Allosterik bog'langan zond bilan ochiq Hv1 proton kanalining bo'linmalararo interfeysini so'roq qilish

Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi CSS-ni cheklangan darajada qo‘llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o‘chirib qo‘ying). doimiy qo'llab-quvvatlash, biz uslublar va JavaScript holda saytni ko'rsatadi. Hv1 kuchlanishli proton kanali ikkita kuchlanishni sezuvchi domenlardan (VSD) tashkil topgan dimerik kompleks bo'lib, ularning har biri proton o'tkazuvchanlik yo'lini o'z ichiga oladi. ikkala VSDda ochiq holat birgalikda sodir bo'lishi ma'lum; ammo, asosiy mexanizmlar haqida juda kam narsa ma'lum.Intersubirlik interfeyslari allosterik jarayonlarda asosiy rol o'ynaydi; ammo, ochiq Hv1 kanallarida bunday interfeyslar aniqlanmagan. Bu yerda biz 2-guanidinotiyazol hosilalari hamkorlikda ikkita Hv1 VSD ni blokirovka qilishini va bu birikmalardan birini ochiq subbirliklar orasidagi allosterik bog‘lanish uchun zond sifatida ishlatishini ko‘rsatamiz. Biz hujayradan tashqari VSD ning birinchi transmembran bo'lagining oxiri bog'lanish joylari o'rtasidagi bog'lanish vositachisi bo'lgan intersubirlik interfeysini hosil qiladi, o'ralgan domeni esa bu jarayonda bevosita ishtirok etmaydi. Shuningdek, biz kanalning proton-selektiv filtri blokerni bog'lovchi kooperativlikni nazorat qilishiga kuchli dalillar topdik. . Voltajga bog'langan proton kanallari fitoplanktondan tortib odamlargacha bo'lgan turli organizmlarda muhim rol o'ynaydi1.Ko'pchilik hujayralarda bu kanallar proton membranasidan proton chiqishiga vositachilik qiladi va NADPH oksidaza faolligini tartibga soladi.Odamlarda ma'lum bo'lgan yagona kuchlanishli proton kanali. HVCN1 genining mahsuli bo'lgan Hv1 bo'lib2,3. Hv1 (aka VSOP) B hujayralarining ko'payishi4, tug'ma immunitet tizimi tomonidan reaktiv kislorod turlarini ishlab chiqarish5,6,7,8, sperma hujayralarida rol o'ynashi ko'rsatilgan. harakatchanligi9 va havo yo'llari yuzasi suyuqligining pH regulyatsiyasi10. Bu kanal B-hujayra malignancies4,11 va ko'krak va yo'g'on ichak saratoni12,13.Haddan tashqari Hv1 faolligi saraton hujayralari metastatik salohiyatini oshirish uchun topilgan 11, 12 .Miyada, Hv1 ifodalangan kabi saraton turlari bir necha Overexpressed ishtirok etadi. mikroglia tomonidan va uning faoliyati ishemik insult modellarida miya shikastlanishini kuchaytirishi ko'rsatilgan. Hv1 oqsili kuchlanishni sezuvchi domenni (VSD) o'z ichiga oladi, u S1 dan S414 gacha deb ataladigan to'rtta transmembran segmentidan iborat. VSD kuchlanishga bog'langan Na+, K+ va Ca2+ kanallarining mos keladigan domenlariga va CiVSP kabi kuchlanishga sezgir fosfatazaga o'xshaydi. Ciona gutis15. Ushbu boshqa oqsillarda S4 ning C-terminallari effektor moduliga, gözenek domeniga yoki fermentga biriktirilgan. Hv1 da S4 membrananing sitoplazmatik tomonida joylashgan o'ralgan domen (CCD) bilan bog'langan. .Kanal ikkita VSD dan tashkil topgan dimerik kompleks bo'lib, ularning har biri yopilgan proton o'tkazuvchanlik yo'lini o'z ichiga oladi16,17,18. Bu ikki Hv1 subunitlari hamkorlikda ochilgani aniqlandi19,20,21,22, bu allosterik birikma va bo'linmalararo o'zaro ta'sirlar o'ynashini ko'rsatadi. gating jarayonida muhim rol o'ynaydi. O'ralgan lasan domenidagi bo'linmalar orasidagi interfeys yaxshi aniqlangan, chunki ikkita izolyatsiyalangan domenning kristalli tuzilmalari mavjud22,23. Boshqa tomondan, membrana ichidagi VSDlar orasidagi interfeys emas. yaxshi tushunilgan.Hv1-CiVSP kimerik oqsilining kristall strukturasi ushbu interfeys haqida ma'lumot bermaydi, chunki kristallangan kanal kompleksining trimerik tashkil etilishi mahalliy Hv1 CCD ning xamirturushli leysin fermuar GCN424 bilan almashtirilishi natijasida yuzaga kelishi mumkin. Hv1 kanalining subunit tashkil etilishini yaqinda o'rganish shuni ko'rsatdiki, ikkita S4 spirallari ikkilamchi tuzilishni jiddiy buzmasdan CCD ga o'tadi, buning natijasida membranadan boshlanib, sitoplazmaga chiqadigan uzun spirallar paydo bo'ladi. Sisteinning o'zaro bog'liqligi tahlili asosida, bu tadqiqot Hv1 VSD larining S4 segmenti bo‘ylab bir-biri bilan aloqa qilishini taklif qiladi. Biroq, boshqa tadqiqotlar VSDlar o‘rtasida muqobil interfeyslarni taklif qilgan. Bu interfeyslarga S1 segmentlari 17, 21, 26 va S2 segmentining tashqi uchlari 21. Qarama-qarshilikning mumkin bo‘lgan sababi. Ushbu tadqiqotlar natijalari shundan iboratki, VSDlar o'rtasidagi allosterik bog'lanish yopiq va ochiq holatlarga bog'liq bo'lgan eshik jarayoni bilan bog'liq holda tekshirildi va VSDlar orasidagi interfeys konformatsiyadagi turli holatdagi o'zgarishlarda farq qilishi mumkin. Bu erda biz 2-guanidinotiyazol Hv1 kanallarini ikkita ochiq VSDga sinergik ravishda bog'lash orqali inhibe qilishini aniqladik va ochiq holatda bo'linmalar orasidagi o'zaro ta'sirni tekshirish uchun birikmalardan biri, 2-guanidinobenzotiazol (GBTA) dan foydalandik. Biz GBTA bog'lanish egri chizig'ini miqdoriy model bilan yaxshi tasvirlash mumkinligini aniqladik, bunda inhibitorning bir bo'linma bilan bog'lanishi qo'shni bo'linmaning bog'lanish yaqinligining oshishiga olib keladi. kanal 27, 28 va guanidin lotin bog'lovchi saytning bir qismi 29 GBTA bog'lovchi kooperativligini nazorat qiladi.Biz kooperativ bog'lanish Hv1 dimerida saqlanib qolganligini ko'rsatamiz, bu erda CCD S4 segmentidan ajralib turadi, bu esa CCDdagi intersubirlik interfeysi to'g'ridan-to'g'ri emasligini ko'rsatadi. GBTA-bog'lanish joylari o'rtasidagi allosterik birikmaga vositachilik qiladi. Aksincha, biz S1 fragmenti subbirliklar orasidagi interfeysning bir qismi ekanligini aniqlaymiz va S4 spiralining hujayradan tashqari uchi dimer markazidan uzoqda joylashgan qo'shni VSDlarni joylashtirishni taklif qilamiz. S1 fragmenti ochiq holatda bo'lishi kerak. Hv1 ning kichik molekulali ingibitorlari saratonga qarshi dorilar va neyroprotektiv vositalar sifatida foydalidir. Biroq, hozirgi kunga qadar bir nechta birikmalar kanalni inhibe qila olgan30,31,32,33. Ular orasida 2-guanidinobenzimidazol (2GBI, birikma [1]-rasmda keltirilgan. 1a) va uning hosilalari kanal orqali protonlarning VSD29,32 o'tishiga to'sqinlik qilishi aniqlandi. Bunday birikmalarning bog'lanishi ikkita ochiq bo'linmada mustaqil ravishda sodir bo'ladi.2-guanidinobenzotiazol (1a-rasmdagi GBTA, birikma [2] ilgari 200 mkM konsentratsiyada sinovdan o'tkazilganda Hv1 ni deyarli 2 GBI kabi samarali inhibe qilgani ko'rsatilgan (1b-rasm). Biz boshqa tiazol hosilalarini tekshirdik va ularning ba'zilari GBTA ga qaraganda o'xshash yoki kattaroq quvvatga ega kanalni inhibe qilganligini aniqladik (1-rasm va qo'shimcha). matn).Biz to'rtta tiazol hosilalarining (GBTA va birikmalar [3], [6] va [11], 1c-rasm) kontsentratsiyaga javob egri chizig'ini aniqladik va ular 2GBIga qaraganda tikroq ekanligini aniqladik. The Hill koeffitsientlari (h) tiazol hosilalari 1,109 ± 0,040 dan 1,306 ± 0,033 gacha bo'lgan (1-rasm). 1c va qo'shimcha 1-rasm). Aksincha, 2GBI uchun Hill koeffitsienti 0,975 ± 0,024 29, 2a-rasm va qo'shimcha 1-rasm). bog'lanish joyi,29,32 biz tiazol hosilasining bitta subbirlik bilan bog'lanishi ikkinchi inhibitor molekulasining qo'shni bo'linma bilan bog'lanishini kuchaytirishi mumkin, deb o'yladik. GBTA eng yuqori Hill koeffitsientiga ega bo'lgan sinov birikmasi edi. Shuning uchun biz ushbu birikmani tanladik. yanada bog'lovchi sinergiya mexanizmini o'rganish va mos yozuvlar salbiy nazorat sifatida 2GBI ishlatiladi. (a) Sinov birikmalari: [1] Referent Hv1 inhibitori 2-guanidino-benzimidazol (2GBI).[2] 2-guanidino-benzotiyazol (GBTA), [3] (5-triflorometil-1,3-benzotiyazol-2-il) guanidin, [4] nafto[1,2-d][1, 3] Tiazol-2-il -guanidin, [5](4-metil-1,3-tiazol-2-il) guanidin, [6](5-bromo-4-metil-1,3-tiazol- 2-il) guanidin, [7] famotidin, [8] 2-guanidino-5-metil-1,3-tiazol-4-karboksilik kislota etil ester, [9] 2-guanidino-4-metil Etil-1,3-tiazol-5-karboksilat, [10] ](2-guanidino-4-metil-1,3-tiazol-5-il)etil asetat, [11]1-[4-(4-xlorofenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidin, [ 12]1-[4-(3,4-dimetoksifenil)-1,3-tiazol-2-il]guanidin.(b) Ko'rsatilgan guanidinotiyazollar va 2GBI mos yozuvlar birikmasi (ko'k-yashil chiziqlar) bilan inson Hv1 faolligini inhibe qilish .Hv1 proton oqimlari -80 mV dan +120 mV gacha bo'lgan ushlab turish potentsialidan depolarizatsiyaga javoban Xenopus oositlarining ichkaridagi plaklarida o'lchandi. Har bir inhibitor vannaga 200 mkM.pHi = pHo = 6,0 konsentratsiyasida qo'shildi. .Ma'lumotlar o'rtacha±SEM (n≥4).(c) [2], [3], [6] va [11] birikmalar tomonidan inson Hv1 ning konsentratsiyaga bog'liq inhibisyonu. Har bir nuqta o'rtacha ± SD 3 inhibisyonini bildiradi. 15 o'lchovgacha. Chiziq 1-jadvalda keltirilgan ko'rinadigan Kd qiymatlarini olish uchun ishlatiladigan tepalik moslamasidir. Tepalik koeffitsientlari 1-qo'shimcha rasmda keltirilgan moslashuvlardan aniqlandi: h(1) = 0,975 ± 0,024 h(2) = 1,306 ± 0,033, h (3) = 1,25 ± 0,07, h (6) = 1,109 ± 0,040, h (11) = 1,179 ± 0,036 (Usullarga qarang). (a,b) 2GBI va GBTA birikmalari dimerik va monomerik Hv1 ni konsentratsiyaga bog‘liq holda inhibe qildi. Har bir nuqta 3 dan 8 gacha bo‘lgan o‘rtacha ± SD inhibisyonini bildiradi va egri chiziq tepalikka mos keladi. Hill koeffitsientlari (h) da ko‘rsatilgan. Kiritilgan gistogrammalar qo'shimcha 3 va 4-rasmlarda ko'rsatilgan mosliklardan aniqlangan. (a) da ko'rsatilgan GBTA kontsentratsiyasining javobi 1c-rasmdagi bilan bir xil. Ko'rinib turgan Kd qiymatlari uchun 1-jadvalga qarang. (c) GBTA ning dimerik Hv1 ga kooperativ bog'lanishi. Qattiq qora chiziq (d) da ko'rsatilgan bog'lash modelini tavsiflovchi tenglama (6) bo'yicha eksperimental ma'lumotlarga mosligini ifodalaydi. Sub 1 va Sub 2 etiketli chiziqli chiziqlar bimolekulyar assotsiatsiyani ifodalaydi. -mos ravishda birinchi va ikkinchi bog'lanish hodisalarining dissotsiatsiya muvozanat egri chiziqlari (1-kichik: OO + B ⇄ BO*, Kd1 = 290 ± 70 mkM; Sub 2: BO* + B ⇄ B*O*, Kd2 = 29,3 ± 2,5 mM ).(d) Hv1 blokining taklif etilayotgan mexanizmining sxematik diagrammasi. GBTA holatida bitta ochiq bo'linma bilan bog'lanish qo'shni ochiq bo'linmaning yaqinligini oshiradi (Kd2 0,05) pasayishini topdik (5c-rasm), bu uning rolini saqlashdagi roliga qaramay ikkita subunit birgalikda muhim, ammo CCD GBTA bog'lanish joylari o'rtasida subbirliklararo allosterik ulanishga bevosita vositachilik qilmaydi. (a) S4 ning ichki uchida triglitsin mutatsiyasiga ega bo'lgan Hv1 dimerining sxematik diagrammasi sitoplazmatik o'ralgan domeni (ko'k o'qlar) vositachiligida bo'linmalararo ulanishni buzish uchun mo'ljallangan. (b) Hv1 dimerlari va ligatsiya dimerlarining sxematik tasviri. ko'rsatilgan mutatsiyalar, subbirliklar (ko'k o'qlar) orasidagi bog'lanishda ishtirok etuvchi S1 fragmentlarini sinash uchun mo'ljallangan. (c–h) 2GBI (ko'k) va GBTA (to'q qizil) ko'rsatilgan konstruktsiyalarni konsentratsiyaga bog'liq tarzda inhibe qiladi. Har bir nuqta o'rtacha inhibisyonni ifodalaydi. ± SD 3 dan 10 gacha o'lchovlar. Egri chiziq ko'rinadigan Kd qiymatlarini olish uchun ishlatiladigan tepalikka mos edi (qo'shimcha 1-jadvalga qarang). Interpolyatsiya qilingan gistogrammalardagi tepalik koeffitsientlari Usullar bo'limida tavsiflanganidek aniqlandi (Qo'shimcha 3 va 4-rasmlarga qarang). Ma'lumot uchun h qiymatlari Hv1 WT kesilgan chiziqlar sifatida ko'rsatilgan. Yulduzlar mutant va WT o'tishlari o'rtasidagi statistik jihatdan muhim farqlarni ko'rsatadi (p 0,05, 5d, i-rasm). ). Boshqa tomondan, D123A mutatsiyasi GBTA ning Hill koeffitsientini sezilarli darajada kamaytirdi (p 0,05/14). Ikkala bo'linmada 123-pozitsiyadagi zaryadni neytrallash GBTA-ning bog'lanish kooperativligida kuchli o'zgarishlarga olib kelganligi sababli, har ikkala bo'linmada zaryadni teskari qilish faqat kichik ta'sirga ega bo'lganligi sababli, biz tahlilni zaryadning inversiya kanaliga ega faqat bitta bo'linmani o'z ichiga olgan holda kengaytirdik. C-terminal bo'linmasida D123R o'rnini bosuvchi Hv1 bilan bog'langan dimerlarni hosil qildi (5b-rasm) va GBTA va 2GBI tomonidan konsentratsiya-javob inhibisyonunu o'lchadi.Biz GBTA-ning WT-D123R kanallariga ulanishining Hill koeffitsienti bundan sezilarli darajada yuqori ekanligini aniqladik. yovvoyi turdagi Hv1 ning (p 0.05). Shuningdek, biz bME yo'qligida D112E I127C Hv1 dimeriga GBTA bog'lanishning Hill koeffitsienti kamaytiruvchi moddalar ishtirokida o'lchanganidan sezilarli darajada yuqori ekanligini aniqladik (6e-rasm va qo'shimcha rasm. 4), bu D112E mutatsiyasini anglatadi. sistein 127 ning o'zaro bog'lanishi natijasida GBTA bog'lash kooperativligining oshishini bekor qilmadi. D112E, I127C Hv1 dimerlari bilan bog'lanishning 2GBI Hill koeffitsienti ham D112E mutatsiyasidan sezilarli ta'sir ko'rsatmadi (1-rasm).6d va qo'shimcha. 3-rasm). Birgalikda olingan bu topilmalar, GBTA ulanishi qo'shni Hv1 subbirliklaridagi S1 fragmentlarining tashqi uchlari o'rtasidagi o'zaro ta'sir orqali jozibador elektrostatik o'zaro ta'sirlar orqali yoki almashtirilgan sisteinlar o'rtasida kovalent bog'lanishlar hosil bo'lishi orqali kuchayganligini ko'rsatadi. Jozibador elektrostatik o'zaro ta'sirlarning kooperativlikka ta'siri D112E mutatsiyasi bilan bekor qilinishi mumkin bo'lsa-da, kovalent aloqalarning ta'siri mumkin emas. Guanidin hosilalarini Hv1 kanallari bilan bog'lash uchun mavjud bo'lgan kimyoviy bo'shliqni o'rganishda biz GBTA kabi 2-guanidinotiyazollar 2-guanidinobenzimidazollarga qaraganda keskinroq konsentratsiyaga bog'liqligini aniqladik (1c-rasm). va monomerik kanallar (2a,b-rasm) va bir subunit inhibitorga oldindan bog'langan dimerik kanalga (4-rasm) Hv1 ning GBTA tomonidan inhibisyonu Harakat sinergik jarayon va degan xulosaga keldi. Ikki bo'linmadagi birikmalarning bog'lanish joylari allosterik tarzda bog'langan. GBTA ning ochiq kanalga bog'lanishining kashfiyoti, ilgari tegishli birikma 2GBI32 uchun ko'rsatilgandek, allosterik bog'lanishni ochiq holatda maxsus baholash mumkinligini ko'rsatadi. Bizning kooperativ bog'lanish modelimiz HV1-ni GBTA tomonidan bir miqdorda tasvirlab berishga muvaffaq bo'ldi (2C-rasm) va GBTA-ni, membranani qayta tiklanishimizni qo'llab-quvvatlaydigan, quyruqli repocoarizatsiya qilishdan keyin 2gbi va GBTAning turli xil ta'sirini tushuntiring. Ikki funtli oqsil bilan (masalan, HV1 kabi) 1,31 ta koeffitsienti bilan "HV1" ni 1,31 ta koeffitsienti bilan "HV1" ning eng yuqori koeffitsienti bilan o'lchash mumkin bo'lgan tepalik koeffitsienti 1.31 ta koeffitsienti bilan GBTA ni o'lchash uchun 1.31 ta koeffitsienti bilan o'lchaymiz. Syergistik bo'sh energiya, HV1 I127C-larda HV1 yovvoyi va 2,7 kkal / mesitning o'zgaruvchan bepul energiyalari o'rtasidagi farq 1,3 kkal / mol. Gemoglobinga kislorod - bu birgalikda ishlov berish jarayonining eng mashhur va yaxshi o'rganilgan namunasidir. Global energetika nuqtai nazaridan, Kkal / Mop, GBTA faollik bilan bog'liq bo'lgan Gemoglobinga bog'liq bo'lgan gemoglobinga bog'liq bo'lgan gemoglobinga tayanib, ikki tizimda protein mahkumenti ko'rib chiqilishi hisobga olinadi. Syergy Modelning bitta qo'shilishiga majburiy ravishda qo'shni subunitning bog'lanishiga olib keladigan natijada, qo'shni subunitsiyaning kuchayishiga olib keladi. Biz birinchi majburiy tadbirdan kelib chiqadigan kuchlanish muhitini qayta ko'rib chiqishga olib keladi Ushbu o'zgarishlarga qo'shimcha ravishda o'zaro munosabatlardagi o'zgarishlar, qo'shni sharlar ularning bog'lanish joylarini o'zgartiradi, natijada GBTA BUPRONATT D112 ni kuchaytirish bilan bog'liq. Ilgari HV1 proton peronining bir qismi bo'lib, Tekshiruv filtri 07,28. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, HV1-ning ikki tomonlama subunitsida tanlanganlik filtrlar G11, D123, K125, K125 va I127 asosidagi JBRA, D125 va I127 asosidagi HV2, D125 va I127 asosidagi G11, D125 va I127 asosidagi HV2, D125 va I127 asosidagi joylashuvi ko'rsatilgan. HV1-CIVPSP CRESTEL tarkibida S1ning ekstrakeluluşning ekstrakpial uchini o'z ichiga olgan notekisli statsionarlik uchun lack: qora o'qlar bilan ko'rsatilgan. (a) HV1-CIVPSP Chimeraning sxematikasi - HV1-CIVPSSP Chimera-ning kristalli tuzilishiga qadar bo'lgan. Bog'langan GBTAning taxmin qilingan joylari, kulrang ovallar, ikki qo'shni burilish maydonchalari o'rtasida taqsimlash yo'llarini tasvirlab berishadi. Sadlangan S1 qoldiqlari bilan taqqoslanadigan yo'llar rangli sferalar bilan belgilangan. Membrananing ekstrakelulli tomonidan ko'rinadigan ikki xil o'lchamdagi konfiguratsiyalarda chap qanot interfeysi S4 gelixi tomonidan ikki vsd, soat yo'nalishi yo'nalishi bo'yicha bir necha soat yo'nalishi bo'yicha bir necha soat yo'nalishi bo'yicha, shuningdek, membranali samolyotga eksa. Ikki S4 Husters tashqi uchlarini ajratish (o'q uzildi o'qlarni), bu konfiguratsiya, D123 va I127-ni bir-biriga yaqinlashishga ruxsat beriladi. 4G80 kristalli tuzilishida topilgan yorug'lik konfiguratsiyasida P140 qudrati HV1da D123 holatiga to'g'ri keladi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, qoldiq 123 (123D / 123D yoki 123r / 123r) o'rtasidagi normalli "normal" ning "normal" darajasi "normal" darajalari bilan bog'liq va jalb qilingan (123D / 123r) bilan bog'liq. , Hampaniyani almashtirish bilan bog'liq bo'lgan hamkorlikni ko'paytirish kutilmoqda .Bu, 123a / 123-rasm) kooperatsiyani pasayishi kutilmoqda. Tushuntirish shundaki, gidrofilik qoldiqlarini gidrofilizmda joylashtirishning beqarorligi barqarorlashtiruvchi ta'sirni kuchaytirishi mumkin. "Ciia Gutis Ci-HV1" ning D171 pozitsiyasi (inson HV1-dagi HV1 ga muvofiq) Faollashtirish bo'yicha kuchayadi, chunki u ochiq davlatda gidrofil muhitda joylashganligi to'g'risida tushunchani qo'llab-quvvatlaydi. HV1 kanallarini jalb qilish bir nechta o'tish paytida19 20,26,41,41.41.40,41.QuU va Oltitau val26-da kanalning faollashtirilgan o'zgarishiga uchragan, ammo u hali ham yopiq bo'lgan sodiqlik o'zgarishi bilan ma'lum bo'lgan va keyinchalik aniq o'tish, kuchlanish sensorining ovoz berishiga olib keladi. Voltage sensorining o'zgarishi kuchlanishni keltirib chiqaradi va ikkinchi o'tish mutatsiya orqali D171 holatiga etkazilganligi aniqlandi. Florensent signalining notekis konformatsion o'zgarishlarning reaktsiyalari koordinatalari doirasidagi D171 d171 qoldiqlari o'rtasidagi elektrotatik o'zaro ta'sirlarning mavjudligi bilan izchildir. va GBTA majburiy joylari orasidagi mulkiy aloqa vositalari. Fujiwara va Ol25 sitoplazmatik pilema domenining xiralashgan interfeysi ikki S4 Husteratsiyasini o'z ichiga oladi (7b, chap rasm) .A Ushbu choksiz o'zaro ta'sirni o'z ichiga oladi. S4 Helix va CCD.IN-ni ulaydigan butun VSD va VSD funktsional tahlili Ochish uchun juda katta mebbranishni talab qiladi va kanal yopiq bo'lgan sharoitda. Shuning uchun S4-S4 Interfeysisi, ehtimol, shtatdagi subunit konfiguratsiyasini aks ettiradi. S1 va S2 ni o'z ichiga oppoq rangdagi konfiguratsiyani qabul qilishi mumkin bo'lgan S1 va S2 ni jalb qilish uchun dalil topildi va yopiq holatlar, moniy va boshqalar topilmalarga mos keladigan g'oya. S1 Gishans paytida 39 harakatlanadi. Bu erda biz shuni ko'rsatamizki, ochiq holatda S1 Helixning ekstrakpial uchlari, kengaytirilgan s1-s4 o'zaro ta'siri bilan dikerli konfiguratsiyani ishlab chiqaradigan to'g'ridan-to'g'ri elektrostatik ta'sirlarni qo'llab-quvvatlash uchun etarlicha yaqin. to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sir qilish uchun bir-biridan tashqari. Bizning topilmalar bilan (7B-rasm, o'ng panel). Kanal uchun kanal uchun ochiq davlatda tavsiya qilamiz. Garchi CIVP ning fermeri Monomer sifatida ishlayotgan bo'lsa-da, uning izolyatsiyalangan vsdning kristalli tuzilishi bu dikzatsiyaning asosiy holatida ushlanadi. HV1 uchun (7C-rasm) .Bu qo'shma subunning eng yaqin qoldiqlari 140 pozitsiyasiga nisbatan eng yaqin qoldiq (7C-rasm) HV1-dagi HV1-dagi HV1-dagi HV23 pozitsiyasiga mos keladi. Va CIVP Willers ushbu oqsillarning VSDS vSDlar S1ning hujayralari ta'sirini hosil qiladigan interfeysni shakllantirishga moyilligini anglatadi. Sperma hujayrali faollashtirishda HV1 ning muhim roli bu kanalni erkak unumdorligini nazorat qilish uchun jozibali giyohvand moddalarni yaratadi. Mikrg'ildor, ishemik insultdan tiklanish darajasi past 13 yoki Colorecal saraton kasalligi bilan og'rigan bemorlarda omon qolish. Ochiq HV1 oraliti, bog'lanishni kuchaytirishga olib keladi, bu HV1 kanallarini nishonga olish uchun yanada kuchli dorilar rivojlanishiga olib kelishi mumkin. Saytga yo'naltirilgan VV1ning Mutagenezi PCR texnik vositalari yordamida amalga oshirildi. HV1NCCCCIVP qurilishi, 1-96 va 228-573 yillar davomida HV1-Liboslangan Dimer, Bitta to'plamning C-Terminus GGSGGSGSGSGSGGSGGSGGGGGGGGGGGGGGGINE NE-Terminus bilan bog'liq. T7 mmesge Mmachinine transkripsiya (Amektsion) .1-3 kun oldin CRNA Xsenopus Oocitesga (0,3-1,5 mkg / mkg / mkg / mkl) yuborilgan. Ekotsitki bioscientsdan. ND96 mm, 2 mm mm, 1 mm / mm gl gl gl gl Myamicin, pH 7.2 18 ° CH . 2-Gonidino-benzimidazole [1], 2 gonidino-benzotiyozole [2], (4-metil-1,3-thioratol-2-yl) Guanidin [5-bromo-4 -metil-1,3 -Vazol-2-Yl) Guanidin, etil 2-gonidino-5-karil-1,3-thyzole-4-karboksilati [8], etil 1,3 tiyizole- 5 karboksillat [9] va (2-Gonidino-4,3-thiatol-5-yal) etil atette [7] mp biomedicalsdan olingan. - (4-xlorofenil) -1,3-thizol-2-yl] ganidin [4- dydzol-2-yl] ganidin [12] Matritsadan olingan ilmiy-konlar tijorat jihatidan eng yuqori darajada tozalangan. Ular 3 va 4 ta inspekt echimida suyultirilgan 100 mm masofadagi eritmada erigan holda, ular 3 va 4-dagi yozuv eritmasida sotilgan kamida 99% tozalik. 25 ml suvli xlorid kislotasi (2.5 n) Benzenetool gidroxloridi (2.5 mmol, 4,5 mmol) va 580 mm, 4,5 mmolyatsiyani to'xtatib turish 4 soat davomida kuchli aralashtirish bilan reaktsiya qilingan. Shaxsiy aralashmasi xona haroratiga 10n haroratga qadar sovutiladi va dastlabki suv bilan ta'minlandi (3 × 50 ml), pechda quritilgan ( 65 ° C) bir necha soat davomida, keyin oq mustahkam (500 mg, 48%) etil atette / neftdan qayta kristallanadi; MP 221-222 ° C (225-226 ° C) 45; 1H nmr (500 mhsss-d6): d [ppm] = 7.25 (juda keng, 4 h), 7.40 (d, 1 h), 7.92 (d , 1 h, j = 8.1 hz) .13C nmr (200 mhsso-d6): d = 114.2 (D, J = J = J = J = 3,5 Hz), 121.7, 124.6 (Q, J = 272 Hz), 126.1 (Q, J = 272 Hz), 134,6, 152.1, 158.4, 175.5.HRM (ESI) (ESI) (ESI) 2611.0419. Ilgari ta'riflangan kichik sinov naychasida (katta ortiqcha) (katta ortiqcha) (katta ortiqcha) neft vannasida sintho (1,2 mg, 1,5 mmol) ni tashkil etdilar 1,0 ml Con.to eng issiq birikma qo'shildi va aralash 2 daqiqa davomida aralashtirildi. kichik bo'laklarga bo'linib, rang bilan yuvilgan sariq sarg'ish rangli siyohni ta'minlash uchun suv bilan yuvilgan. (38 mg, 10%) mp 246-250 ° C; 1H nmr (500 mhssso-d6, d2o): d [ppm] = 7.59 (T, 1 H, j = 8.Z), 7.77 (D, 1 soat) , J = 8.6 hz), 7.89 (D, 1 Hz), 8.02 (d, 1 h, j = 8.Z, jm (150) .13C NMR (150 MHZ, DMSO-D6): D = 119.9, 122,7, 123,4, 128,6, 128,6, 128,6, 128,6, 128,1, 128,1, 128,1, 128,1, 128,1, 128,1, 128,1, 149,1, 149.1.FRMS (M + H) +: 243.0699 Ushbu topilgan: 243.0704. Proton oqimlari 200B (molekulyar qurilmalar) bilan Axon Digidata (molekulyar qurilmalar) bilan tekshirilgan holda o'lchanadi. ) etanesfonconcisconcisconciscon kislotasi, 30 mm tetralatyammoniya (choy) mezillate, 5 mm, n, n 'n, n' n '(Egta) (Egta) (Egta) PH 6.0. Teri gidroksidi bilan o'lchash 22 ± 2 ° C gacha o'tkazildi. Pipett 1,5 Ō dō.cast izlari filtrlanadi. ) va kelib chiqishi8.1 (Aslida). HV1 inhibitorining turli xil konsentratsiyasini o'z ichiga olgan echimlar va bir oz uzumni VC-6 perfuzori vannasi tizimiga (Warner Injution Softe) tomonidan o'tkazilgan "TTL" tomonidan o'tkazilgan MM-ga aylantirildi Transtistor mantiqiy signallari. Sigizuziyaga olib boriladigan personal pensioner (avtomatlashtirish) pipetali penetsion pensiondan foydalangan holda o'tkazildi. Pulse.GV o'lchashni o'chirib qo'ygan +120 mv natijalari -20 mV-dan +120 mV gacha bo'lgan tokchalar, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, - -20 mV-dan +120 mV gacha bo'lgan quduqlar, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, tezkor pulsni oldingisiga to'g'ri keladi 18-chi parchalanish uchun ishlatilgan .Bu GV grafikasi "Boltzman" tenglamalariga mos keladi: turli xil kanallar va inhibe 1-sonli inhibeciale-ning kontsentratsiyasining konsentratsiyasining kontsentratsiyasiga muvofiq aniqlandi (o'rtacha% inhib qiymatlari) tepalik tenglamasi bilan: qaerda [i] i inhibitorning konsentratsiyasi - bu tepalik koeffitsienti - tepalik koeffitsichisiz, tepalik koeffitsientini, tenglama (2) hisoblash