adıyla VSOP) B hücresi çoğalmasında4, doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından reaktif oksijen türlerinin üretiminde5,6,7,8, sperm hücresinde rol oynadığı gösterilmiştir. solunum yolu yüzey sıvısının hareketliliği9 ve pH regülasyonu10. Bu kanal, B hücreli maligniteler4,11 ve meme ve kolorektal kanserler12,13 gibi birçok kanser türünde Aşırı Eksprese edilmiştir. Aşırı Hv1 aktivitesinin kanser hücrelerinin metastatik potansiyelini arttırdığı bulunmuştur11,12. Beyinde Hv1 eksprese edilir Mikroglia tarafından aktive edilir ve aktivitesinin iskemik felç modellerinde beyin hasarını şiddetlendirdiği gösterilmiştir. Hv1 proteini, S1 ila S414 olarak adlandırılan dört transmembran segmentinden oluşan bir voltaj algılama alanı (VSD) içerir. VSD, voltaj kapılı Na+, K+ ve Ca2+ kanallarının ve CiVSP gibi voltaja duyarlı fosfatazların karşılık gelen alanlarına benzer. Ciona gutis15. Bu diğer proteinlerde, S4'ün C terminali bir efektör modüle, gözenek alanına veya enzime bağlanır. Hv1'de S4, zarın sitoplazmik tarafında yer alan sarmal-sarmal alanına (CCD) bağlanır. .Kanal, her biri kapılı bir proton geçirgenlik yolu içeren iki VSD'den oluşan dimerik bir komplekstir16,17,18. Bu iki Hv1 alt biriminin işbirliği içinde açıldığı bulunmuştur19,20,21,22, bu da allosterik bağlanma ve alt birimler arası etkileşimlerin rol oynadığını düşündürmektedir. geçitleme sürecinde önemli bir rol. Sarmal bobin alanı içindeki alt birimler arasındaki arayüz iyi tanımlanmıştır çünkü iki izole alanın kristal yapıları mevcuttur22,23. Öte yandan, membran içindeki VSD'ler arasındaki arayüz iyi tanımlanmamıştır. iyi anlaşılmıştır. Hv1-CiVSP kimerik proteininin kristal yapısı, bu arayüz hakkında bilgi sağlamaz çünkü kristalize kanal kompleksinin trimerik organizasyonu, doğal Hv1 CCD'nin, maya lösin fermuarı GCN424 ile değiştirilmesinden kaynaklanabilir. Hv1 kanalının alt birim organizasyonuna ilişkin yakın zamanda yapılan bir çalışma, iki S4 sarmalının, ikincil yapıda ciddi bir bozulma olmadan CCD'ye geçiş yaptığı ve bunun, membrandan başlayıp sitoplazmaya uzanan uzun sarmallara yol açtığı sonucuna varmıştır. Sistein çapraz bağlanma analizine dayanarak, bu çalışma Hv1 VSD'lerin S4 segmenti boyunca birbirleriyle temas ettiğini öne sürmektedir. Ancak diğer çalışmalar VSD'ler arasında alternatif arayüzler önermiştir. Bu arayüzler S1 segmentleri 17, 21, 26 ve S2 segmenti 21'in dış uçlarını içerir. Çatışmanın olası bir nedeni Bu çalışmaların sonuçları, VSD'ler arasındaki allosterik eşleşmenin, kapalı ve açık duruma bağlı olan geçitleme işlemiyle ilişkili olarak incelendiği ve VSD'ler arasındaki arayüzün, konformasyondaki farklı durum değişikliklerine göre değişebileceğidir. Burada, 2-guanidinotiazolün, iki açık VSD'ye sinerjistik olarak bağlanarak Hv1 kanallarını inhibe ettiğini bulduk ve açık durumda alt birimler arasındaki etkileşimi araştırmak için bileşiklerden biri olan 2-guanidinobenzotiyazol'ü (GBTA) kullandık. arayüz. GBTA bağlanma eğrisinin, bir inhibitörün bir alt birime bağlanmasının, bitişik alt birimin bağlanma afinitesinde bir artışa yol açtığı niceliksel bir model ile iyi bir şekilde tanımlanabileceğini bulduk. Ayrıca D112 kalıntılarının, seçicilik filtreleri için olduğunu da bulduk. Kanal 27, 28 ve guanidin türevi bağlanma bölgesinin bir kısmı 29, GBTA bağlanma işbirliğini kontrol eder. CCD'nin S4 segmentinden ayrıldığı Hv1 dimerinde ortak bağlanmanın korunduğunu gösterdik; bu, CCD'deki alt birimler arası arayüzün doğrudan ayrılmadığını öne sürüyor. GBTA bağlanma bölgeleri arasında allosterik bağlanmaya aracılık eder. Buna karşılık, S1 fragmanının alt birimler arasındaki arayüzün bir parçası olduğunu bulduk ve izin vermek için S4 sarmalının hücre dışı ucu dimerin merkezinden uzakta olacak şekilde bitişik VSD'lerin bir düzenlemesini öneriyoruz. S1 parçasının açık durumda olması. Hv1'in küçük moleküllü inhibitörleri antikanser ilaçları ve nöroprotektif ajanlar olarak faydalıdır. Ancak bugüne kadar çok az bileşik kanalı inhibe edebilmiştir30,31,32,33. Bunlar arasında 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, Şekil 1'deki bileşik [1]) .1a) ve türevlerinin, VSD29,32'nin protonların kanaldan geçişini bloke ettiği bulunmuştur. Bu tür bileşiklerin bağlanmasının, iki açık alt ünitede bağımsız olarak meydana geldiği düşünülmektedir. 2-guanidinobenzotiyazol (GBTA, Şekil 1a'daki bileşik [2]) daha önce 200 μM konsantrasyonda test edildiğinde Hv1'i neredeyse 2GBI kadar etkili bir şekilde inhibe ettiği gösterilmiştir (Şekil 1b). Diğer tiyazol türevlerini inceledik ve bazılarının kanalı GBTA'ya benzer veya daha büyük bir potansiyele sahip inhibe ettiğini bulduk (Şekil 1 ve Ek). metin). Dört tiazol türevinin (GBTA ve bileşikler [3], [6] ve [11], Şekil 1c) konsantrasyon tepki eğrilerini belirledik ve bunların 2GBI'ninkinden daha dik olduğunu bulduk. Hill katsayıları (h) tiyazol türevlerinin oranı 1.109 ± 0.040 ila 1.306 ± 0.033 arasında değişmektedir (Şekil 1). Şekil 1c ve Ek Şekil 1). Buna karşılık, 2GBI için Hill katsayısı 0,975 ± 0,024 idi. bağlanma bölgesi29,32 olduğunda, bir tiyazol türevinin bir alt birime bağlanmasının, ikinci bir inhibitör molekülünün bitişik alt birime bağlanmasını artırabileceği sonucuna vardık. GBTA, en yüksek Hill katsayısına sahip test bileşiğiydi. Bu nedenle, bu bileşiği, bağlama sinerjisinin mekanizmasını daha fazla araştırdılar ve 2GBI'yi referans negatif kontrol olarak kullandılar. (a) Test bileşikleri: [1] Referans Hv1 inhibitörü 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiazol (GBTA), [3](5-triflorometil-1,3-benzotiyazol-2-il)guanidin, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il)guanidin, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiyazol-2-il)guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilik asit etil ester, [9] 2-guanidino-4-metil Etil-1,3-tiyazol-5-karboksilat, [10 ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil asetat, [11]1-[4-(4-Klorofenil)-1,3-tiyazol-2-il]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiyazol-2-il]guanidin.(b) İnsan Hv1 aktivitesinin belirtilen guanidinotiazoller ve referans bileşiği 2GBI (mavi-yeşil çubuklar) ile inhibisyonu .Hv1 proton akımları, -80 mV ila +120 mV tutma potansiyelinden depolarizasyona yanıt olarak Xenopus oositlerinin iç-dış plaklarında ölçülmüştür. Her inhibitör, banyoya 200 μM konsantrasyonunda eklenmiştir.pHi = PHo = 6,0 .Veriler ortalama±SEM'dir (n≥4).(c) İnsan Hv1'in [2], [3], [6] ve [11] bileşikleri tarafından konsantrasyona bağlı inhibisyonu. Her nokta, 3'ün ortalama inhibisyonunu ± SD'sini temsil eder. 15 ölçüme kadar. Çizgi, Ek Tablo 1'de bildirilen görünür Kd değerlerini elde etmek için kullanılan bir Hill uyumudur. Tepe katsayıları, Ek Şekil 1'de bildirilen uyumlardan belirlenmiştir: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h(3) = 1,25 ± 0,07, h(6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (Yöntemlere bakınız). (a,b) 2GBI ve GBTA Bileşikleri dimerik ve monomerik Hv1'i konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe etti. Her nokta, 3 ila 8 ölçümün ortalama inhibisyon ± SD'sini temsil eder ve eğri bir Hill uyumudur. Hill katsayıları (h) şekilde gösterilmiştir ek histogramlar, Ek Şekil 3 ve 4'te bildirilen uyumlardan belirlenmiştir. (a)'da gösterilen GBTA'nın konsantrasyon tepkisi, Şekil 1c'deki ile aynıdır. Görünür Kd değerleri için Ek Tablo 1'e bakınız. (c) GBTA'nın dimerik Hv1'e ortak bağlanması. Düz siyah çizgi, (d)'de gösterilen bağlanma modelini açıklayan denklem (6) ile deneysel verilere uyumu temsil eder. Sub 1 ve Sub 2 etiketli kesikli çizgiler, bimoleküler ilişkiyi temsil eder. -sırasıyla birinci ve ikinci bağlanma olaylarının ayrışma denge eğrileri (Alt 1: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 μM; Alt 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 μM ).(d) Hv1 bloğunun önerilen mekanizmasının şematik diyagramı. GBTA durumunda, bir açık alt birime bağlanma, bitişik açık alt birimin afinitesini arttırır (Kd2 GBTA bağlanması için Hill katsayısının Hv1 dimerinde 1'den yüksek olması ve monomerik kanalda ~1 olması (Şekil 2b) bulgusu, iki alt birimdeki bağlanma bölgeleri arasındaki allosterik etkileşimlerin varlığıyla tutarlıdır. bu durumda, engelleyicinin bir alt birime bağlandığı dimere GBTA bağlanmasının Hill katsayısı ~1 olmalıdır. Bu öngörüyü, F150A'nın afinitesinin olduğu Hv1 F150A-WT bağlantılı dimerde (Şekil 4a) test ettik. GBTA için alt birim, WT alt birimininkinden 2 kat daha yüksekti (Şekil 1c ve 3d). Daha sonra, 2 μM GBTA bazal konsantrasyonunda WT alt biriminin inhibisyonu için konsantrasyon-tepki eğrilerini ölçtük. blokerin F150A alt ünitesinin yaklaşık %99'unu ve WT alt ünitesinin Şekil 4c), GBTA bağlanma işbirliğinin, alanlar arasındaki alt birim bağlanma eşleşmesinden ziyade, bitişik alt birimlerdeki bağlanma bölgeleri arasındaki allosterik bağlanmadan kaynaklandığını doğrulamaktadır. (a) Bloke edici yarı kanalı ({F150A}b-WT/BAO*) oluşturmak için kullanılan F150A-WT bağlantı dimerinin şematik diyagramı. Beyaz elmaslar mutasyonun yerini gösterir. BAO* ve BA*B* durumlarında, F150A alt ünitesinin afinitesinin WT alt ünitesinin afinitesinden daha yüksek olması bekleniyor.(b) F150A-WT kanallarından gelen proton akımları, membran potansiyelindeki −80 mV ila +120 mV arasındaki değişikliklere yanıt olarak ölçülmüştür.pHi = pHo = 6,0 .Gri izler, inhibitör yokluğunda ölçülen akımları temsil eder. Siyah iz (kontrol), 2 μM GBTA ilavesinden sonra ölçülen akımı temsil eder. Bu konsantrasyonda, WT alt birimi önemli ölçüde inhibe edilmezken, F150A alt birimi neredeyse tamamen GBTA'ya bağlanmıştır. ({F150A}b-WT).GBTA konsantrasyonundaki daha fazla artış, WT alt ünitesinin bloke edilmesiyle sonuçlandı (turuncu ve kırmızı izler).(c) {F150A}b-WT dimerinin konsantrasyona bağlı inhibisyonu (önceden bağlı inhibitör) F150A alt birimi). Her nokta, 3 ila 7 ölçümün ortalama inhibisyonunu ± SD'sini temsil eder. Eğriler, Ek Tablo 1'de bildirilen görünür Kd değerlerini elde etmek için kullanılan Hill uyumlarıydı. Ek histogramlarda gösterilen Hill katsayıları, Ek Şekil 3 ve 4'te bildirilen uyumlardan belirlendi. Hv1 WT'nin h değerleri, kesikli çizgilerle gösterilmiştir. Yıldız işaretleri, WT dimer Hv1 ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir (p 0.05) bir azalma bulduk (Şekil 5c). iki alt birim birlikte önemlidir, ancak CCD, GBTA bağlanma bölgeleri arasındaki alt birimler arası allosterik bağlanmaya doğrudan aracılık etmez. (a) Sitoplazmik sarmal-sarmal alanın (mavi oklar) aracılık ettiği alt birimler arası eşleşmeyi bozmak için tasarlanmış S4'ün iç ucunda bir triglisin mutasyonuna sahip Hv1 dimerinin şematik diyagramı. (b) Hv1 dimerlerinin ve ligasyon dimerlerinin şematik gösterimi alt birimler (mavi oklar) arasındaki bağlanmada yer alan S1 parçalarını test etmek için tasarlanmış belirtilen mutasyonlar. (c – h) 2GBI (mavi) ve GBTA (koyu kırmızı), belirtilen yapıları konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe eder. Her nokta, ortalama inhibisyonu temsil eder ± 3 ila 10 ölçümün SD'si. Eğri, görünen Kd değerlerini elde etmek için kullanılan bir Hill uyumuydu (bkz. Ek Tablo 1). Enterpolasyonlu histogramlardaki Hill katsayıları, Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi belirlendi (bkz. Ek Şekil 3 ve 4). Referans h değerleri için Hv1 WT kesikli çizgiler olarak gösterilmiştir. Yıldız işaretleri, mutant ve WT pasajları arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir (p 0,05, Şekil 5d,i) ). Öte yandan, D123A mutasyonu, GBTA'nın Hill katsayısını önemli ölçüde azalttı (p 0,05/14). Her iki alt birimdeki 123. konumdaki yükün nötrleştirilmesi, GBTA bağlanma işbirlikçiliğinde güçlü bir değişiklikle sonuçlandığından, her iki alt birimdeki yükün tersine çevrilmesi yalnızca küçük bir etkiye sahipken, analizi, yükün ters çevrilme kanalına sahip yalnızca bir alt birimi içerecek şekilde genişlettik. C-terminal alt ünitesinde D123R ikamesi ile Hv1 bağlantılı dimerler üretti (Şekil 5b) ve GBTA ve 2GBI ile konsantrasyon tepkisi inhibisyonunu ölçtüler. GBTA'nın WT-D123R kanallarına bağlanmasının Hill katsayısının bundan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk. vahşi tip Hv1'in (p 0.05). Ayrıca βME yokluğunda, D112E I127C Hv1 dimerine bağlanan GBTA'nın Hill katsayısının, indirgeyici ajanların varlığında ölçülenden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk (Şekil 6e ve Ek Şekil 4), bu da D112E mutasyonunun sistein 127'nin çapraz bağlanmasından kaynaklanan GBTA bağlanma işbirliğindeki artışı ortadan kaldırmadı. 2GBI'nin D112E, I127C Hv1 dimerlerine bağlanmasının Hill katsayısı da D112E mutasyonundan önemli ölçüde etkilenmedi (Şekil 1).6d ve Ek Şek. 3). Birlikte ele alındığında bu bulgular, GBTA bağlanmasının, çekici elektrostatik etkileşimler yoluyla veya ikame edilmiş sisteinler arasında kovalent bağların oluşması yoluyla bitişik Hv1 alt birimlerindeki S1 fragmanlarının dış uçları arasındaki etkileşimle güçlendirildiğini göstermektedir. Bölgeler arasındaki allosterik bağlanma artar ve bağlanma işbirliğiyle sonuçlanır. Çekici elektrostatik etkileşimlerin işbirliği üzerindeki etkisi D112E mutasyonu ile ortadan kaldırılabilirken, kovalent bağların etkisi kaldırılamaz. Guanidin türevlerini Hv1 kanallarına bağlamak için mevcut kimyasal alanı araştırdığımızda, GBTA gibi 2-guanidinotiazollerin, 2-guanidinobenzimidazollerden daha dik bir konsantrasyon bağımlılığına sahip olduğunu bulduk (Şekil 1c). Her iki dimerik kanala bağlanan GBTA'nın Hill katsayısı analizi ve monomerik kanallara (Şekil 2a,b) ve bir alt birimin inhibitöre önceden bağlandığı dimerik kanala (Şekil 4), Hv1'in GBTA tarafından inhibisyonunun, eylemin sinerjistik bir süreç olduğu sonucuna varmamıza yol açtı ve iki alt birimdeki bileşiklerin bağlanma bölgeleri allosterik olarak bağlanmıştır. İlgili bileşik 2GBI32 için daha önce gösterildiği gibi, GBTA'nın açık kanala bağlandığının keşfi, allosterik bağlanmanın spesifik olarak açık durumda değerlendirilebileceğini göstermektedir. İşbirliğine dayalı bağlanma modelimiz Hv1'in GBTA tarafından inhibisyonunu niceliksel olarak tanımlayabildi (Şekil 2c) ve 2GBI ve GBTA'nın, membran repolarizasyonundan sonra kanal kuyruğu akımlarının bozulması üzerindeki farklı etkilerini açıklayabildi; bu, bağlanma sürecine ilişkin yorumumuzu desteklemektedir. İki bağlanma bölgesine sahip bir allosterik proteinde elde edilebilen maksimum tepe katsayısı (HV1 gibi) 2'dir. HV1 vahşi tipini 1.31 katsayısıyla bağlamak için GBTA'yı ölçtük, bu da HV1 i127c'de 1.88'e yükseldi. Sinerjistik serbest enerji, en düşük ve en yüksek afinite alanlarının bağlanma serbest enerjileri arasındaki fark (yöntemlere bakın), HV1 vahşi tipte 1.3 kcal/mol idi. HV1 I127C durumunda. oksijenin hemoglobin en ünlü ve iyi çalışılmış örneğidir38. İnsan hemoglobin (allosterik olarak birleştirilmiş dört bağlanma bölgesine sahip bir tetramer) için, tepe katsayısı 2.5-3.0 aralıkları, değerleri 1.26 ila 3.64 arasında değişen değerler Kcal/mol, deney koşullarına bağlı olarak38. Bu, küresel enerji açısından, GBTA'nın HV1'e bağlanmasının işbirliği, iki sistemdeki farklı protein alt birimlerinin sayısı dikkate alındığında O2'nin hemoglobine bağlanmasından önemli ölçüde farklı değildir. Sinerji modelimizde, GBTA moleküllerinin bir alt birime bağlanması, bitişik alt birimin bağlanma afinitesinde bir artışa neden olur. Alt birimler arasındaki etkileşimlerdeki değişiklikler. Bu değişikliklere yanıt olarak, bitişik alt birimler bağlanma alanlarını değiştirir, bu da daha sıkı GBTA bağlanmasına neden olur. Bu işlemi sürdürürken, S1 aspartat D112, artan bağlanma afinitesi ile ilişkili bağlanma bölgesinin yeniden düzenlenmesinden sorumludur. daha önce HV1 proton permeasyon yolunun bir parçası olduğu ve seçicilik filtresi olarak hareket ettiği gösterilmiştir27,28. Sonuçlarımız, iki HV1 alt birimindeki seçicilik filtrelerinin allosterik olarak açık durumda birleştirildiğini göstermektedir. Figür 7A, GBTA bağlanma bölgesinin yaklaşık konumunu ve D112, D123, K125 ve I127 kalıntılarının yerini, HV1 VSD tabanlı bir şematik üzerinde gösterir. HV1-CIVSP Chimera'nın kristal yapısında, S1'in hücre dışı ucunu içeren allosterik kuplaj için, siyah oklarla gösterilmiştir. (A) HV1 VSD'nin şeması. HV1-CIVSP Chimera'nın kristal yapısına dayanan sarmal segmentlerin silindirik olduğu gösterilmiştir. Bu konfigürasyonda, S4 segmentinin iç ucu CCD ile birleşir (gösterilmemiştir). Sınırlı GBTA'nın öngörülen konumları gri oval olarak gösterilmiştir. Black okları, iki bitişik alt birimdeki bağlanma bölgeleri arasındaki allosterik bağlantıda yer alan yolları gösterir. İncelenen S1 kalıntılarının pozisyonları, renkli küreler ile işaretlenmiştir. (B) Düzenlenen HV1 subümlerinin şematik gösterimi Membran düzleminin hücre dışı tarafından görüldüğü gibi iki farklı dimer konfigürasyonunda. Sol panelde, dimer arayüzü, membran düzlemine dik bir eksen etrafında, 20 derece saat yönünde iki VSD'nin saat yönünde, eşlik eder. İki S4 helisinin dış uçlarının ayrılması (kesikli oklar), sağda gösterilen düzenlemeyi üretir.Bu konfigürasyonda, bitişik alt birimlerden D123 ve I127 kalıntıları birbirine yaklaşmasına izin verilir. (C) CIVSP VSD'nin şematik gösterimi 4G80 kristal yapısında bulunan dimer konfigürasyonunda. CIVSP'deki P140 pozisyonu HV1'deki D123 konumuna karşılık gelir. Sonuçlarımız, kalıntı 123 (123d/123d veya 123R/123R) arasındaki itici elektrostatik etkileşimin, açık durumda "normal" bir GBTA bağlayıcı işbirliği seviyesi ile ilişkili olduğunu ve etkileşimi itme ile çekmeye kaydırdığını göstermektedir (123d/123R) , artan işbirliği (Şekil 5G). Alanin ikamesi ile itici etkileşimin kaldırılmasının da artan işbirliğine yol açacağı beklenir. Ancak 123A/123A dimerinin işbirlikçiliğinde bir azalma gözlendi (Şekil 5e). Açıklama, hidrofobik kalıntıları bir hidrofobik tortu yerleştirmenin dengesizleştirici etkisinin, D123 tortuları arasındaki itici etkileşimlerin ortadan kaldırılması nedeniyle stabilize edici etkiyi ağır basabileceği ve bağlanma işbirlikçiliğinde genel bir azalmaya neden olabileceği.Mony ve ark.39 son zamanlarda, son zamanlarda çözücü erişiminin Ciona Gutis CI-HV1'in (insan HV1'de D123'e karşılık gelen) D171 pozisyonu aktivasyon üzerine artar, D123'ün açık durumda hidrofilik bir ortamda bulunduğu fikrini destekler. HV1 kanallarının kapısının çoklu geçişler yoluyla meydana geldiği bilinmektedir19,20,26,39,40,41.Qiu et al26, membran depolarizasyonu üzerine CI-HV1'in voltaj sensörünün, kanalı etkinleştirilen ancak yine de kapalı bırakan konformasyonel bir değişikliğe uğradığını bulmuşlardır. , ardından protonların her iki alt birim yolunda iletimi açmasına neden olan belirgin bir geçiş izledi. Voltaj sensörünün konformasyonel değişimi voltaj-kelepçe floresanı ile izlendi ve ikinci geçişin D171 pozisyonundaki mutasyon tarafından seçici olarak bozulduğu bulundu. Floresan sinyalinin bozulması, konformasyonel değişimin reaksiyon koordinatları boyunca bir noktada bitişik alt birimlerin D171 kalıntıları arasındaki elektrostatik etkileşimlerin varlığı ile tutarlıdır. ve GBTA bağlanma bölgeleri arasındaki allosterik bağlantıya aracılık eder. Fujiwara ve ark25, sitoplazmik sarmal-bobin alanının dimer arayüzünün, iki S4 helis içerecek şekilde zar içine uzandığını öne sürdü (Şekil 7B, sol panel). S4 sarmalını ve CCD'yi birbirine bağlayan bölgenin tüm VSD ve fonksiyonel analizi. Bir transmembran pH gradyanının yokluğunda, HV1 kanalları açılmak için önemli bir membran depolarizasyonu gerektirir ve sistein çapraz bağlanması, kanalın baskın olarak kapatıldığı koşullar altında meydana gelir. Bu nedenle, tespit edilen S4-S4 arayüzü muhtemelen durum dışı alt birim yapılandırmasını yansıtır. Diğer çalışmalar, S1 ve S2'nin geçitler arası etkileşimlere katılımı için kanıt bulmuştur. Kapalı durumlar, Mony ve ark. S1 geçit sırasında 39 hareket eder. Burada, açık durumda, S1 sarmalının hücre dışı uçlarının, alt birimler arasındaki allosterik bağlantıya aracılık eden doğrudan elektrostatik etkileşimleri destekleyecek kadar yakın olduğunu gösteriyoruz. ancak, iki S4 helisinin dış uçlarının ayrılması ile birleştiğinde, iki VSD alt biriminin iki VSD alt biriminin 20 ° saat yönünün tersine dönmesi, tutarlı bir S1-S1 konfigürasyonu verdi. Bulgularımızla (Şekil 7b, sağ panel). Bu yapılandırmayı açık durumdaki kanal için öneriyoruz. Civsp enziminin bir monomer olarak işlev gördüğü düşünülse de, izole edilmiş VSD'nin kristal yapısı bir dimer durumunda yakalanır. Bu dimerdeki S1 helislerinin dış uçları, uzamsal olarak birbirine yakındır ve genel konfigürasyon önerilene benzer. HV1 için (Şekil 7C). CivSP dimerinde, bitişik alt birimden en yakın kalıntı, 140 pozisyonunda prolin idi (Şekil 7C). İlginç bir şekilde, CIVSP'deki P140, HV1'de D123 pozisyonuna karşılık gelir. Ve Civsp dimerleri, bu proteinlerin VSD'lerinin, S1'in hücre dışı uçlarının etkileşime girdiği bir arayüz oluşturma konusunda içsel bir eğilime sahip olduğunu göstermektedir. HV1'in sperm hücresi aktivasyonunda temel rolünün bu kanalı erkek doğurganlığının kontrolü için çekici bir ilaç hedefi haline getirir. Aynı zamanda, Microglia'da HV1'in aktivasyonunun iskemik inme daha kötüleştiği gösterilmiştir. Büyüyen HV1 aktivitesinin daha düşük ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Meme 12 veya kolorektal kanser 13 olan hastalarda sağkalım ve B hücresi malignitelerine katkıda bulunduğu düşünülmektedir 11. Bu nedenle, HV1'i hedefleyen küçük molekül ilaçları nöroprotektif ajanlar veya antikanser terapötikler olarak kullanılabilir. Açık HV1 alt birimi, bağlanma afinitesinin artmasına neden olan HV1 kanallarını hedefleyen daha güçlü ilaçların geliştirilmesine yol açabilir. İnsan HV1'in sahaya yönelik mutajenezi standart PCR teknikleri kullanılarak gerçekleştirildi. HV1NCCIVSP yapısında, HV1'in 1-96 ve 228-273 kalıntıları CIVSP18.in tortuları ile değiştirildi. Bir alt birimin C-terminali, GGSGSGGSGSGSGSGG bağlayıcısı aracılığıyla ikinci alt birimin N terminaline bağlıdır. Çeşitli yapıları içeren pgemhe plazmidleri, NHE1 veya SPH1 kısıtlama enzimleri (New England biolabs) ve RNA sentezi ile doğrusallaştırılmıştır ve RNA sentezi ile gerçekleştirildi. T7 MMessage Mmachine Transkripsiyon Kiti (Ambion). 1-3 Elektrofizyolojik ölçümlerden 1-3 gün önce, CRNA enjekte edildi (hücre başına 50 nl, 0.3-1.5 μg/μl). RNA enjeksiyonunu takip ederek, 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl, 1 mM mgcl, 10 mM Hepes, 5 mM piruvat, 100 μg/mL gentamikin, pH 7.2 18 ° C içeren ND96 ortamında hücreler tutuldu. . 2-guanidino-benzimidazol [1], 2-guanidino-benzotiazol [2], (4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidin [5], (5-bromo-4-metil-1,3 -tiazol-2-il) guanidin) [6], etil 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilat [8], etil 2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol- 5-karboksilat [9] ve (2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il) etil asetat [10] Sigma-Aldrich'ten kaynaklandı. -(4-klorofenil) -1,3-tiazol-2-il] guanidin [11] ve 1- [4- (3,4-dimetoksifenil) -1,3- tiazol-2-il] guanidin [12] idi. Bu bileşikler ticari olarak mevcut olan en yüksek saflıktadır. 100 mm'lik bir stok çözeltisi üretmek için kuru DMSO'da çözüldüler, daha sonra istenen son konsantrasyonda kayıt çözeltisi içinde seyreltildi. en az% 99 saflık. 25 mL sulu hidroklorik asit (2.5 N) içinde 2-amino-4- (triflorometil) benzenetiol hidroklorür (1.02 g, 4.5 mmol) bir süspansiyona katı dicandiamid (380 mg, 4.5 mmol) ilave edildi ve rinasyona göre heterojen karışım ilave edildi ve Reaksiyon karışımı oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve 10N potasyum hidroksitin kademeli olarak ilave edilmesiyle nötralize edildi. Oluşturulan beyaz çökelti, soğuk su (3 x 50 mL) ile yıkandı, bir fırında kurutuldu ( 65 ° C) birkaç saat boyunca ve daha sonra beyaz bir katı (500 mg, %48) vermek için etil asetat/petrol eterden yeniden kristalleştirildi; MP 221-222 ° C (ışık 225-226 ° C) 45; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6): Δ [PPM] = 7.25 (çok geniş S, 4H), 7.40 (D, 1 H, J = 8.1 Hz), 7.73 (s, 1 saat), 7.92 (D , 1 H, J = 8.1 Hz) .13C NMR (200 MHz, DMSO-D6): Δ = 114.2 (D, J = 3.5 Hz), 117.5 (D, J = 3.5 Hz), 121.7, 124.6 (q, j = 272 Hz), 126.1 (q, j = 272 Hz) = 31.6 Hz), 134.8, 152.1, 158.4, 175.5. : 261.0419. Daha önce tarif edildiği gibi sentezlenen naftho [1,2-d] tiazol-2-amin (300 mg, 1.5 mmol), küçük bir test tüpünde bir yağ banyosunda 200 ° C'ye ısıtıldı. 300 mg (büyük fazlalık) siyanamid ve 1.0 mL Sıcak bileşiğe hidroklorik asit hızla ilave edildi ve karışım, yağ banyosunda yaklaşık 2 dakika tutuldu, bu süre zarfında suyun çoğu buharlaştı.Daksiyon karışımı daha sonra oda sıcaklığına ve sonuçta katıleştirilmiş malzemeye soğutuldu. küçük parçalara ayrıldı ve soluk sarı amorf bir katı sağlamak için su ile yıkandı. (38 mg,%10) MP 246-250 ° C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-D6, D2O): Δ [PPM] = 7.59 (T, 1 H, J = 8.2 Hz), 7.66 (T, 1 H, J = 8.3 Hz), 7.77 (D, 1 H , J = 8.6 Hz), 7.89 (D, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.02 (D, 1 H, J = 8.2 Hz), 8.35 (D, 1 H, J = 8.3 Hz) .13C NMR (150 MHz, DMSO-D6): Δ = 119.9, 122.7, 123.4, 123.6, 126.5, 127.1, 128.7, 132.1, 140.7, 169.1.hrms (ESI): M/Z hesaplanmış değer. , Bulundu: 243.0704. Proton akımları, Pclamp10 yazılımı ile bir akson digidata 1440A (moleküler cihazlar) tarafından kontrol edilen bir Axopatch 200b amplifikatörü kullanılarak farklı yapıları eksprese eden iç ve dış oosit yamalarında ölçüldü. )))) 30 mM tetraetilamonyum (TEA) mesilat, 5 mM Çay Klorür, 5 mM etilen glikol-bis (2-aminoetil) -n, n, n ', n'-tetraasetik asit (EGTA), ayarlanmış PH 6.0 Çay hidroksit ile. Tüm ölçümler 22 ± 2 ° C'de gerçekleştirildi. Pipet 1.5-4 MΩ erişim direncine sahiptir. ) ve Origin8.1 (OriginLab). Çeşitli HV1 inhibitörü konsantrasyonları ve bazı durumlarda 10 mM βME içeren çözeltiler, bir VC-6 perfüzyon valfi sistemine (Warner Instr.) Bağlı bir manifold yoluyla yerçekimi ile banyoya sokuldu. Transistör mantığı) Sinyaller. +120 mV depolarize edici darbe.GV ölçümleri daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirildi. Mevcut Çürüme 18'i düzeltmek için kullanılır 18. GV grafiği Boltzmann denklemine uyuyor: farklı kanal ve inhibitör kombinasyonları için görünür ayrışma sabitleri (KD) (Ek Tablo 1), inhibisyonun konsantrasyon bağımlılığının takılmasıyla belirlendi (ortalama %inhib değerleri) Tepe denklemi ile: [i] inhibitör I ve H konsantrasyonu tepe katsayısıdır. Tepe katsayısını hesaplamak için denklem (2) şöyle yeniden düzenlenir: